劉藝苑,劉傳敏,李新朋,康悅,陳虞超,郭生虎,李艷蕊,張錦添,劉姝,薛濤*,張波*

(1.臨沂大學(xué)醫(yī)學(xué)院,山東 臨沂 276005;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所,江蘇 南京 210014;3.寧夏農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心,寧夏 銀川 750002)

金蓮花為毛茛科植物金蓮花(TrolliuschinensisBge.)的干燥花,廣泛分布于西南、西北、華北、東北地區(qū)。該藥始見于《本草綱目拾遺》[1]且被《中國(guó)藥典》1977年版(一部)收錄[2]?，F(xiàn)代藥理研究表明,金蓮花具有抑菌、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理作用,臨床上主要用于治療感冒、發(fā)燒、慢性扁桃體炎、急性鼓膜炎、尿路感染等炎癥[3]。

金蓮花主要含黃酮類、酚酸類和生物堿類成分,其中金蓮花含黃酮類成分含量豐富,約為10%～20%,黃酮苷類結(jié)構(gòu)是金蓮花黃酮類成分的主要結(jié)構(gòu)類型,少數(shù)為黃酮醇、二氫黃酮和黃酮氧糖苷類結(jié)構(gòu)[4-6]。目前已從金蓮花中鑒定出黃酮類成分約99種,主要包括葒草苷、牡荊苷、金絲桃苷、木犀草素、槲皮素、芹菜素、鼠尾草素等[7]。其中葒草苷占總黃酮比例約10%,而牡荊苷占總黃酮比例約2%,是目前金蓮花中研究最廣泛的兩種黃酮類成分[8]。

抗菌及抗氧化活性是評(píng)價(jià)清熱解毒類中藥質(zhì)量的重要活性指標(biāo),也是發(fā)掘清熱解毒類中藥活性物質(zhì)基礎(chǔ)的重要途徑,因此本項(xiàng)研究以金蓮花黃酮類成分(總黃酮、葒草苷、牡荊苷)為研究對(duì)象,通過體外抑菌活性試驗(yàn)探索金蓮花抗菌活性及其物質(zhì)基礎(chǔ),并通過黃酮類成分的抗氧化活性初步研究其抗菌機(jī)制,該研究可為基于金蓮花的新藥開發(fā)提供參考。

1 材料和儀器

1.1 材料及試劑 金蓮花由寧夏農(nóng)林科學(xué)院提供,經(jīng)郭生虎教授鑒定為毛茛科植物金蓮花(TrolliuschinensisBge.)的干燥花;蘆丁(CAS:153-18-4,純度:98%)、葒草苷(CAS:28608-75-5,純度:98%)、牡荊苷(CAS:3681-93-4,純度:98%)標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自成都埃法生物科技有限公司;菌株大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、變異鏈球菌、鏈霉菌、紅酵母、黑曲霉、白色念珠菌等來自本實(shí)驗(yàn)室保存。

硝酸鋁、鄰苯三酚、三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)、水楊酸、FeSO4·7H2O、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)等均購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司;麥?zhǔn)媳葷峁?購(gòu)自常德比克曼生物科技有限公司。

1.2 儀器 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國(guó)IKA公司);無菌超凈臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);SILFTA型熒光酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司);UV-5500紫外分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司);FA1204N型電子分析天平(上海菁海儀器有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 金蓮花總黃酮的提取及其含量的測(cè)定

2.1.1 金蓮花中總黃酮的提取 準(zhǔn)確稱取600 g經(jīng)預(yù)處理的金蓮花,按照料液比1∶10,加入60%的乙醇,于90 ℃下回流提取兩次,每次1.5 h,趁熱過濾,合并濾液。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮液體,溫度為65 ℃,然后乙醇沉淀,靜置過夜,除去沉淀部位,取上清液,再次濃縮,冷凍干燥后即得金蓮花總黃酮。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 分別精確移取100 μg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL置于7個(gè)20 mL比色管中,并進(jìn)行編號(hào)0～7。每個(gè)比色管中補(bǔ)加60%乙醇溶液至1 mL。在每個(gè)比色管中加入1 mL 5%亞硝酸鈉溶液,搖勻,放置6 min。再加入1 mL 10%的硝酸鋁溶液,搖勻混合液,放置6 min,加入1 mol·L-1的氫氧化鈉溶液10 mL,加水至終體積20 mL,搖勻顯色,放置15 min。以0號(hào)試管為空白,光程1 cm,使用紫外分光光度計(jì),測(cè)定510 nm處的吸光度。以吸光度(A)為縱坐標(biāo),蘆丁質(zhì)量濃度(μg·mL-1)為縱坐標(biāo),采用線性回歸法計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程。

2.1.3 金蓮花總黃酮含量的測(cè)定 取30 mg樣品,用50 mL 60%的乙醇溶解,過濾。按“2.1.2”項(xiàng)下的方法處理后在510 nm處測(cè)定吸光度,并計(jì)算出其含量。

2.2 體外抑菌試驗(yàn)

2.2.1 培養(yǎng)基的配制 將M-H瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA)等滅菌后進(jìn)行澆板,每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)澆注25 mL約4 mm厚的培養(yǎng)基,待培養(yǎng)基凝固后備用。

2.2.2 菌濃度的確定 按0.5號(hào)麥?zhǔn)媳葷峁艿牟僮鞣椒?將9種待測(cè)的試驗(yàn)菌大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、變異鏈球菌、鏈霉菌、紅酵母、黑曲霉、白色念珠菌的菌濃度調(diào)整到3×108CFU·mL-1備用。

2.2.3 管碟法進(jìn)行抑菌試驗(yàn) 確定各待測(cè)樣品濃度為30 mg·mL-1。稱取一定量的金蓮花總黃酮、葒草苷、牡荊苷,用10%的二甲基亞砜(DMSO)溶解,同時(shí)細(xì)菌設(shè)1.25 mg·mL-1阿莫西林作陽性對(duì)照,真菌設(shè)2.5 mg·mL-1的伊曲康唑做陽性對(duì)照,10%的DMSO作為陰性對(duì)照。

將確定好濃度的各試驗(yàn)菌液200 μL移入凝固好的平板中,使用涂布棒涂布均勻。用鑷子夾取牛津小杯置于含菌平板上,加入待測(cè)樣品。37 ℃培養(yǎng)24～48 h,每個(gè)樣品重復(fù)3次。同時(shí)設(shè)立陽性和陰性對(duì)照。結(jié)果判斷用游標(biāo)卡尺精確量取,根據(jù)抑菌圈的直徑大小判斷該菌對(duì)藥物的敏感程度。

2.3 MIC和MBC的測(cè)定

2.3.1 混懸液的制備 經(jīng)純化鑒定后,將試驗(yàn)菌接種在液體培養(yǎng)基中,搖菌至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后,按照0.5號(hào)麥?zhǔn)媳葷峁懿僮鞣椒?將菌液濃度稀釋后調(diào)整到1.5×106CFU·mL-1,備用。吸取1 mL上述菌液加入1 mL培養(yǎng)液中,充分混勻后,即得到混懸液。

2.3.2 MIC及MBC的測(cè)定 首先,將金蓮花總黃酮、葒草苷、牡荊苷3種待測(cè)樣品分別溶解于10% DMSO溶液中。將各待測(cè)樣品進(jìn)行倍比稀釋。分別取稀釋后的各梯度樣品100 μL逐個(gè)加入96孔平板中;然后再各孔中加入100 μL混懸液,充分混勻(菌液終濃度為3.75× 105CFU·mL-1),每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行樣品,同時(shí)設(shè)立陽性和陰性對(duì)照。此時(shí)各孔中金蓮花總黃酮和葒草苷的濃度梯度分別為:2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 25 mg·mL-1;牧荊苷的濃度梯度分別為:25、12.5、6.25、3.125、1.562 5 mg·mL-1。調(diào)整后恒溫37 ℃培養(yǎng)24 h后,取出96孔板,并對(duì)各個(gè)孔進(jìn)行逐個(gè)檢查,用肉眼觀察其渾濁程度。如果某孔的培養(yǎng)液出現(xiàn)膜狀物或渾濁為“+”;無膜狀物且澄清透明為“-”。從96孔板上取MIC以上各孔100 μL,分別涂布在固體培養(yǎng)基上,在相同條件下培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)平皿中無菌生長(zhǎng)的樣品最小濃度定義為該樣品的MBC。

2.4 抗氧化能力的測(cè)定

2.4.1 羥自由基清除能力的測(cè)定 采用水楊酸法[9]測(cè)定金蓮花總黃酮、葒草苷和牡荊苷3種成分的羥基自由基清除能力。在10 mL比色管中依次加入1 mL 6 mmol·L-1FeSO4,1 mL樣品溶液,1 mL 6 mmol·L-1H2O2,混勻后室溫放置10 min,最后加入6 mmol·L-1乙醇-水楊酸,搖勻,37 ℃水浴加熱15 min后取出,于510 nm處測(cè)其吸光值。并依據(jù)式(1)進(jìn)行計(jì)算。

羥自由基清除率=[1-(As-As0)/A0]×100%

(1)

其中A0為空白對(duì)照吸光值,反應(yīng)體系中以蒸餾水代替被測(cè)樣品;As為樣品吸光值;As0為樣品本底吸光值,反應(yīng)體系中以蒸餾水代替H2O2。

2.4.2 超氧陰離子自由基清除能力的測(cè)定 采用鄰苯三酚法[10]測(cè)定金蓮花總黃酮、葒草苷和牡荊苷3種成分的超氧陰離子自由基清除能力。分別向10 mL離心管中分別依次加入0.1 mol·L-1Tris-HCl溶液4.5 mL,蒸餾水2.4 mL,不同濃度的樣品溶液1 mL,混勻,室溫反應(yīng)10 min后加入0.1 mL 10 mmol·L-1HCl終止反應(yīng),于325 nm處檢測(cè)吸光值。并依據(jù)式(2)進(jìn)行計(jì)算。

超氧陰離子清除率=[1-(As-As0)/A0]×100%

(2)

其中A0為空白對(duì)照吸光值,反應(yīng)體系中以蒸餾水代替被測(cè)樣品;As為樣品吸光值;As0為樣品本底吸光值,反應(yīng)體系中以蒸餾水代替鄰苯三酚。

2.4.3 DPPH自由基清除能力的測(cè)定 向10 mL比色管中分別加入2 mL樣品,然后加入2 mL 0.1 mmol·L-1DPPH乙醇溶液,混勻后室溫避光反應(yīng)30 min,517 nm測(cè)定吸光值。無水乙醇調(diào)零。并依據(jù)式(3)進(jìn)行計(jì)算。

DPPH清除率=[1-(As-As0)/A0]×100%

(3)

其中A0為空白對(duì)照吸光值,反應(yīng)體系中以無水乙醇代替被測(cè)樣品;As為樣品吸光值;As0為樣品本底吸光值,反應(yīng)體系中以無水乙醇代替DPPH。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 金蓮花總黃酮含量的測(cè)定 以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),吸光度為縱坐標(biāo)(Y),標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.000 6X-0.000 3,R2=0.999 3,結(jié)果表明在10～60 μg·mL-1范圍呈現(xiàn)比較好的線性關(guān)系。經(jīng)計(jì)算樣品中總黃酮的濃度為32.18 μg·mL-1,含量為64.3%。

3.2 體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果 試驗(yàn)結(jié)果表明,在30 mg·mL-1的作用濃度下,金黃色葡萄球菌對(duì)金蓮花總黃酮、葒草苷中度敏感,對(duì)牡荊苷低度敏感(見表1);變異鏈球菌對(duì)葒草苷中度敏感,對(duì)金蓮花總黃酮、牡荊苷低度敏感(見表2)。其他待測(cè)菌如傷寒沙門氏菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、鏈霉菌以及紅酵母、黑曲霉、白色念珠菌對(duì)金蓮花總黃酮、葒草苷、牡荊苷均不敏感。

表1 待測(cè)樣品對(duì)金黃色葡萄球菌的體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果

表2 待測(cè)樣品對(duì)變異鏈球菌的體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果

3.3 MIC和MBC的測(cè)定結(jié)果 金蓮花總黃酮、葒草苷和牡荊苷對(duì)變異鏈球菌MIC值分別為0.312 5、0.156 25、3.125 mg·mL-1。金蓮花總黃酮、葒草苷、牡荊苷對(duì)金黃色葡萄球菌MIC值分別為0.156 25、0.156 25、6.25 mg·mL-1。金蓮花總黃酮、葒草苷和牡荊苷對(duì)變異鏈球菌MBC值分別為1.25、0.625、12.5 mg·mL-1。金蓮花總黃酮、葒草苷、牡荊苷對(duì)金黃色葡萄球菌MBC值分別為0.625、0.625、25 mg·mL-1。結(jié)果表明,金蓮花總黃酮對(duì)變異鏈球菌和金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌和殺菌效力,其主要成分葒草苷比牡荊苷表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑菌和殺菌效力。

3.4 抗氧化能力測(cè)定結(jié)果 金蓮花總黃酮、葒草苷、牡荊苷對(duì)超氧陰離子、DPPH和羥基自由基的清除效果見表3。

由表3可知,金蓮花總黃酮、葒草苷和牡荊苷對(duì)3種自由基均表現(xiàn)出較好的清除能力,其中對(duì)超氧陰離子的清除能力,牡荊苷>葒草苷>總黃酮;對(duì)羥基自由基和DPPH的清除能力,總黃酮>葒草苷>牡荊苷。從總體來看,其主要成分葒草苷的抗氧化活性優(yōu)于牡荊苷。

表3 金蓮花總黃酮、葒草苷、牡荊苷抗氧化活性結(jié)果

4 討論

金蓮花顆粒、金蓮花膠囊等為臨床常用清熱解毒類中成藥,但其君藥金蓮花的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確。黃酮類成分是目前金蓮花研究最為廣泛且含量相對(duì)較高的一類成分,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,金蓮花總黃酮、葒草苷、牡荊苷對(duì)細(xì)菌的抑制作用要優(yōu)于真菌;對(duì)革蘭陽性細(xì)菌的抑制作用優(yōu)于革蘭陰性細(xì)菌。可能與黃酮類物質(zhì)本身所具有的酚羥基的結(jié)構(gòu)有關(guān),使其具有酚類的通性,具有類似苯酚的抑菌作用;同時(shí)黃酮類物質(zhì)可以使溶液呈弱酸性,也不利于細(xì)菌的生長(zhǎng)。

金蓮花主要抑菌對(duì)象是革蘭陽性細(xì)菌,因此推測(cè)金蓮花主要有效抑菌成分的作用部位可能在于細(xì)菌的細(xì)胞壁上。本實(shí)驗(yàn)中,葒草苷對(duì)革蘭陽性細(xì)菌變異鏈球菌和金黃色葡萄球菌均表現(xiàn)出較強(qiáng)的殺傷效力,殺菌效果明顯優(yōu)于金蓮花總黃酮和牡荊苷。

抗氧化實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),金蓮花總黃酮、葒草苷和牡荊苷對(duì)3種自由基均表現(xiàn)出一定的清除能力,但葒草苷抗氧化活性整體上優(yōu)于牡荊苷,與其抗菌效果一致,說明抗氧化可能是其潛在抗菌機(jī)制之一。本研究亦證實(shí)金蓮花黃酮類主要成分葒草苷是金蓮花清熱解毒活性的有效成分之一。