范輝陽(yáng)，賴義明，周杰，陳勇明，唐晨，李凌峰，吳永鑫，郭正輝

世界范圍內(nèi)，前列腺癌發(fā)病率在男性所有惡性腫瘤中位居第二，在美國(guó)，前列腺癌（PC）發(fā)病率超過(guò)肺癌到了第一的位置，亞洲發(fā)病率遠(yuǎn)低于歐美，但是整體處于上升趨勢(shì)［1］。世界衛(wèi)生國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020 癌癥數(shù)據(jù)顯示男性癌癥新發(fā)病例中前列腺癌占比14.1%，僅次于肺癌［1］。前列腺癌早期的治療選擇廣泛，主要包括手術(shù)治療、內(nèi)分泌治療、放療和化療，且預(yù)后較好（五年生存率接近100%）［2］，前列腺癌晚期治療選擇少且效果差（五年生存率降至28%）［3-5］。對(duì)于晚期前列腺癌，其轉(zhuǎn)移病例中，骨轉(zhuǎn)移占比超過(guò)80%［6］。前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的過(guò)程涉及許多通路的調(diào)控及外部環(huán)境的改變，包括PTEN 通路，AKT 通路等，以及細(xì)胞外基質(zhì)的反應(yīng)性，腫瘤微環(huán)境，免疫微環(huán)境，腫瘤細(xì)胞代謝異常均與腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)［7］。但是缺乏具體深入的相關(guān)研究，因此，進(jìn)一步地探究前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的相關(guān)調(diào)控機(jī)制，可為臨床上治療前列腺癌提供新的理論依據(jù)。

RAI14 也稱為NORPEG，RAI13，是一種新穎的蛋白質(zhì)編碼基因，包含6 個(gè)錨蛋白重復(fù)序列和2 個(gè)線圈螺旋結(jié)構(gòu)域［8］。研究表明，RAI14 在許多人體組織中表達(dá)，其功能與細(xì)胞骨架密切相關(guān)。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)RAI14 可以在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，包括胃癌［9-11］，肺癌［12］，卵巢癌［13］和前列腺癌［14］，與腫瘤的惡性進(jìn)展呈正相關(guān)。在這些惡性腫瘤中RAI14 的高表達(dá)與腫瘤藥物的耐藥性反應(yīng)以及腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲顯著相關(guān)。

本研究擬通過(guò)生信分析，統(tǒng)計(jì)分析以及相關(guān)體外實(shí)驗(yàn)探究RAI14 在前列腺癌骨轉(zhuǎn)移中的作用以及相關(guān)通路、機(jī)制，以期找到前列腺癌進(jìn)展的作用因素以及潛在的治療靶點(diǎn)。

1 方 法

1.1 前列腺癌組織芯片和組織標(biāo)本獲取

從中國(guó)西安艾麗娜生物科技有限公司購(gòu)買含有192 例組織標(biāo)本的組織芯片（#PR1921c），其中包含160 例前列腺癌和16 例癌旁標(biāo)本。從中山大學(xué)腫瘤醫(yī)院收集103 例從2000 年至2018 年的前列腺癌石蠟包埋的組織，所有組織都是經(jīng)根治性前列腺切除術(shù)或者經(jīng)尿道前列腺電切術(shù)獲取并經(jīng)兩位病理科醫(yī)師確認(rèn)，患者組織的獲取和使用均與患者簽署知情同意書，并通過(guò)中山大學(xué)倫理委員會(huì)的審核通過(guò)。對(duì)患者隨訪的信息包括：年齡、Gleason 評(píng)分、腫瘤TNM 分期（按2014 年中國(guó)泌尿外科指南）、生存狀態(tài)等，嚴(yán)格保護(hù)患者信息和隱私。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）

結(jié)果計(jì)算：根據(jù)所獲得目標(biāo)基因和內(nèi)參GAPDH 的熒光信號(hào)值達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（CT 值），根據(jù)公式2-［（實(shí)驗(yàn)組目的基因CT—實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參CT）-（對(duì)照組目的基因CT—對(duì)照組內(nèi)參CT）］計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

本研究所使用引物序列如表1 所示（試劑盒#RR820A，Takara）。

表1 本研究所使用引物序列

1.3 細(xì)胞小干擾RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染

實(shí)驗(yàn)所使用小干擾RNA 序列（siRNA）均購(gòu)買于中國(guó)蘇州泓迅公司。細(xì)胞密度在60%左右且貼壁良好，取2個(gè)1.5 mL離心管，A管加入5 μL siRNA（10 μmol/L）和95 μL 無(wú)血清培養(yǎng)基（optimen），B 管加入3 μL Lipofectamine RNAimax（13778150，Life Technologies，美國(guó)沃爾瑟姆）和97 μL optimen（31985-070，GIBCO）；兩者混合靜置；將上述液體加入六孔板中，每孔加入800 μL optimen，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 提取RNA，用qRT-PCR 檢測(cè)轉(zhuǎn)染是否成功。（實(shí)驗(yàn)所用siRNA 序列：Si-RAI14-1：GAUGCCGUUACGGAAACAUTT；Si-RAI14-2：CACAAGAGAACAUCCCAGUTT；）

1.4 細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)

用無(wú)血清培養(yǎng)基潤(rùn)濕遷移小室（8 μm，353097，F(xiàn)alcon，中國(guó)上海）的基底膜，并將其置于有600 μL的完全培養(yǎng)基的專用24 孔板（3535040，F(xiàn)alcon）中；根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果吸取DU145 4 萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，PC3 6 萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋成200 μL 加入遷移小室上；將培養(yǎng)板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，DU145培養(yǎng)24 h 觀察結(jié)果，PC3 培養(yǎng)48 h 后觀察結(jié)果；使用4%多聚甲醛固定30 min；染色后進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)

細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)步驟同上，不同點(diǎn)在于需要用基質(zhì)膠（#354234，康寧，美國(guó)）包被遷移小室，步驟如下：將標(biāo)準(zhǔn)濃度8～11 mg/mL 的基質(zhì)膠置于冰上融化，將標(biāo)準(zhǔn)基質(zhì)膠加入預(yù)冷的無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋30 倍，將100 μL 稀釋后的基質(zhì)膠加入遷移小室里，將24 孔板放入37℃1 h。吸出培養(yǎng)板中殘余液體即完成包被。

1.5 共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

①處死八周齡裸鼠，取其肺及腿部長(zhǎng)骨，碾磨至1 mm3大??；②使用24 孔板及相應(yīng)小室，下層置入1 mL 已收集的碾磨好的肺、骨組織，上層置入20000 個(gè)用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的DU145，PC3 細(xì)胞及敲低RAI14 后的DU145 及PC3 細(xì)胞；③培養(yǎng)48 h后取出小室，棄去上層培養(yǎng)液，放入提前準(zhǔn)備好的24 孔板中，24 孔板內(nèi)加入800 μL 多聚甲醛；④固定半小時(shí)后取出小室，放入提前準(zhǔn)備好的24孔板中，24 孔板內(nèi)加入800 μL；0.1%結(jié)晶紫；⑤染色半小時(shí)后取出小室，室溫下風(fēng)干后用顯微鏡觀察記錄。

1.6 蛋白質(zhì)免疫印記（Western blot，WB）

配置SDS-PAGE 凝膠（#P0012A 碧云天）：按說(shuō)明書配制適量濃度的分離膠8 mL 和濃縮膠3 mL，蛋白樣品電泳：將制膠玻璃板固定于電泳槽中，加入電泳液，開(kāi)啟電泳裝置，待蛋白樣品到達(dá)玻璃板底部時(shí)終止電泳。電轉(zhuǎn)：，安裝電轉(zhuǎn)裝置，倒入電轉(zhuǎn)液，電轉(zhuǎn)1.5～2 h。用封閉液（P0023B，碧云天）封閉PVDF 膜1 h；用一抗4℃孵育過(guò)夜。二抗室溫慢速搖晃孵育1 h；接著用TBST 洗脫3 次，每次10 min。顯影：將發(fā)光液滴加到PVDF 膜上并置于曝光機(jī)內(nèi)進(jìn)行曝光顯影。本實(shí)驗(yàn)所用抗體如下：一抗為RAI14（Thermo Scientific 貨號(hào)PA5-57887，1∶500）二抗為山羊抗兔（cw0103s）或者山羊抗鼠（cw0102s，1∶10，000，康為世紀(jì)）

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS v.20.0（SPSS，Armonk，美國(guó)紐約）或GraphPad Prism 5.0（GraphPad，美國(guó)拉荷亞）軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。資料描述時(shí)：定量資料數(shù)據(jù)采用三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，定性資料用每種分類的例數(shù)標(biāo)書。統(tǒng)計(jì)分析時(shí)：兩組獨(dú)立樣本間使用雙邊獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；單因素多組定量資料使用單因素方差分析聯(lián)合Dunnett′s 兩兩比較的方法；兩因素的兩組或多組定量資料使用析因分析進(jìn)行比較；定量資料使用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行比較。RAI14 與患者之間的采用Kaplan-Meier 生存分析，并且使用log-rank 檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P值小于0.05 認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 通過(guò)前期研究及生信分析發(fā)現(xiàn)RAI14 與前列腺癌的進(jìn)展密切相關(guān)

通過(guò)對(duì)各臨床病理指標(biāo)與前列腺癌組織中RAI14 的表達(dá)關(guān)系的探究，我們發(fā)現(xiàn)RAI14 在病理分期分級(jí)以及格里森評(píng)分較高的前列腺癌組織中表達(dá)明顯上升，而與年齡、臨床分期、人種等因素?zé)o明顯關(guān)聯(lián)，這提示我們RAI14 可能可以作為一個(gè)評(píng)判前列腺癌進(jìn)展的優(yōu)秀標(biāo)記物，并且在各年齡段及各人種均適用（見(jiàn)表2）。

表2 各臨床病理指標(biāo)與前列腺癌組織中RAI14 的表達(dá)關(guān)系

我們對(duì)公共數(shù)據(jù)庫(kù)中前列腺癌原位癌與癌旁組織、前列腺癌原位癌與前列腺癌骨轉(zhuǎn)移灶、前列腺癌骨轉(zhuǎn)移灶與癌旁組織的差異表達(dá)基因進(jìn)行取交集（圖1），發(fā)現(xiàn)RAI14、ZC3H15、LAMC1、THBS2、HOXC6、POSTN、LUM、COL4A1、PLOD2、NAA15 等基因在前列腺癌骨轉(zhuǎn)移灶中表達(dá)量明顯上升。而通過(guò)對(duì)上述基因進(jìn)行生信分析及文獻(xiàn)調(diào)研后，發(fā)現(xiàn)RAI14可能是調(diào)控的前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的基因之一。

2.2 體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)RAI14 促進(jìn)前列腺癌的骨轉(zhuǎn)移

我們首先對(duì)RAI14 進(jìn)行生存分析，發(fā)現(xiàn)低表達(dá)RAI14 的患者無(wú)病生存率更高（P=0.019）（圖2A），之后我們對(duì)前列腺癌細(xì)胞系PC3，DU145 進(jìn)行了RAI14的本底表達(dá)測(cè)量，發(fā)現(xiàn)RAI14在PC3及DU145中均高表達(dá)（圖2B）。我們?cè)O(shè)計(jì)了5 個(gè)不同序列的小干擾RNA（siRNA）瞬時(shí)轉(zhuǎn)染DU145 和PC3 兩株前列腺癌細(xì)胞系。這些瞬轉(zhuǎn)的細(xì)胞株都會(huì)通過(guò)qPCR 和Western blot 的方法驗(yàn)證敲低和過(guò)表達(dá)RAI14 的有效性，結(jié)果顯示在DU145 和PC3 細(xì)胞系中，RAI14 的信使RNA（messenger RNA，mRNA）和蛋白水平明顯下調(diào)（圖2C）而我們最終選擇了效率更高的si-1 以及si-2 進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。隨后我們進(jìn)行了相關(guān)的功能實(shí)驗(yàn)。敲低RAI14 后的PC3，DU145 細(xì)胞系中進(jìn)行遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)敲低RAI14 后，PC3，DU145 的遷移與侵襲能力均下降（P＜0.01）（圖2D，E）。隨后我們將PC3，DU145 與肺，肝，骨的細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行共培養(yǎng)，觀察不同組織對(duì)腫瘤細(xì)胞的趨化作用，我們發(fā)現(xiàn)敲低RAI14 后，腫瘤細(xì)胞對(duì)上清的趨化作用明顯減弱（P＜0.01）（圖2F）。通過(guò)觀察常見(jiàn)的骨轉(zhuǎn)移灶-肝、肺、骨對(duì)前列腺癌腫瘤細(xì)胞的趨化作用，可以看出骨與肺對(duì)腫瘤細(xì)胞的趨化作用是明顯更強(qiáng)的，在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)行了原代共培養(yǎng)，通過(guò)解剖小鼠，將其骨（Hfob1-19）與肺（Beas-2b）組織研磨至1 mm3大小置于下層，觀察其對(duì)腫瘤細(xì)胞的趨化作用，發(fā)現(xiàn)敲低RAI14 后，腫瘤細(xì)胞的趨化作用減弱，且對(duì)骨的趨化作用的減弱明顯多于對(duì)肺的趨化作用的減弱（見(jiàn)圖2）。

圖2 體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)RAI14 促進(jìn)前列腺癌的骨轉(zhuǎn)移

2.3 RAI14 可能通過(guò)激活A(yù)KT 通路發(fā)揮作用

通過(guò)體外功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)了RAI14 對(duì)腫瘤細(xì)胞骨轉(zhuǎn)移的促進(jìn)功能后，我們進(jìn)行了相關(guān)的文獻(xiàn)檢索，發(fā)現(xiàn)RA14 在其它癌癥中可能通過(guò)AKT 信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。我們敲低RAI14 后進(jìn)行了全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，通路富集分析顯示AKT 通路被過(guò)度激活，以及一些細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)通路被激活。差異基因表達(dá)分析顯示AKT 表達(dá)在敲低RAI14 后明顯改變。（圖3A、B）之后我們敲低RAI14 后進(jìn)行WB實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)敲低RAI14 后，AKT 通路確實(shí)發(fā)生了改變，主要體現(xiàn)在AKT 蛋白表達(dá)量改變不明顯，但是pAKT 的表達(dá)量明顯下降。說(shuō)明RAI14 通過(guò)促進(jìn)AKT 的磷酸化導(dǎo)致AKT 通路的激活，進(jìn)而發(fā)揮作用并調(diào)控前列腺癌的骨轉(zhuǎn)移。（圖3C）通過(guò)繪制ROC 曲線，可以發(fā)現(xiàn)以RAI14 作為前列腺癌的生物標(biāo)記物的AUC 值大于0.5，對(duì)于預(yù)測(cè)及評(píng)估前列腺癌的進(jìn)展有一定的價(jià)值。

圖3 RAI14 可能通過(guò)激活A(yù)KT 通路發(fā)揮作用

圖4 ROC 曲線顯示，以RAI14 作為前列腺癌的生物標(biāo)記物的AUC 值大于0.5，對(duì)于預(yù)測(cè)及評(píng)估前列腺癌的進(jìn)展有一定的價(jià)值

3 結(jié) 論

RAI14（維甲酸誘導(dǎo)基因14）是一種蛋白質(zhì)編碼基因。與RAI14 相關(guān)的疾病包括心肌病、嬰兒組織細(xì)胞瘤和雙胎輸血綜合征。既往研究顯示在胞質(zhì)特化（睪丸特有的一種細(xì)胞連接）的肌動(dòng)蛋白調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。對(duì)建立精子極性和正常精子細(xì)胞粘附很重要。還可以促進(jìn)血睪丸屏障處支持細(xì)胞緊密連接的完整性。RAI14 在體內(nèi)主要通過(guò)影響細(xì)胞連接、黏附等功能來(lái)維持作用。在其他癌種研究中，有報(bào)道RAI14 可能通過(guò)AKT 通路影響腫瘤進(jìn)展并推進(jìn)骨轉(zhuǎn)移的進(jìn)程。AKT 通路在前列腺癌中過(guò)度激活可促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)腫瘤耐藥［15-17］。統(tǒng)計(jì)顯示，42%的局限性前列腺癌患者存在AKT 信號(hào)通路改變，并且所有轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者中均可檢測(cè)到AKT 通路有不同程度的激活［18-19］。我們敲低RAI14 后進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)及WB實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)敲低RAI14 導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移能力降低，并且AKT 通路被過(guò)度激活。

我們通過(guò)對(duì)臨床數(shù)據(jù)的分析，發(fā)現(xiàn)RAI14 在病理分期分級(jí)以及格里森評(píng)分較高的前列腺癌組織中表達(dá)明顯上升，而與年齡、臨床分期、人種等因素?zé)o明顯關(guān)聯(lián)，之后通過(guò)前列腺癌數(shù)據(jù)庫(kù)的篩選，找出了與前列腺癌骨轉(zhuǎn)移進(jìn)程密切相關(guān)的RAI14。并且生信分析證明RAI14 與前列腺癌進(jìn)展密切相關(guān)。我們的體外功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)了RAI14調(diào)控前列腺癌腫瘤細(xì)胞的遷移侵襲能力，并且共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示我們RAI14 不僅影響著遷移侵襲，還對(duì)不同的組織有不同的趨化趨勢(shì)，最后我們通過(guò)WB 實(shí)驗(yàn)初步探究了RAI14 的下游通路，發(fā)現(xiàn)下游的AKT 通路的磷酸化水平明顯上升，結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研中其他癌種的研究，我們考慮這可能是導(dǎo)致前列腺癌進(jìn)一步的進(jìn)展，推動(dòng)骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生的重要途徑。我們未來(lái)的工作將致力于繼續(xù)探討并驗(yàn)證RAI14 作用在AKT 的具體磷酸化位點(diǎn)以及構(gòu)建相應(yīng)的小鼠骨轉(zhuǎn)移模型，并完善體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)RAI14 可能通過(guò)磷酸化激活A(yù)KT 通路調(diào)控前列腺癌腫瘤細(xì)胞的遷移與侵襲能力，進(jìn)而推動(dòng)骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生發(fā)展。并且RAI14 本身有成為一個(gè)前列腺癌生物標(biāo)記物的潛能。