孫潺 張軒斌 趙江 代巖

肺癌屬于較為常見(jiàn)的肺原發(fā)性惡性腫瘤疾病,發(fā)病率及死亡率均比較高,對(duì)人們身心健康造成很大威脅[1]?？鼓[瘤藥物治療是臨床治療肺癌的一種主要方法[2]。然而,抗腫瘤藥物比較多,其抗腫瘤效果也不盡相同[3-4]。雷帕霉素是一種新型免疫抑制劑,早先用于肝移植中發(fā)現(xiàn)其具有良好的抗排斥作用[5]。近年來(lái),隨著雷帕霉素在臨床中的的逐步應(yīng)用,人們發(fā)現(xiàn)其也有一定的抗腫瘤特性,可以抑制肝癌[6]、鼻咽癌[7]、骨肉瘤[8]等細(xì)胞的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。但是,目前關(guān)于雷帕霉素對(duì)肺癌細(xì)胞的影響及作用機(jī)制的研究尚不多。本研究旨在通過(guò)體外培養(yǎng)人肺癌SPC-A-1細(xì)胞,分析不同濃度梯度的雷帕霉素處理SPC-A-1細(xì)胞后,對(duì)細(xì)胞增殖及凋亡產(chǎn)生的影響,并探究其可能的作用機(jī)制。

資料與方法

一、材料

人肺癌SPC-A-1細(xì)胞購(gòu)自上海弘順生物科技有限公司。胰酶購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。胎牛血清購(gòu)自鄭州九龍生物制品有限公司。雷帕霉素購(gòu)自廣州碩恒生物科技有限公司。CCK-8試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司。FITC-Annexin V/PI雙染色法細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自上海莼試生物技術(shù)有限公司。

p53、Bax、Bcl-2、GAPDH等抗體購(gòu)自廣州奕源生物科技有限公司公司。倒置顯微鏡購(gòu)自德國(guó)徠卡集團(tuán)有限公司。酶標(biāo)儀購(gòu)自北京凱奧科技發(fā)展有限公司。流式細(xì)胞儀購(gòu)自貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)(中國(guó))有限公司。

二、方法

1 CCK-8法測(cè)定SPC-A-1細(xì)胞增殖 選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SPC-A-1細(xì)胞,采用胰酶溶液將其消化成為單細(xì)胞的懸液,并將其接種在96孔板上。其中,空白對(duì)照組(雷帕霉素,0 ng/mL)和雷帕霉素組分別設(shè)置5個(gè)復(fù)孔,每個(gè)孔滴入200 μL的SPC-A-1細(xì)胞懸液,過(guò)夜,空白對(duì)照組給予換用200μL的新鮮培養(yǎng)基,雷帕霉素組分別換用200μL含有不同濃度(5 ng/mL,10 ng/mL,15 ng/mL)雷帕霉素的培養(yǎng)基,放入37℃,5%二氧化碳條件下的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)48h之后,于避光的環(huán)境中,在每孔滴入20 μL的CCK-8溶液,然后再孵育3h。采用酶標(biāo)儀測(cè)定對(duì)每孔的吸光度(波長(zhǎng)為450 nm)進(jìn)行測(cè)定。算出各組SPC-A-1細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(空白對(duì)照組吸光度值-雷帕霉素組吸光度值)/空白對(duì)照組吸光度值 ×100%。

2 FITC-Annexin V/PI雙染色法測(cè)定SPC-A-1細(xì)胞凋亡 選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SPC-A-1細(xì)胞,采用胰酶溶液將其消化成為單細(xì)胞的懸液,并將其接種在6孔培養(yǎng)板上。過(guò)夜,SPC-A-1細(xì)胞貼壁之后,空白對(duì)照組換用新鮮培養(yǎng)基,雷帕霉素組分別換用含有不同濃度(5 ng/mL,10 ng/mL,15 ng/mL)雷帕霉素的培養(yǎng)基,并再培養(yǎng)48h。采用不含EDTA的胰蛋白酶對(duì)SPC-A-1細(xì)胞進(jìn)行消化;運(yùn)用PBS溶液對(duì)SPC-A-1細(xì)胞洗滌2次,離心5 min,收集SPC-A-1細(xì)胞,并加入FITC-Annexin V/PI試劑盒混勻,于避光及室溫條件下再次孵育20 min。采用流式細(xì)胞儀測(cè)定各組SPC-A-1細(xì)胞凋亡率。

3 Western Blot法測(cè)定凋亡蛋白表達(dá)水平 選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SPC-A-1細(xì)胞,采用胰酶溶液將其消化成為單細(xì)胞的懸液,并將其接種在6孔培養(yǎng)板上。過(guò)夜,SPC-A-1細(xì)胞貼壁之后,空白對(duì)照組換用新鮮培養(yǎng)基,雷帕霉素組分別換用含有不同濃度(5 ng/mL,10 ng/mL,15 ng/mL)雷帕霉素的培養(yǎng)基,并再使用培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h。隨后,每孔滴入200μL細(xì)胞裂解液,在冰上裂解半小時(shí)之后,離心25 min后收集上清,冷藏備用。運(yùn)用BCA法實(shí)施蛋白定量操作之后,實(shí)施SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳操作,轉(zhuǎn)膜完畢,使用Western洗滌液對(duì)蛋白膜進(jìn)行漂洗2 min,滴入Western封閉液,加入一抗(p53、Bcl-2、Bax)稀釋液(1:5000),加入二抗(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的IgG抗體)稀釋液,顯影掃描。所測(cè)蛋白相對(duì)表達(dá)量=目標(biāo)蛋白條帶的灰度值/內(nèi)參β-actin的灰度值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、SPC-A-1細(xì)胞增殖的對(duì)比

5 ng/mL,10 ng/mL,15 ng/mL雷帕霉素處理后的SPC-A-1細(xì)胞增殖數(shù)較空白對(duì)照組顯著下降(P<0.05),增殖抑制率顯著上升(P<0.05),且增殖抑制率與雷帕霉素存在劑量依賴(lài)性的關(guān)系(見(jiàn)圖1、表1)。

圖1 雷帕霉素對(duì)SPC-A-1細(xì)胞增殖的抑制作用注:與對(duì)照組比較,*P<0.05

表1 各組SPC-A-1細(xì)胞增殖的對(duì)比

二、SPC-A-1細(xì)胞凋亡的對(duì)比

與空白對(duì)照組比較,5 ng/mL,10 ng/mL,15 ng/mL雷帕霉素處理組的細(xì)胞凋亡率均有顯著性上升(均P<0.05),其中15 ng/mL雷帕霉素處理組細(xì)胞凋亡率最高,其凋亡率變化存在劑量依賴(lài)性關(guān)系。隨著雷帕霉素處理濃度的升高,處于G0/G1期的細(xì)胞比例明顯上升(P<0.05),處于S期或G2/M期的細(xì)胞比例明顯下降(P<0.05),表明雷帕霉素可將SPC-A-1細(xì)胞增殖阻滯于G0/G1期(見(jiàn)表2)。

表2 SPC-A-1細(xì)胞凋亡的對(duì)比

三、SPC-A-1細(xì)胞凋亡蛋白p53、Bcl-2、Bax表達(dá)水平的對(duì)比

與空白對(duì)照組比較,5 ng/mL,10 ng/mL,15 ng/mL雷帕霉素處理SPC-A-1細(xì)胞后的p53、Bax蛋白水平上升,Bcl-2蛋白水平下降(P<0.05)(見(jiàn)圖2,圖3)。

圖2 Western Blot法測(cè)定細(xì)胞凋亡蛋白p53、Bax、Bcl-2的表達(dá)水平A:空白對(duì)照組;B:5 ng/mL 雷帕霉素;C:10 ng/mL 雷帕霉素; D:15 ng/mL雷帕霉素

圖3 細(xì)胞凋亡蛋白p53、Bax、Bcl-2的相對(duì)表達(dá)量的對(duì)比注:與空白對(duì)照組比較,*P<0.05

四、p53、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平與細(xì)胞凋亡率的相關(guān)性

取上述3板15 ng/mL雷帕霉素處理組細(xì)胞,經(jīng)15 ng/mL雷帕霉素處理72h后,15 ng/mL雷帕霉素處理組細(xì)胞p53、Bax蛋白表達(dá)水平均與細(xì)胞凋亡率呈正相關(guān)(r=0.906,P<0.05;r=0.938,P<0.05);Bcl-2蛋白表達(dá)水平與細(xì)胞凋亡率呈負(fù)相關(guān)(r=-0.712,P<0.05),表明p53、Bax蛋白能促進(jìn)SPC-A-1細(xì)胞凋亡,Bcl-2蛋白能抑制SPC-A-1細(xì)胞凋亡(見(jiàn)圖4～6)。

圖4 p53蛋白表達(dá)水平與細(xì)胞凋亡率呈正相關(guān)(r=0.906,P<0.05)

圖5 Bax蛋白表達(dá)水平與細(xì)胞凋亡率呈正相關(guān)(r=0.938,P<0.05)

圖6 Bcl-2蛋白表達(dá)水平與細(xì)胞凋亡率呈負(fù)相關(guān)(r=-0.712,P<0.05)

討 論

細(xì)胞增殖、凋亡和癌細(xì)胞死亡緊密相關(guān)[9]。Rastegar等人研究發(fā)現(xiàn)[10],雷帕霉素可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。有研究表明[11],雷帕霉素聯(lián)合奧沙利鉑具有協(xié)同效應(yīng),可以有效誘導(dǎo)HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。本研究發(fā)現(xiàn),雷帕霉素體外處理人肺癌SPC-A-1細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞的增殖具有抑制作用,對(duì)細(xì)胞凋亡具有誘導(dǎo)作用,且其作用呈劑量依賴(lài)性。此結(jié)論與?；蹚┑葓?bào)道的雷帕霉素可以抑制肺癌細(xì)胞發(fā)生增殖,誘導(dǎo)其凋亡的的研究結(jié)果基本一致[12]。

癌細(xì)胞增殖、凋亡均受到多種基因的正性調(diào)控與負(fù)性調(diào)控,其增殖、凋亡機(jī)制均較為復(fù)雜。p53抑癌基因p53屬于一種較為重要的抑癌基因,它發(fā)生突變跟人類(lèi)腫瘤密切相關(guān)[13]。Bcl-2的表達(dá)水平的高低與癌細(xì)胞存活至關(guān)重要。有研究顯示[14],Bcl-2轉(zhuǎn)錄調(diào)控與卵巢癌細(xì)胞的增殖及凋亡密切相關(guān)。Bax是一種重要的促凋亡基因。已有研究證實(shí)[15],Bax可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。本研究顯示,與對(duì)照組(雷帕霉素,0 ng/mL)比較,5 ng/mL,10 ng/mL,15 ng/mL雷帕霉素處理對(duì)SPC-A-1細(xì)胞的凋亡率上升(P<0.05),且p53與Bax蛋白水平增加(P<0.05),而B(niǎo)cl-2蛋白水平下降(P<0.05)。此外,本研究還發(fā)現(xiàn),15 ng/mL雷帕霉素處理組細(xì)胞p53、Bax蛋白表達(dá)水平均與細(xì)胞凋亡率呈正相關(guān)(r=0.906,P<0.05;r=0.938,P<0.05);Bcl-2蛋白表達(dá)水平與細(xì)胞凋亡率呈負(fù)相關(guān)(r=-0.712,P<0.05)。提示,雷帕霉素抑制人肺癌SPC-A-1細(xì)胞發(fā)生增殖并可促進(jìn)其發(fā)生凋亡的作用機(jī)制,可能與雷帕霉素可以上調(diào)p53、Bax蛋白表達(dá)水平和下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)水平相關(guān)。

綜上,本實(shí)驗(yàn)研究表明,雷帕霉素對(duì)人肺癌SPC-A-1細(xì)胞增殖具有抑制作用,在48h內(nèi)可以有效地誘導(dǎo)人肺癌SPC-A-1細(xì)胞發(fā)生凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為更好地開(kāi)發(fā)利用雷帕霉素的抗腫瘤作用提供了一定的參考依據(jù)。