樓麗,晏堂,張?zhí)K霞,陳思雨,劉永靜

(福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,福建 福州 350122)

天冬(Radix Asparagi)為百合科植物天冬[Asparaguscochinchinensis(Lour.) Merr.]的干燥塊根,氣微,味甜、微苦,具有養(yǎng)陰潤燥,清肺生津的功效,臨床上用于肺燥干咳,頓咳痰黏,腰膝酸痛,骨蒸潮熱,內(nèi)熱消渴,熱病津傷,咽干口渴,腸燥便秘[1]。現(xiàn)代研究表明,天冬多糖是天冬的重要活性成分之一,具有降糖、增加免疫、抗炎等藥理作用[2]。因而,天冬多糖的提取制備是天冬藥材相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)和利用重要的一步,而傳統(tǒng)的水提醇沉法提取多糖,不僅耗時久且需要多次提取,操作步驟較為煩瑣。

近年來幾種新穎的提取多糖的方法涌現(xiàn),低共熔溶劑(deep eutectic solvents,DES)作為一種綠色溶劑,具有生物可降解性、高增溶作用、低毒性等優(yōu)勢,已經(jīng)被用于提取黃酮、多酚、多糖[3]。本文將其作為提取多糖的一種方法,探討DES提取多糖的可能性。

超聲波輔助法提取多糖作為新興提取方法,具有省時、高效、操作簡便無污染等優(yōu)點,酶法是利用生物酶的高效性和專一性,通過破壞植物細(xì)胞壁和提高細(xì)胞膜的通透性來加速胞內(nèi)物質(zhì)溶出,具有反應(yīng)溫和、操作簡便等優(yōu)點[4]。本文目的在于優(yōu)選出一種較為簡便易操作的方法,為天冬多糖能更好地利用奠定一定的實驗基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 XS 105 電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司);Q-500E 超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);UPR-II-5TN 超純水機(四川優(yōu)普超純科技有限公司);100～1 000 μL 移液槍(德國艾本德股份有限公司);85-2 恒溫磁力攪拌器(常州國華電器有限公司);UV-9600 紫外分光光度計(北京瑞利儀器分析有限公司);DFY-500搖擺式高速中藥粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司);Lab-1A-50E 冷凍干燥機(博醫(yī)康儀器有限公司);PB-10 PH計(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);BHS-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋(福州泰美實驗儀器有限公司);TDL-40B 離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2 試藥 天冬(北京仟草中藥飲片有限公司,批號:211124001);無水葡萄糖對照品(上海源葉生物科技有限公司,批號:S21J12I138537,含量>98%);硫酸(分析純,無錫市龍吉利化工試劑有限公司);苯酚(分析純,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);乙醇(分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司);果膠酶(上海源葉生物科技有限公司,500 U·mg-1)、纖維素酶(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)、木瓜蛋白酶(上海源葉生物科技有限公司,800 U·mg-1);氯化膽堿(分析純,上海源葉生物科技有限公司);甜菜堿、乙二醇(分析純,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);1,2-丙二醇、丙三醇、乙酰胺(分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司);1,4丁二醇、脲(分析純,西隴科學(xué)股份有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥材預(yù)處理 將天冬藥材在50 ℃干燥6 h,粉碎,過篩(80目),備用。

2.2 天冬多糖的提取方法

2.2.1 水提醇沉法 取干燥的天冬粉末約10 g,精密稱定,加入95%乙醇150 mL,70 ℃回流提取,每次提取1 h,共提取3 次,抽濾后加入蒸餾水200 mL,沸水煮提6 h,過濾,殘渣再加蒸餾水150 mL,煮提4 h,合并2 次濾液,濃縮至約20 mL,加入適量95% 乙醇,使醇沉量達80%,靜置過夜后,離心(8 000 r·min-1,10 min),將沉淀物用水復(fù)溶預(yù)凍,冷凍干燥,即得天冬粗多糖。

2.2.2 DES結(jié)合超聲提取法 DES的制備:將一定比例的氫受體與氫供體在錐形瓶中混合均勻,使用磁力攪拌器使其于80 ℃下攪拌,直至形成均一澄清的液體,冷卻,備用。

取干燥的天冬粉末約2 g,精密稱定,置錐形瓶中,按一定料液比加入DESs溶液100 mL(其中含30%水),混合均勻,恒溫超聲(功率500 W,頻率40 kHz)30 min ,待溶液冷卻至室溫,將DES天冬多糖粗提液旋蒸除水至約20 mL后,加入95%乙醇使其含量達80%,靜置過夜后,離心(8 000 r·min-1,10 min),將沉淀物用水復(fù)溶預(yù)凍,冷凍干燥,即得天冬粗多糖。

2.2.2.1 DES種類的篩選 DES結(jié)合超聲提取法中,由于醇沉在篩選DES種類中工作量較大,選擇DES天冬粗提液作為供試品溶液,測定其吸光度,以提取液中多糖含量為指標(biāo)進行DES種類的篩選,盡可能避免由于DES體系給結(jié)果帶來的偏差。結(jié)果見表1。由結(jié)果可知,氯化膽堿-脲體系具有明顯的優(yōu)勢,所以選擇這一體系作為DES提取的體系。

表1 DES體系對多糖含量的影響

2.2.2.2 DES提取條件的優(yōu)化 分別對氫鍵供體和氫鍵受體摩爾比、含水率、超聲提取時間及液料比進行了優(yōu)化,結(jié)果見圖1。

由圖可知,雖然摩爾比為1∶5時多糖含量最高,而選取摩爾比為1∶6時,DES迅速析出形成固體,1∶3、1∶4、1∶5也是一樣的情況,無法與天冬粉末混合均勻。由于考慮到后續(xù)操作的便捷性所以本試驗選取尿素-氯化膽堿摩爾比1∶2作為最佳摩爾比。超聲提取時間方面,隨著時間的增加,多糖含量有所增加但結(jié)果接近,出于節(jié)能環(huán)?？紤]選擇超聲提取時間為30 min。料液比方面,1∶50 g·mL-1時,含量最高,但此條件下由于DES用量較少,提取時吸取液體已經(jīng)有一定難度,因此選擇1∶50 g·mL-1為最佳。綜上,DES提取法的最佳條件為氯化膽堿與脲摩爾比為1∶2,含水率為20%,超聲提取時間為30 min,料液比為1∶50 g·mL-1,在此條件下,天冬多糖的提取率為37.85%±0.82%。

2.2.3 超聲輔助結(jié)合酶法 取干燥的天冬粉末約2 g,精密稱定,加入蒸餾水50 mL,調(diào)pH為4.5,混合均勻,纖維素酶添加量為0.5%,50 ℃超聲提取(功率500 W,頻率40 kHz)30 min ,95 ℃下滅酶15 min,待溶液冷卻至室溫,將天冬多糖粗提液旋蒸除水至約20 mL后,加入95%乙醇使其含量達80%,靜置過夜后,離心(8 000 r·min-1,10 min),將沉淀物用水復(fù)溶預(yù)凍,冷凍干燥,即得天冬粗多糖。

超聲輔助結(jié)合酶法提取條件優(yōu)化:分別考察酶的種類、pH值(2.5～7.5)、酶添加量(0.25%～2.5%)、料液比(1∶10～1∶70)對天冬多糖提取率的影響,結(jié)果見圖2。

圖2 超聲輔助結(jié)合酶法條件優(yōu)化

首先對酶的種類進行優(yōu)化,包括①果膠酶、②木瓜蛋白酶、③纖維素酶,其次對復(fù)合酶也進行篩選,包括④果膠酶+木瓜蛋白酶、⑤果膠酶+纖維素酶、⑥木瓜蛋白酶+纖維素酶、⑦果膠酶+纖維素酶+木瓜蛋白酶,此時控制酶添加量不變(0.5%)。⑥木瓜蛋白酶與纖維素酶所組成的復(fù)合酶在提取多糖方面具有一定的優(yōu)勢?？赡苁怯捎诶w維素酶促進天冬纖維素中多糖的溶出,并且木瓜蛋白酶通過將蛋白聚糖中的游離蛋白進行水解[5],而纖維素酶與木瓜蛋白酶之間的相互作用具有協(xié)同作用,高于它們?nèi)魏我环N單一酶的含量,因此,選擇木瓜蛋白酶與纖維素酶組成的復(fù)合酶進行后續(xù)試驗。

pH值方面,天冬多糖提取率在pH為6.5時達最大值,繼續(xù)增大pH值至7.5,提取率下降,可能是由于此時的pH造成酶活力的下降,影響天冬多糖的提取[6]。因此確定,pH值為6.5。

料液比為1∶40時多糖提取率最大,可能是由于隨著液料比的增加,可以增加溶劑對天冬多糖的擴散速率并且促進溶出。而當(dāng)料液比>1∶40時提取率下降,推測是隨著溶劑的進一步增加,酶與底物相互作用減少,細(xì)胞壁降解減慢所致[7]。因此,液料比選擇1∶40 g·mL-1。

隨著酶添加量的增加,多糖提取率總體呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,在酶添加量為1.5%時提取率最高,纖維素酶可破壞天冬的細(xì)胞壁,釋放多糖;木瓜蛋白酶可水解天冬游離的蛋白質(zhì),降低蛋白質(zhì)對天冬的結(jié)合力,促進多糖的釋放。而當(dāng)酶添加量過多時,纖維素酶和木瓜蛋白酶包裹多糖,導(dǎo)致多糖無法進入溶劑,降低提取率。因此,選擇酶添加量為1.5%。

綜上,超聲輔助結(jié)合酶法的最佳條件為木瓜蛋白酶+纖維素酶(1∶1),pH為6.5,液料比為1∶40 g·mL-1,酶添加量為1.5 %,在此條件下,提取液中天冬多糖的提取率為56.14%±2.39%。

2.3 提取方法的比較 3種提取方法所得多糖含量見表2,由表2可知,以多糖含量為指標(biāo),3種提取法中超聲輔助結(jié)合酶法具有一定優(yōu)勢,且操作簡便,省時省力。因此,本試驗選擇超聲輔助結(jié)合酶法作為天冬多糖的制備方法。

表2 3種提取法所得多糖含量

2.4 多糖含量測定及苯酚硫酸法優(yōu)化

2.4.1 溶液的配制

2.4.1.1 5%苯酚溶液的配制 先配置80% 的苯酚,即稱取80.00 g 的苯酚,加20.00 g的水使之在燒杯中溶解。再從80%的苯酚溶液中準(zhǔn)確量取6.25 mL轉(zhuǎn)移到100 mL棕色容量瓶中定容,低溫保存?zhèn)溆?每次臨用前現(xiàn)配。

2.4.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取50.53 mg 無水葡萄糖對照品,于100 mL容量瓶中用超純水定容。

2.4.1.3 供試品溶液的制備 ①水提醇沉法:取“2.2.1”項下醇沉后凍干所得天冬多糖10.00 mg,精密稱定,置25 mL容量瓶中,用蒸餾水溶解并稀釋至刻度,超聲(功率500 W,頻率40 kHz)10 min,搖勻,即得。②DES超聲輔助法:取“2.2.2”項下醇沉后凍干所得天冬多糖5.00 mg,精密稱定,置10 mL容量瓶中,用蒸餾水溶解并稀釋至刻度,超聲(功率500 W,頻率40 kHz)10 min,搖勻,即得。③超聲輔助結(jié)合酶法:取“2.2.3”項下醇沉后凍干所得天冬多糖10.00 mg,精密稱定,置100 mL容量瓶中,用蒸餾水溶解并稀釋至刻度,超聲(功率500 W,頻率40 kHz)10 min,搖勻,即得。

2.4.2 苯酚硫酸法及其優(yōu)化 根據(jù)文獻[8]并做改動,確定苯酚硫酸法取適量供試品溶液,于具塞試管中,加入濃硫酸7.0 mL,苯酚(5%)2.0 mL,密閉,于沸水浴中加熱15 min,冷卻至室溫,490 nm處測其吸光度。

采用單因素法對苯酚硫酸法進行優(yōu)化,分別考察濃硫酸用量(4.0～9.0 mL)、5%苯酚用量(0.5～3.0 mL)、加熱溫度(50～100 ℃)、加熱時間(5～30 min)、冷卻時間(室溫靜置10 min～室溫靜置60 min)、以及濃硫酸、苯酚的先后加入順序?qū)μ於嗵秋@色后吸光度的影響,平行做3次,結(jié)果見圖3。

圖3 苯酚硫酸法測含量條件優(yōu)化

根據(jù)圖3,苯酚硫酸法優(yōu)化后最佳條件為濃硫酸最佳用量為5.0 mL、苯酚最佳用量為2.5 mL、最佳加熱溫度為50 ℃、最佳加熱時間為20 min、最佳冷卻方式為室溫下靜置10 min。其中由圖3的(3)可知,當(dāng)加熱溫度為50 ℃和100 ℃時,吸光度相當(dāng),而在60～90 ℃時吸光度差別不大,且與50 ℃時相比,吸光度下降,出于節(jié)約能耗成本考慮,選擇50 ℃為最佳加熱溫度。另外,在濃硫酸與苯酚的加入順序方面,先加入濃硫酸組的吸光度A大于先加入苯酚組?？赡苁怯捎诒椒雍袕娭禄罨鶊F酚羥基,很容易與濃硫酸發(fā)生磺化反應(yīng),推測濃硫酸與糠醛衍生物競爭苯酚[9]。因此,本試驗中采用先加入濃硫酸的方法,使其充分生成糖醛衍生物,再加入苯酚,使產(chǎn)物處于相對穩(wěn)定的狀態(tài)。

苯酚硫酸法最佳工藝驗證:按上述方法進行工藝驗證,每組平行測3次。結(jié)果見表3,RSD值為1.44%,說明優(yōu)化后的該法較穩(wěn)定。

表3 苯酚硫酸法優(yōu)化后最佳工藝驗證

2.4.3 換算因子的測定 根據(jù)文獻[10],并做相應(yīng)修改:精密稱取“2.2.1”項下制備的天冬多糖 9.80 mg,配制成100 mL多糖樣品液。按照 “2.4.2”項下優(yōu)化后的苯酚-濃硫酸法測量其吸光度,平行測定3次。并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計算出供試液中的葡萄糖含量,按下式計算換算因子:換算因子f=m/(C×D)。(m為稱取的天冬多糖質(zhì)量,mg;C為天冬多糖樣品液中葡萄糖的質(zhì)量濃度,mg·mL-1;D為天冬多糖的稀釋倍數(shù))換算因子最終計算為 0.610 7。

2.4.4 多糖含量的測定 精密吸取“2.4.1.3”項下的樣品液0.6 mL,于25 mL量瓶中,用蒸餾水稀釋至刻度,按照確定的最佳顯色條件測定其吸光度,平行測定3次。根據(jù)回歸方程計算出多糖液中葡萄糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)C,并按下式計算樣品液中多糖的含量:多糖含量=(C×D×f)/W×100%(提取液中多糖含量:W為天冬藥材質(zhì)量,g;f為換算因子;C為樣品液中葡萄糖的含量,mg·mL-1;D為樣品液中稀釋倍數(shù)。粗多糖含量:W為粗多糖質(zhì)量,mg;f為換算因子;C為樣品液中葡萄糖的含量,mg·mL-1;D為樣品液中稀釋倍數(shù))。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備與線性關(guān)系的考察 精密吸取“2.4.1.2 對照品溶液的制備”項下的對照品溶液 0.5、1.0、1.5、1.8、2.0、2.5 mL于10 mL容量瓶中,加水稀釋至刻度,再精密吸取0.6 mL各濃度的對照品溶液,按“2.4.2”項下方法進行顯色反應(yīng),再精密吸取0.6 mL蒸餾水按同樣顯色操作為空白,于490 nm處測定吸光度。以吸光值為縱坐標(biāo)Y,葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)X,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,Y=4.644X+0.020 7,r=0.999 1,在葡萄糖質(zhì)量濃度在0.025～0.125 mg·mL-1范圍內(nèi)與吸光值之間呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。

2.5.2 精密度試驗 分別精密吸取“2.4.1.3”項下“③超聲輔助結(jié)合酶法”中的樣品液0.6 mL于具塞試管中,按照最佳顯色條件,重復(fù)測定吸光度6次,計算RSD值為0.26%,結(jié)果表明該儀器精密度良好。

2.5.3 重復(fù)性試驗 取同一批醇沉后制得多糖粉末(按“2.4.1.3”項下超聲輔助結(jié)合酶法制備)約10 mg,精密稱定,置100 mL量瓶中,加蒸餾水適量溶解并稀釋至刻度,平行制備6份,精密移取0.6 mL的樣品液于具塞試管中,按照最佳條件顯色,測定吸光度,計算平均含量為39.33%,RSD值為1.98%,結(jié)果表明該方法的重復(fù)性良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗 取“2.5.3”項下的顯色溶液分別放置5、30、45、60、90 min,并在490 nm處測定吸光度,結(jié)果平均吸光度為0.324,計算RSD值為0.71%,表明供試品溶液在90 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.5 加樣回收試驗 取已知含量的多糖粉末約5 mg置于100 mL量瓶中,精密稱取6份,于量瓶中分別加入相當(dāng)含量的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mL(3.72 mg·mL-1),用蒸餾水稀釋至刻度,從中精密吸取0.6 ml溶液,按照最佳條件顯色,測定吸光度,計算多糖含量、回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果見表4,表明該方法準(zhǔn)確度良好。

表4 加樣回收率試驗結(jié)果

2.6 多糖樣品含量測定 根據(jù)“2.2.3”項下的最佳條件制備3個批次的粗多糖樣品,按照“2.4.1.3”項下的“③超聲輔助結(jié)合酶法”用蒸餾水稀釋待測多糖樣品溶液,并根據(jù)最佳顯色條件進行顯色,分別計算每批次的含量及RSD值,結(jié)果見表5,說明測得多糖含量為32.39%～39.71%。

表5 不同批次多糖含量測定結(jié)果

3 討論

本試驗中以多糖含量為指標(biāo),3種方法結(jié)果分別為:水提醇沉法為29.48%±0.14%、DES結(jié)合超聲提取法為5.18%±0.44%、超聲輔助結(jié)合酶法為35.85%±0.26%。DES提取法可能是粗多糖中包含大量氯化膽堿,因而造成了得率較高而多糖含量較低的情況。而水提醇沉法提取時需要經(jīng)過多次煮提,且需要較高溫度,不僅費時費力,且高溫可能影響所得多糖活性。此外,酶法提取時不僅提取液中多糖含量也顯著高于其他兩種方法,并且酶法所制得粗多糖純度較高,由此得出超聲輔助結(jié)合酶法在3種方法中具有一定的優(yōu)勢的結(jié)論,比較適合用于提取天冬多糖。本文同時測定提取液及粗多糖中多糖含量,發(fā)現(xiàn)提取液中多糖含量高于粗多糖中含量,可能是由于提取液中有一些單糖及雜質(zhì)干擾,為后續(xù)多糖含量測定方法提供一定的數(shù)據(jù)支持。