例談基于PCR的基因定點(diǎn)突變技術(shù)

朱棟棟

近年來，各地多次考查重疊延伸PCR、大引物PCR等新型PCR技術(shù)，但不少一線教師對其理解不夠透徹。除此之外，重組PCR、環(huán)狀質(zhì)粒PCR等也能對基因進(jìn)行定點(diǎn)誘變，其原理不完全相同，使用情境也各有側(cè)重。本文以基因定點(diǎn)突變技術(shù)為線索，將相關(guān)的幾種PCR技術(shù)串聯(lián)在一起，幫助一線教師拓展視野，并提供教學(xué)素材。

1 基因定點(diǎn)突變技術(shù)的研究意義

人類很早就意識到基因突變、基因重組等可遺傳變異對進(jìn)化的重要作用，但是傳統(tǒng)的基因突變和基因重組具有不定向性，極大地延長了基因向人類需求進(jìn)化的時(shí)間。轉(zhuǎn)基因技術(shù)和基因定點(diǎn)突變技術(shù)能夠分別實(shí)現(xiàn)基因定向重組和基因定向突變。同時(shí)，由于當(dāng)前科學(xué)界尚未建立能精確預(yù)測特定氨基酸殘基變化對整個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及活性影響的模型，對氨基酸定點(diǎn)突變存在一定的盲目性，所以基因定點(diǎn)突變是目前科學(xué)家進(jìn)一步了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的重要手段。

2 基于PCR的基因突變技術(shù)

基因突變?nèi)菀装l(fā)生于DNA的復(fù)制期間。早在20世紀(jì)70年代，就有科學(xué)家通過誘變引物建立了體外寡核苷酸介導(dǎo)的 DNA 突變技術(shù)。隨著 PCR 技術(shù)的興起，基因突變技術(shù)得以豐富和發(fā)展。目前，基于PCR的基因突變技術(shù)主要有兩種思路：第一種是利用TaqDNA聚合酶的缺陷，通過限制某種脫氧核苷酸的含量而引起錯(cuò)誤配對。第二種是在引物的5端引入突變堿基，或者增加或減少一個(gè)或多個(gè)堿基，通過PCR大量擴(kuò)增突變DNA。兩種思路相比較而言，第二種能更為準(zhǔn)確地實(shí)現(xiàn)基因的定點(diǎn)突變，故下文主要討論第二種思路。

3 基于PCR的基因定點(diǎn)突變技術(shù)

3.1 重疊延伸PCR

重疊延伸PCR需要設(shè)計(jì)兩對引物：上游引物a、突變引物b以及下游引物d、突變引物c。其中突變引物b和c加入了突變堿基，且具有重疊區(qū)域，如圖1所示，引物中突變堿基處用“·”表示。第一、二輪PCR時(shí)（即圖1中PCR1和PCR2）分別用引物a、b和引物c、d在兩個(gè)PCR體系中擴(kuò)增出突變堿基上游片段AB和下游片段CD。此時(shí)，AB和CD都攜帶突變堿基，但不具有完整的DNA長度。由于這兩個(gè)片段具有重疊區(qū)域，將其置于一起時(shí)能局部配對并延伸，再通過上游引物a和下游引物d進(jìn)行PCR可以擴(kuò)增出大量含有突變堿基的DNA，即AD。

與單突變引物法相比，重疊延伸PCR能將突變堿基加入至DNA的內(nèi)部。但是這種方法往往需要三輪PCR才能獲得產(chǎn)物，過程繁瑣。有學(xué)生提出如下解決方案：在上述設(shè)計(jì)基礎(chǔ)上做出改進(jìn)，將突變堿基置于兩種突變引物（即b和c）的5端的第一個(gè)堿基位置，如此突變引物b和c就不必重疊，則可以在一個(gè)試管中同時(shí)完成兩輪 PCR 反應(yīng)，再用引物 a 和 d 大量擴(kuò)增。經(jīng)思考討論后學(xué)生發(fā)現(xiàn)該方案不可行：該方法得到的上游片段AB和下游片段CD重疊區(qū)域僅有一個(gè)突變堿基，重疊延伸階段無法穩(wěn)定有效的復(fù)性，所以突變引物攜帶的錯(cuò)配堿基應(yīng)位于中央位置。

3.2 大引物PCR

由于重疊延伸PCR需要三輪PCR才能獲得大量突變DNA，多輪PCR因引物的改變要將PCR產(chǎn)物進(jìn)行試管的轉(zhuǎn)移，而這種轉(zhuǎn)移容易造成樣品遭受環(huán)境污染。有學(xué)者巧妙地設(shè)計(jì)出只需要兩輪PCR即可獲得突變DNA的方法，即大引物PCR法。

在大引物PCR反應(yīng)體系中，先加入上游引物和突變引物（圖2），以擴(kuò)增出含有突變堿基的部分DNA片段，然后以此DNA片段的一條鏈作為大引物，配合下游引物擴(kuò)增出含有突變堿基的完整DNA。

大引物PCR的巧妙之處在于摒棄了在突變堿基上下游分段、分別PCR的思路，將第一輪PCR出的產(chǎn)物作為第二輪PCR的引物，直接獲得了突變DNA。但是這種方法依舊存在試管轉(zhuǎn)移的問題。有學(xué)者提出，可以將第二輪PCR中下游引物長度設(shè)計(jì)地比第一輪上游引物長一些，這樣就可以通過適當(dāng)提高退火溫度以抑制上游引物在第二輪中與模板鏈的結(jié)合。筆者在繪制圖2時(shí)還產(chǎn)生了一個(gè)疑問： “突變引物應(yīng)更接近近端側(cè)還是遠(yuǎn)端側(cè)？”經(jīng)過思考不難得出，因?yàn)榈谝惠啍U(kuò)增產(chǎn)物作為第二輪PCR的大引物，根據(jù)引物不宜太長原則，所以應(yīng)該接近近端側(cè)。

3.3 重組PCR

對于環(huán)狀DNA，尤其是質(zhì)粒而言，重組PCR不失為一個(gè)可行的基因定點(diǎn)突變的方法。其基本思路如下：先用限制性核酸內(nèi)切酶將質(zhì)粒模板切成線性DNA（即線性化）。在一個(gè)PCR體系中用引物1和含突變堿基的引物2擴(kuò)增出帶突變堿基的DNA片段，在另一PCR體系中以與引物1、2互補(bǔ)的引物3和4擴(kuò)增出另一種帶突變堿基的DNA片段。因?yàn)閮蓚€(gè)PCR體系中選擇的引物互補(bǔ)，擴(kuò)增出來的兩種DNA的兩端具有同源序列，將其導(dǎo)入大腸桿菌體內(nèi)會發(fā)生同源重組，形成含突變堿基的環(huán)化質(zhì)粒。

這種技術(shù)巧妙地通過引物設(shè)計(jì)擴(kuò)增出具有同源序列的1/2線性化質(zhì)粒模板DNA，通過共轉(zhuǎn)化、同源重組，形成含突變堿基的突變質(zhì)粒。為什么要將質(zhì)粒模板線性化后再分別PCR呢？理論上環(huán)狀DNA可以直接PCR，但實(shí)踐表明這種方式得到的PCR產(chǎn)物中含有較多擴(kuò)增出來的質(zhì)粒模板，需要純化。而且直接以環(huán)狀DNA為模板擴(kuò)增，需要更多次數(shù)的循環(huán)。這是因?yàn)榕c線性DNA模板相比，直接以環(huán)狀DNA為模板擴(kuò)增的效率更低。

3.4 環(huán)狀質(zhì)粒PCR

科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，利用寡核苷酸介導(dǎo)的DNA突變會產(chǎn)生大量非突變DNA，主要原因是部分質(zhì)粒會逃避突變。于是學(xué)者們開發(fā)出體外選擇性破壞非突變DNA的方法，如Dpn Ⅰ酶切法。Dpn Ⅰ是一種限制性核酸內(nèi)切酶，它能識別并酶切DNA雙鏈中腺嘌呤N6位甲基化（N6-methyladenine）的GATC序列。Dpn Ⅰ識別位點(diǎn)中兩個(gè)腺嘌呤的N6位都甲基化時(shí)，呈現(xiàn)正常的酶活力，只有一個(gè)腺嘌呤的N6位甲基化時(shí)，酶切活力會降低約60倍。從大腸桿菌中分離的質(zhì)粒已在內(nèi)源性Dam甲基化酶的作用下被完全甲基化了，少數(shù)Dam缺陷型大腸桿菌可用Dam甲基化酶進(jìn)行體外甲基化，而PCR合成的DNA沒有甲基化。

如圖4 所示，在 PCR 體系中加入含突變堿基的引物和正常引物，擴(kuò)增出的 DNA 包括：一條鏈含突變堿基的 DNA（產(chǎn)物 1）、兩條鏈均含突變堿基的DNA（產(chǎn)物2）、兩條鏈均不含突變堿基的DNA（產(chǎn)物3）。利用Dpn Ⅰ選擇性地切斷兩條鏈均不含突變堿基的DNA和一條鏈含突變堿基的DNA，利用Dpn Ⅰ也可切除這種 DNA 中未甲基化的母鏈，但效率較低，所以處理時(shí)間應(yīng)相應(yīng)延長，且斷裂的 DNA 不穩(wěn)定，很容易被水解。最后將兩條鏈均含突變堿基的DNA導(dǎo)入感受態(tài)的大腸桿菌中，大腸桿菌會將其環(huán)化并大量復(fù)制。

當(dāng)然，該方法存在因正常引物擴(kuò)增出大量不含突變堿基的DNA，而且Dpn Ⅰ切除不徹底，導(dǎo)致獲得的突變DNA陽性率低的問題。據(jù)此有研究人員提出用含突變堿基的單引物進(jìn)行PCR，即單引物PCR法。主要思路如下（圖5）：先用含突變堿基的單一引物對質(zhì)粒模板進(jìn)行不對稱PCR，經(jīng)過一輪擴(kuò)增獲得了一條鏈含有突變堿基的雙鏈DNA（產(chǎn)物1）和一條置換出來的親代單鏈DNA（產(chǎn)物2）。在第二輪循環(huán)中，含突變堿基的單一引物只能和上述三條鏈中的一條鏈（即第一輪的模板鏈）配對。如此循環(huán)下去，獲得了較多的含突變堿基的單鏈DNA（產(chǎn)物3）。然后加入Dpn Ⅰ短時(shí)間處理，破壞甲基化的母鏈。最后轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，在其體內(nèi)完成雙鏈復(fù)制并環(huán)化（產(chǎn)物4）。

單引物PCR法陽性率高，足以獲得帶有目的突變的DNA。但需要注意的是，該方法對突變DNA鏈進(jìn)行線性擴(kuò)增，擴(kuò)增效率較低。目標(biāo)DNA鏈到達(dá)一定的量后可以將其導(dǎo)入大腸桿菌體內(nèi)進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增，以獲得大量突變DNA。

4 小結(jié)

以PCR為基礎(chǔ)的突變方法優(yōu)點(diǎn)很多，如突變效率高、可以任意定點(diǎn)誘變、快速簡單等。如果對需要改造蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能信息很明確，就可以用上述方法設(shè)計(jì)一系列突變體，通過重疊延伸PCR、大引物PCR、重組PCR和環(huán)狀質(zhì)粒PCR等方法構(gòu)建出定向突變體。

另外，構(gòu)建融合蛋白時(shí)，也可以采用重疊延伸PCR和重組PCR等方法。

參考文獻(xiàn)：

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