孫煥烜,尚宏越,郭銀銀,張 佩,董志強(qiáng),李亞君

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,陜西楊凌 712100)

碳、氮代謝是作物最基本的兩大代謝過(guò)程,二者相互影響,協(xié)調(diào)統(tǒng)一[1]。以光合作用為核心的碳代謝為作物生長(zhǎng)發(fā)育提供最基本的結(jié)構(gòu)和能量來(lái)源,也為氨基酸等含氮化合物合成提供物質(zhì)基礎(chǔ)。氮代謝為碳代謝提供酶和光合色素,作物氮素營(yíng)養(yǎng)狀況是影響碳同化效率的重要因素[2-3]。干旱脅迫會(huì)引起農(nóng)作物碳、氮代謝失衡[4]。在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段,干旱脅迫下光合速率下降,碳水化合物供應(yīng)不足,氮素吸收受限,作物生長(zhǎng)發(fā)育不良[5]。在生育后期,干旱脅迫可能會(huì)導(dǎo)致植株早衰、籽粒早熟,碳、氮同化物在源庫(kù)間的轉(zhuǎn)運(yùn)和分配發(fā)生改變[6]。

作物生育后期自然衰老過(guò)程中伴隨著養(yǎng)分由營(yíng)養(yǎng)器官向生殖器官的轉(zhuǎn)移和重新分配,這是其高效利用養(yǎng)分的重要生存策略之一[7]。干旱脅迫會(huì)改變這一進(jìn)程,而碳、氮代謝等相關(guān)途徑參與其中多方面的調(diào)控作用[2,4]。在生理水平上,干旱脅迫下光合機(jī)能下降,營(yíng)養(yǎng)器官碳水化合物合成受阻,過(guò)剩的光能可能導(dǎo)致活性氧的大量積累,加速衰老進(jìn)程,導(dǎo)致植株不能維持正常的形態(tài)及生理功能[8]。氮素養(yǎng)分狀況是影響植株衰老的重要因素之一,營(yíng)養(yǎng)器官較高的氮素水平有利于干旱脅迫下光合機(jī)能的維持,延緩衰老,提高耐旱性[9-10]。在代謝水平上,一些碳、氮代謝產(chǎn)物,如可溶性糖、糖醇類(lèi)、脯氨酸、谷胱甘肽、多胺等是干旱脅迫下重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、抗氧化物質(zhì)和信號(hào)分子等,參與作物抵御干旱脅迫的多種適應(yīng)途徑[8,11-12]。

植物碳代謝過(guò)程中,光合產(chǎn)物以蔗糖的形式輸出并轉(zhuǎn)運(yùn),其后在庫(kù)器官中轉(zhuǎn)化為淀粉等儲(chǔ)存,蔗糖和淀粉相互轉(zhuǎn)化受碳代謝關(guān)鍵酶的調(diào)節(jié)[13]。其中蔗糖合成酶主要參與催化將蔗糖轉(zhuǎn)化為UDPG和果糖,可溶性淀粉合成酶則主要參與支鏈淀粉的合成[14-15]。谷氨酰胺合成酶是谷氨酰胺合成的關(guān)鍵酶,在植物氮素吸收及同化過(guò)程中具有重要作用。在植物生育后期,谷氨酰胺是營(yíng)養(yǎng)器官向生殖器官氮素轉(zhuǎn)運(yùn)的重要載體,因而谷氨酰胺合成酶也是生育后期氮素轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵[2]。

生育后期干旱脅迫會(huì)嚴(yán)重影響玉米籽粒發(fā)育,導(dǎo)致產(chǎn)量下降[16]。目前,盡管已有部分研究對(duì)干旱脅迫下玉米碳、氮同化物積累及分配特征進(jìn)行了探討,但對(duì)于其生理及代謝調(diào)節(jié)機(jī)制仍較少報(bào)道?；诖?本研究從碳、氮同化物分配角度出發(fā),通過(guò)測(cè)定碳、氮代謝關(guān)鍵酶活性及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析,探討干旱脅迫對(duì)玉米生育后期物質(zhì)代謝的影響特征。為解析干旱脅迫下的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)在陜西省楊凌示范區(qū)西北農(nóng)林科技大學(xué)防雨棚中池栽進(jìn)行,棚中設(shè)2 m×1.5 m的水泥池小區(qū),各池間筑水泥墻防止測(cè)滲。池內(nèi)土壤為婁土,除水分處理外,池栽玉米各項(xiàng)栽培措施與常規(guī)田間管理一致。所用玉米品種為‘鄭單958’,吐絲期以前所有處理均充分供水,吐絲期以后,使用TDR法監(jiān)測(cè)并控制土壤供水量,對(duì)照為正常供水處理(Well watered,WW) ,保持土壤相對(duì)含水量在75%以上。干旱脅迫處理(Drought stress,DS) 土壤相對(duì)含水量為45%～55%至取樣,每處理3個(gè)重復(fù)小區(qū)。

1.2 項(xiàng)目測(cè)定方法

1.2.1 生物量,碳、氮同化物含量及分配 分別于玉米成熟期取整株地上部分(不包括雄穗),按葉片、莖稈、穗軸和籽粒分開(kāi),烘干用測(cè)定各部位(莖稈、葉片、穗軸、苞葉、籽粒等)生物量、可溶性糖、蔗糖、淀粉、全氮等碳、氮同化物含量。其中生物量為各部位干質(zhì)量,可溶性糖、蔗糖、淀粉含量的測(cè)定參照高俊鳳的方法[17],氮含量(全氮)的測(cè)定使用凱氏定氮法[18]。相關(guān)參數(shù)計(jì)算如下:

各部位(莖稈、葉片、穗軸、苞葉、籽粒)碳、氮同化物積累量 = 干質(zhì)量×碳、氮同化物含量

碳、氮同化物分配比例(%) =(碳、氮同化物積累量/地上部分總積累量)× 100%

1.2.2 碳氮代謝關(guān)鍵酶活性 生育后期(吐絲后50 d)分別取葉片(取樣部位為穗位葉)和籽粒鮮樣。用于測(cè)定碳氮代謝關(guān)鍵酶活性及基因表達(dá)分析。其中蔗糖合成酶(sucrose synthase,SS)活性(合成方向活性)的測(cè)定使用UDPG反應(yīng)法進(jìn)行[17]?？扇苄缘矸酆铣擅?soluble starch synthase,SSS) 和谷氨酰胺合成酶(GS) 活性的測(cè)定參照Z(yǔ)hang等[19]的測(cè)定方法進(jìn)行。

1.2.3 葉片轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析 對(duì)干旱脅迫(DS)與對(duì)照(WW)葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,分析干旱脅迫對(duì)生育后期葉片差異基因表達(dá)的影響。方法如下:分別取干旱脅迫(DS)和對(duì)照(WW)玉米葉片鮮樣用于RNA提取和cDNA文庫(kù)制備?？俁NA的提取使用TRIzol試劑完成,使用DNase Ⅰ消化基因組DNA,純化后的RNA用于構(gòu)建cDNA文庫(kù),每處理3重復(fù)。構(gòu)建好的cDNA文庫(kù)使用Illumina平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,經(jīng)測(cè)序獲得的高質(zhì)量序列與玉米參考基因組比對(duì)并進(jìn)行基因差異基因篩選及分析,其中|log2fold-change(FC)|≥1且false discovery rate <0.05判定為差異基因。對(duì)差異表達(dá)基因的代謝途徑分析使用Mapman完成[20]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析使用R軟件(Version 3.6.1)完成,數(shù)據(jù)顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析(ANOVA)法完成。圖表的制作使用Microsoft office 2013完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫下成熟期各部分生物量及碳氮同化物分配狀況

如圖1所示,生育后期干旱脅迫處理顯著降低了成熟期地上各部分生物量積累,其中整株生物量和穗粒質(zhì)量分別降低28.3%和32.5%,可見(jiàn)干旱脅迫顯著抑制了產(chǎn)量的形成,對(duì)穗軸和苞葉生物量的影響較小。在碳水化合物含量方面(表1),干旱脅迫下玉米莖稈、葉片、穗軸中可溶性糖含量與正常供水處理相比均顯著降低,降低幅度分別為21.5%、10.7%、7.3%,籽粒可溶性糖含量在兩處理間無(wú)顯著差異。干旱脅迫下莖稈、葉片蔗糖含量分別顯著降低29.8%、18.6%。干旱脅迫顯著降低了成熟期籽粒淀粉含量,幅度為 2.6%,而莖稈和葉片中淀粉含量則分別增加41%和26.3%。在氮含量方面,干旱脅迫下玉米葉片和籽粒氮含量分別降低29.7%和4%,而穗軸中氮含量則顯著增加。

表1 兩種水分處理下玉米不同部位碳、氮同化物的含量Table 1 Carbohydrate,nitrogen content among different parts under two water treatments

不同小寫(xiě)字母表示兩種水分處理在P<0.05水平下差異顯著,下同

表2給出了生育后期干旱脅迫對(duì)成熟期各部分生物量及碳、氮同化物分配比例的影響。干旱脅迫下生物量在各部位的分配比例顯著改變,表現(xiàn)為生物量在莖稈中的分配比例升高3.1%,而在籽粒中的分配比例則下降6.1%,可見(jiàn)干旱脅迫降低了玉米籽粒生物量分配比例(收獲指數(shù))。在碳水化合物分配方面,干旱脅迫對(duì)玉米莖稈、葉片中可溶性糖分配無(wú)明顯影響,籽粒可溶性糖分配比例下降4.0%,穗軸和苞葉中的分配比例則分別提高2.5%和0.8%。干旱脅迫下莖稈、葉片蔗糖分配比例在處理間無(wú)顯著差異。成熟期淀粉大量分配于籽粒中,干旱脅迫下籽粒淀粉分配比例有所下降,而莖稈和葉片中的分配比例則分別增加0.67%和0.36%。在氮素分配方面。干旱脅迫下葉片氮素分配比例下降3%,籽粒氮分配比例(氮收獲指數(shù))下降2.7%,而莖稈、穗軸中氮素分配比例則顯著增加?？梢?jiàn)干旱脅迫下生育后期氮素由營(yíng)養(yǎng)器官向籽粒的分配受到了抑制,更多的氮素分配于莖稈等部位。

表2 兩種水分處理下不同部位生物量及碳、氮同化物分配的比例Table 2 Biomass,carbohydrate,nitrogen distribution rate among different parts under two water treatments

2.2 干旱脅迫下碳氮代謝關(guān)鍵酶活性

對(duì)生育后期(吐絲后50 d)不同部位碳、氮代謝關(guān)鍵酶活性進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果如圖2所示。干旱脅迫與對(duì)照相比葉片及籽粒中蔗糖合成酶活性均無(wú)明顯差異。干旱脅迫下葉片可溶性淀粉合成酶活性顯著高于正常供水處理,而籽粒中則顯著降低。干旱脅迫處理顯著提高吐絲后50 d葉片谷氨酰胺合成酶(GS)活性,兩種水分處理對(duì)籽粒中的GS活性影響較小。

圖2 兩種水分處理對(duì)生育后期葉片和籽粒中蔗糖合成酶、可溶性淀粉合成酶和谷氨酰胺合成酶活性的影響Fig.2 SS,SSS and GS activity in leaves and grains at later growth stage under two water treatments

2.3 干旱脅迫對(duì)玉米葉片差異基因表達(dá)分析

比較干旱脅迫與對(duì)照葉片的轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)譜差異,篩選差異表達(dá)基因(DEGs)并進(jìn)行代謝途徑分析,結(jié)果表明:與對(duì)照(CK)相比,干旱脅迫下共檢測(cè)到51個(gè)DEGs,其中上調(diào)表達(dá)28個(gè),下調(diào)表達(dá)22個(gè)(圖3-A)。對(duì)上述DEGs的代謝途徑分析結(jié)果表明,部分差異基因分布在一些碳、氮及相關(guān)代謝途徑(圖3-B),例如細(xì)胞壁組織(Cell wall organisation)、碳水化合物代謝(Carbohydrate metabolism)、光合作用(Photosynthesis)、氨基酸代謝(Amino acid metabolism)、蛋白質(zhì)合成(Protein biosynthesis)等。

圖3 干旱脅迫下差異基因統(tǒng)計(jì)(A)及代謝途徑分析(B)Fig.3 Statistics of DEGs(A) and metabolic pathway classification(B)under drought stress

對(duì)上述途徑中與碳、氮代謝相關(guān)的部分DEGs進(jìn)行了進(jìn)一步分析,相關(guān)DEGs信息見(jiàn)表3。在細(xì)胞壁組織代謝途徑中的6個(gè)DEGs在干旱脅迫下均顯著下調(diào)表達(dá),這些DEGs主要包括纖維素合成酶基因(zm00001d043477、zm00001d032776),木質(zhì)素漆酶(zm00001d042905、 zm00001d012408)等。碳水化合物代謝途徑中編碼磷酸甘露糖異構(gòu)酶(zm00001d040020)基因在干旱脅迫下顯著上調(diào)表達(dá),己糖激酶基因(hexokinase)顯著下調(diào)表達(dá)。光合作用途徑的兩個(gè)DEGs中上調(diào)表達(dá)的基因?yàn)榫幋aNAD(P)H醌氧化還原酶基因(zm00001d019605),下調(diào)表達(dá)的基因?yàn)榫幋a絲氨酸乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因(zm00001d031403)。蛋白質(zhì)合成途徑中30S 核糖體蛋白基因(zm00001d053713)表達(dá)量顯著降低?？傮w而言,干旱脅迫對(duì)上述代謝途徑基因表達(dá)主要呈抑制趨勢(shì)。

表3 干旱脅迫下部分碳、氮代謝相關(guān)途徑差異表達(dá)基因詳情T(mén)able 3 Information of DEGs for carbohydrates and nitrogen related metabolic pathways in maize leaves under DS treatment

3 討 論

本研究中,生育后期干旱顯著降低玉米粒質(zhì)量和生物量積累,且生物量在營(yíng)養(yǎng)器官(莖稈、葉片等)中的分配比例增加,而籽粒中的分配比例(收獲指數(shù))則顯著下降(圖1),這與前人的研究結(jié)果一致[21]。干旱脅迫下玉米葉片種的可溶性糖含量及分配比例降低,籽粒淀粉含量降低,這與干旱脅迫下光合機(jī)能的下降有關(guān)[14]。在氮代謝方面,干旱脅迫下葉片氮素含量及分配比例均顯著降低,這可能與干旱脅迫下葉片早衰導(dǎo)致的氮素流失有關(guān)[6]。干旱脅迫下籽粒氮收獲指數(shù)顯著降低,而莖稈中分配則顯著增加。類(lèi)似的結(jié)果前人的研究中也有報(bào)道,籽粒是玉米生育后期最大的氮匯,干旱脅迫顯著限制了籽粒生長(zhǎng),導(dǎo)致籽粒氮素庫(kù)容量顯著降低,從而使得更多的氮素停留在莖稈等部位[22]?？梢?jiàn)干旱脅迫對(duì)生育后期碳、氮同化物向籽粒的分配總體呈抑制作用,而使其更多地分布于營(yíng)養(yǎng)器官中[23]。

在碳、氮代謝關(guān)鍵酶活性方面,干旱脅迫下葉片可溶性淀粉合成酶活性增加,可溶性糖含量降低,而淀粉含量顯著增加,可見(jiàn)干旱脅迫促進(jìn)葉片中可溶性糖向淀粉的轉(zhuǎn)化。這與Abdelgawad等[14]的研究結(jié)果一致,即干旱脅迫可能會(huì)促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)器官淀粉的生物合成,而較高的淀粉含量更有利于維持脅迫條件下的葉片生長(zhǎng)及碳水化合物供應(yīng),緩解氧化傷害。與葉片中不同,籽粒可溶性淀粉合成酶活性在干旱脅迫下顯著降低,這與籽粒淀粉含量及分配比例均下降的結(jié)果一致[15]。吐絲后50 d,干旱脅迫下葉片GS活力顯著提高,這有助于清除逆境脅迫下產(chǎn)生的過(guò)量氨[24]。同時(shí),干旱脅迫下GS活力的升高加速了葉片氮素轉(zhuǎn)運(yùn),這與本研究中干旱脅迫下葉片氮含量及分配比例均顯著降低的結(jié)果一致,類(lèi)似的趨勢(shì)在其他研究中也有報(bào)道[25]。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果表明(表3),在細(xì)胞壁組織代謝途徑中,纖維素合成酶基因在干旱脅迫下均顯著下調(diào)表達(dá),其原因可能與干旱脅迫下碳水化合物供應(yīng)受阻,纖維素合成酶活性及纖維素含量降低有關(guān)[14]。木質(zhì)素是細(xì)胞壁的重要組分,植物組織木質(zhì)化程度的高低對(duì)維持逆境脅迫下植株固有的形態(tài)至關(guān)重要,因而顯著影響其抵御干旱等非生物脅迫的能力[26]。木質(zhì)素漆酶是木質(zhì)素的生物合成的關(guān)鍵[27],本研究中,干旱脅迫下兩個(gè)木質(zhì)素漆酶基因均顯著下調(diào)表達(dá),表明干旱脅迫下木質(zhì)素的合成受到抑制,而纖維素、木質(zhì)素等合成的抑制不利于植株維持其正常形態(tài),從而引起植株萎蔫,加速衰老進(jìn)程[28]。在光合作用代謝途徑中,編碼NAD(P)H醌氧化還原酶基因在干旱脅迫下顯著上調(diào)表達(dá),類(lèi)似的趨勢(shì)在其他研究中也有報(bào)道,其作用可能與維持干旱脅迫下的能量供應(yīng)及蛋白的正常生理功能有關(guān)[29]。絲氨酸乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因顯著下調(diào)表達(dá),該酶主要參與光呼吸過(guò)程,隨著葉片的衰老及光呼吸的降低,其活性顯著下降[30]。在碳水化合物代謝途徑中,干旱脅迫下編碼磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因顯著上調(diào)表達(dá),該酶參與合成干旱脅迫下重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)——甘露醇。因此,該基因的上調(diào)表達(dá)可能與干旱脅迫下甘露醇的合成有關(guān)[11,31]。己糖激酶基因顯著下調(diào)表達(dá),其與干旱脅迫下碳同化水平的降低有關(guān)[31]。

4 結(jié) 論

生育后期干旱脅迫下籽粒中可溶性糖、淀粉、氮素等的分配比例均顯著降低,而莖稈及穗軸中的分配比例則顯著增加,可見(jiàn)干旱脅迫不利于碳、氮同化物向籽粒分配。干旱脅迫下生育后期葉片GS活性顯著提高,籽粒SSS活性顯著降低,這與干旱脅迫下葉片氮含量及籽粒淀粉含量的降低有關(guān)。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果表明,干旱脅迫對(duì)葉片細(xì)胞壁形成、碳水化合物代謝等代謝途徑基因表達(dá)總體呈抑制作用,其中對(duì)木質(zhì)素等合成途徑的抑制作用可能是其引起葉片早衰的重要原因之一。