李振林,彭夢玲,2,蘇 甜,2,呂 霞,張國平,張應(yīng)華,許俊強(qiáng)

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 云南省滇臺特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化工程研究中心,昆明 650201;2. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林園藝學(xué)院,昆明 650201)

干旱、鹽脅迫、高溫、低溫等非生物脅迫嚴(yán)重影響植物的生長發(fā)育,是影響作物產(chǎn)量的主要因素[1-2],而水楊酸、茉莉酸甲酯、脫落酸等植物激素可作為植物抗逆反應(yīng)所需的信號分子來激活植物防御保護(hù)機(jī)制[3]。鈣結(jié)合蛋白廣泛參與植物抗逆境反應(yīng)過程,對鈣結(jié)合蛋白的研究是Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[4-5]。

類鈣調(diào)蛋白(Calmodulin-Like Protein, CML)是植物特有的Ca2+受體蛋白中一個大的亞家族,具有EF-hand結(jié)構(gòu)域[6],是Ca2+信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵部分[7]。目前已經(jīng)在多種植物中鑒定了CMLs基因。其中擬南芥50個AtCMLs[8],水稻32個OsCMLs[9]、大豆68個GmCMLs[10],棉花60個GrCMLs[11],番茄中有52個ShCMLs[12],百脈根19個LjCMLs[13],白菜79個BrCMLs[14],結(jié)球甘藍(lán)76個BoCMLs[15]。相較CaMs,CMLs更多地參與到植物的非生物、激素脅迫響應(yīng)。研究表明,AtCML9可通過調(diào)節(jié)ABA通路提高植物的耐鹽性[16];OpCML13在NaCl脅迫下表達(dá)明顯增強(qiáng)[17];AtCML15參與調(diào)控Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AtNHX1的活性,提高植物耐鹽性,AtCML15與NHX1互作降低Na+/H+交換的活性,在逆境脅迫時發(fā)揮作用[18];CML24能夠響應(yīng)高溫、低溫、氧脅迫及ABA的誘導(dǎo)表達(dá)[19];AtCML24在植物各個部位均有表達(dá),受到觸碰、黑暗、高溫、低溫、H2O2、ABA和IAA處理時表達(dá)水平逐漸增強(qiáng)[20];GsCML27可以通過Na+、K+含量和調(diào)節(jié)滲透壓力降低耐鹽性[21];水稻OsCML4可通過清除活性氧及ABA獨(dú)立方式誘導(dǎo)其他應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)來提高耐旱性[22];OsMSR2(Multi-Stress- Responsive gene 2)與AtCML37、AtCML38和AtCML39序列高度相似,通過調(diào)節(jié)ABA通路提高對干旱和鹽堿的抗性[23];AtCML42/43能夠參與生物和非生物脅迫[24];具有ShCML44超表達(dá)的番茄植株在寒冷和干旱脅迫條件下,膜損傷程度降低,抗氧化酶活性、氣體交換和保水性增強(qiáng);還表現(xiàn)出ROS減少和相對水含量增加的現(xiàn)象[12];OsCML16的表達(dá)可增強(qiáng)植株的根系生長和耐旱性[25]。由此看出,多種植物的多個CMLs參與植物高溫、低溫、干旱、鹽脅迫及其他激素脅迫,并在不同的脅迫下行使不同的功能。

結(jié)球甘藍(lán)(BrassicaoleraceaL. var.capitata)是十字花科蕓薹屬重要的蔬菜作物,全國廣泛種植[26]。但在甘藍(lán)生長發(fā)育過程中經(jīng)常受到干旱、高鹽、低溫、高溫和病蟲害等逆境脅迫。目前很多CMLs家族成員的功能還是未知的,但已知的成員在不同的生長發(fā)育過程及環(huán)境條件下發(fā)揮著重要作用,結(jié)球甘藍(lán)CMLs有些家族成員已經(jīng)被鑒定,但CML48和CML50未見報道。本研究從結(jié)球甘藍(lán)中克隆得到CML48和CML50,對兩者在不同非生物脅迫后的表達(dá)進(jìn)行分析,初步解析CML48和CML50響應(yīng)8種不同脅迫下的生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

結(jié)球甘藍(lán)材料(ZG)(BrassicaoleraceaL. var.capitata)由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)滇臺中心實(shí)驗室保存。植物總DNA、RNA提取試劑盒(天根,北京)購自天根生化科技(北京)有限公司;pEASY-Blunt Simple Cloning Kit,大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1,Trans2K Plus Ⅱ DNA Marker,TransStart FastPfu Fly DNA聚合酶(全式金,北京)均購自全式金公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、5×All-In-One RT MasterMix等(ABM,美國)購自ABM公司;昆明碩擎生物科技有限公司合成引物及 測序。

1.2 結(jié)球甘藍(lán) CML48和 CML50的cDNA和gDNA的克隆

各取100 mg 2～3片真葉期的甘藍(lán)莖尖,研缽中加液氮迅速研磨,分別提取總RNA及DNA,1%瓊脂糖凝膠電泳及濃度檢測,質(zhì)量完好的RNA逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA,置-20 ℃ 保存。

參考結(jié)球甘藍(lán)基因組的序列設(shè)計引物(表1),通過PCR擴(kuò)增,克隆CML48和CML50基因全長,PCR 反應(yīng)體系為PCR Mixster Mix 5 μL、dNTPs 2.5 μL、上/下游引物各1 μL、FastPfu Fly DNA聚合酶1 μL、cDNA 模板1 μL 、ddH2O至25 μL;反應(yīng)程序為95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s,38個循環(huán);72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物連接克隆載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,PCR檢測正確后進(jìn)行測序。

表1 本研究所使用的引物序列Table 1 Primers used in this study

1.3 基因序列及蛋白生物信息學(xué)分析

序列檢索及比對采用BLAST在線程序進(jìn)行,其他物種中的同源氨基酸序列由NCBI網(wǎng)站下載。分別采用ProtParam Tool(https://web.expasy.org/protparam/)及ProtScale(https://web. expasy.org/protscale/)在線軟件對蛋白理化性質(zhì)和親疏水性進(jìn)行分析;利用SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進(jìn)行信號肽預(yù)測;TMHMM(http://genome.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進(jìn)行跨膜域分析;利用NCBI中CDD(Conserved Domain Database)程序(http://www.ncbi. nlm.nih.gov/cdd)進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析,利用SWISS-MODEL(https://swissmodel．expasy．org/)在線軟件進(jìn)行蛋白三級結(jié)構(gòu)建模。采用DNAMAN v6.0及Muscle軟件進(jìn)行序列同源性比對分析。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹利用MEGA 7.0軟件,采用Neighbor-joining進(jìn)行構(gòu)建。

1.4 結(jié)球甘藍(lán)材料種植及脅迫處理

挑選飽滿的甘藍(lán)種子,播種到腐殖土∶珍珠巖=1∶1(體積比)的50孔穴盤中。種子出芽后,25 ℃光照16 h、20 ℃黑暗8 h培養(yǎng),待植株長至2～3片真葉時進(jìn)行以下不同脅迫處理。參考趙陸滟等[27]的方法將2～3片真葉期的幼苗分別置于15% PEG-6000、200 mmol/L NaCl溶液中水培處理0、1、3、6、12和24 h;將甘藍(lán)幼苗分別放入4 ℃、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱分別生長0、1、3、6、12和24 h;將幼苗分別置于配制好的30 mmol/L H2O2、100 μmol/L ABA、2 mmol/L SA、100 μmol/L MeJA溶液中水培處理0、1、2和4 h。分別取不同處理的植株幼嫩葉片及根,液氮速凍后-80 ℃冰箱保存。

1.5 結(jié)球甘藍(lán) CML48和 CML50脅迫表達(dá)分析

分別提取不同處理植株幼苗的莖尖和根組織的總RNA,以β-Actin為內(nèi)參基因,在Bio-RAD CFX96熒光定量PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)體系為EvaGreen 2× qPCR MasterMix 10 μL,引物各0.6 μL,cDNA 模板1 μL,補(bǔ)水至20 μL。擴(kuò)增程序為95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃ 15 s,57 ℃ 15 s,72 ℃ 30 s,共39個循環(huán)。采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行CML48和CML50基因在不同處理下相對定量表達(dá)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)球甘藍(lán) CML48和 CML50基因的克隆

依據(jù)結(jié)球甘藍(lán)基因組信息,設(shè)計特異性引物。分別以CML48-F/ CML48-R、CML50-F/ CML50-R為正反向引物,從結(jié)球甘藍(lán)莖尖cDNA中分別擴(kuò)增得到CML48和CML50基因,測序分析表明兩者大小分別689 bp和1 112 bp,包含完整開放閱讀框分別為672 bp和1 095 bp(圖1-A和1-B);以CML48-F/ CML48-R、CML50-F/ CML50-R引物從甘藍(lán)基因組中g(shù)DNA分別擴(kuò)增得到CML48、CML50全長分別為1 051 bp和 1 705 bp(圖1-C和1-D)。CML48、CML50gDNA序列中分別含有4個和3個內(nèi)含子。經(jīng)測序及NCBI序列比對表明該基因正確為CML48、CML50。

M. Trans2K plus Ⅱ;A. CML48基因cDNA克隆;B. CML50基因cDNA克隆;C. CML48基因gDNA克隆;D. CML50基因gDNA克隆

2.2 結(jié)球甘藍(lán) CML48和 CML50基因及編碼蛋白序列分析

序列分析表明:CML48基因編碼223個氨基酸,蛋白質(zhì)分子量為25.28 ku,pI為4.54,含有2個EF-hand結(jié)構(gòu)域,分別位于50～78、118～146位氨基酸處,在69、138位處含有保守的谷氨酸(E)(圖2-A),亞細(xì)胞定位預(yù)測CML48蛋白定位于細(xì)胞核中;CML50基因編碼364個氨基酸,蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為38.06 ku,pI為6.27,該序列中含有2個具有鈣離子結(jié)合能力的EF-hand結(jié)構(gòu)域,分別位于 197～225、263～291位氨基酸處,在217、183位處含有保守的谷氨酸(E)(圖2-B),亞細(xì)胞定位預(yù)測CML50蛋白定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞核中;結(jié)球甘藍(lán)CML48和CML50基因編碼蛋白均不含信號肽,不含跨膜域,為胞外蛋白,均為親水性蛋白。

2.3 結(jié)球甘藍(lán) CML48和 CML50編碼蛋白的同源性比對分析

利用NCBI數(shù)據(jù)庫和甘藍(lán)基因組數(shù)據(jù)庫(http://www.ocri-genomics.org/bolbase/ index.html)對CML48和CML50氨基酸同源序列進(jìn)行檢索和比對,發(fā)現(xiàn)CML48與甘藍(lán)、白菜和油菜的氨基酸序列同源性分別為98.65%、96.41%和95.52%(圖2-A);CML50與甘藍(lán)、白菜和油菜的氨基酸序列同源性分別為100%、96.47%和 97.28%(圖2-B)。

2.4 結(jié)球甘藍(lán) CML48和 CML50進(jìn)化分析及三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用DNAMAN6.0.3軟件進(jìn)行多序列比對,在氨基酸水平上,結(jié)球甘藍(lán)CML48與白菜(Brassicarapa[XP_009122631.1])和油菜(Brassicanapus[XP_013668396.1])氨基酸序列同源性最離,均達(dá)到98%;結(jié)球甘藍(lán)CML50與白菜(BrassicarapaXP_009122631.1])和油菜(Brassicanapus[XP_013668396.1])氨基酸序列同源性最高,均達(dá)到98%。用MEGA 7.0軟件以氨基酸作為分析對象進(jìn)行多序列比對,繪制分子進(jìn)化樹(圖3-A和3-B),分析結(jié)果表明結(jié)球甘藍(lán)與白菜(Brassicarapa)、油菜(Brassicanapus)的親緣關(guān)系最近。利用SWISS-MODEL對CML48、CML50蛋白進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測(圖3-C和3-D)。

A.結(jié)球甘藍(lán) CML48系統(tǒng)進(jìn)化樹; B.結(jié)球甘藍(lán) CML50系統(tǒng)進(jìn)化樹;C.結(jié)球甘藍(lán) CML48三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 ;D.結(jié)球甘藍(lán) CML50三維級結(jié)構(gòu)預(yù)測;圖中小球代表Ca2+

2.5 結(jié)球甘藍(lán) CML48和 CML50在干旱、NaCl、高溫和低溫脅迫條件下的表達(dá)

對結(jié)球甘藍(lán)CML48基因在干旱、NaCl、高溫、低溫脅迫下的表達(dá)分析表明(圖4、圖5)。模擬干旱條件下,CML48的表達(dá)量在莖尖和根中均呈現(xiàn)先升后降的趨勢,莖尖中,PEG6000處理1 h后CML48的表達(dá)量迅速上升,3 h后達(dá)到最高約0 h的5.3倍,后逐漸下降;在根部,CML48表達(dá)量1 h時達(dá)到最大值,約為0 h的2.8倍,后緩慢下降至0 h的水平。CML50在模擬干旱脅迫下在莖尖和根中均高度表達(dá),莖尖中1 h表達(dá)急劇增高,3 h最大值約為0 h的50倍,6 h下降到0 h的34倍,并趨于穩(wěn)定;根部中,處理1 h 后CML50表達(dá)量達(dá)到最大,約為0 h的84倍,3 h后驟降到32倍并緩慢降低。NaCl脅迫下的莖尖中,處理1 h后CML48的表達(dá)量開始上升,6 h達(dá)到最大值約為0 h的3.65倍,而后下降但高于對照,12 h和24 h時NaCl處理無顯著差異,約為0 h的2倍;在根部,處理1 h 后CML48表達(dá)量下降,6 h下降到最低約為0 h的0.37倍,其中處理3 h、6 h、24 h時的表達(dá)量顯著低于對照,處理12 h的表達(dá)量與0 h無顯著差異。CML50在NaCl脅迫時在莖尖和根中處理均有較高表達(dá),在莖尖中呈先上升后下降再上升的趨勢,莖尖中 1 h后均急劇上調(diào)表達(dá),達(dá)到對照的20倍,3 h后達(dá)到較高水平,24 h后達(dá)到最高為0 h的51倍,根中CML50表達(dá)量急劇上升,3 h達(dá)到最高值為0 h的20倍,后下降并維持在17倍左右的水平。低溫脅迫下的莖尖中,處理1 h后CML48的表達(dá)量迅速上升,約為處理 0 h的近4.8倍,6 h急劇下降達(dá)到最小值約為0 h的0.4倍,而后又上升,24 h達(dá)到最高峰值約為0 h的6.8倍,1 h和3 h處理無差異;在根部,呈現(xiàn)先升后降的趨勢,處理6 h時CML48表達(dá)上升到最大值約為4.5倍,12 h后下降到對照水平。CML50在低溫脅迫下的表達(dá)總體呈上升趨勢,24 h表達(dá)急劇增高到最大為0 h的84.4倍;根中CML50表達(dá)量先上升后降低,1 h和3 h均到達(dá)0 h的14倍,6 h到達(dá)最高值約為0 h的49倍,后下降到20余倍。高溫脅迫下的莖尖中,處理1 h后CML48的表達(dá)量迅速上升,3 h后達(dá)到最高約0 h的43倍,而后急劇下降達(dá)到最小值,6～24 h穩(wěn)定到0 h表達(dá)水平;在根部,隨著處理時間的延長,CML48表達(dá)量總體無差異。高溫脅迫下在莖尖和根中CML50基因均高度表達(dá),莖尖中1 h表達(dá)量劇增到最大,達(dá)到0 h的154倍,3 h后急劇下降到約為0 h的60倍左右,并趨于穩(wěn)定;根部中,高溫脅迫處理1～24 h表達(dá)量總體處于較高水平,約為 0 h的50倍左右,且趨于穩(wěn)定。綜上說明結(jié)球甘藍(lán)CML48在莖尖中和根中均響應(yīng)干旱、NaCl、高溫、低溫脅迫,且在莖尖中的表達(dá)量總體高于根部,甘藍(lán)CML48僅在莖尖響應(yīng)高溫脅迫,而在根中無響應(yīng);CML50高水平響應(yīng)干旱、NaCl、高溫、低溫脅迫,在脅迫誘導(dǎo)下的莖尖和根部均有高水平的上調(diào)表達(dá)。

不同小寫字母表示差異顯著性(P<0.05),下同

圖5 結(jié)球甘藍(lán) CML50在干旱、NaCl、4 ℃及37 ℃脅迫下的表達(dá)Fig.5 Expressions of CML50 under PEG6000,NaCl,4 ℃ and 37 ℃ stresses

2.6 結(jié)球甘藍(lán) CML48和 CML50在H2O2、SA、ABA及MeJA脅迫條件下的表達(dá)

對甘藍(lán)CML48和CML50在H2O2、SA、ABA及MeJA脅迫下的表達(dá)分析,結(jié)果表明(圖6、圖7)。莖尖中,H2O2處理1 h后CML48的表達(dá)量與0 h相當(dāng),2 h時迅速上升達(dá)到最大值,約為0 h的8.8倍,4 h時迅速下降但顯著高于對照;而在根部,H2O2處理CML48基因表達(dá)量無差異。在莖尖和根中CML50表達(dá)量均高度表達(dá),莖尖中2 h表達(dá)量劇增到最大,達(dá)到0 h的100.6倍,后急劇下降,但總體處于高表達(dá)水平;根部中,H2O2處理CML50表達(dá)量總體處于較高水平,約為0 h的24倍左右,且處于穩(wěn)定水平。說明甘藍(lán)CML48在干旱脅迫下對莖尖的響應(yīng)較大,而在根中無響應(yīng);而CML50在根與莖尖中均較高表達(dá)。ABA脅迫莖尖中CML48表達(dá)量有所增加,約為0 h的2倍左右,顯著高于對照并穩(wěn)定在這一水平;根部中,ABA處理1～4 h表達(dá)量呈上升趨勢,4 h增加達(dá)到最高為0 h的3.1倍,顯著高于其他時間。ABA處理下,CML50基因7莖尖和根中均高度表達(dá),且在莖尖和根部的表達(dá)量基本一致;處理1 h表達(dá)量均急劇增高,4 h時均達(dá)到最高,均為對照的30倍左右。說明CML48響應(yīng)ABA在甘藍(lán)根部脅迫,CML50在莖尖和根中均響應(yīng)ABA脅迫,且響應(yīng)程度基本一致,ABA對甘藍(lán)莖尖和根部的生長發(fā)育起到重要作用。SA脅迫的莖尖中CML48表達(dá)量呈先升后降的趨勢,1 h表達(dá)量顯著高于對照,2 h達(dá)到最高值為0 h的3.5倍,4 h下降到起始水平;根部中,SA處理1～2 h表達(dá)量與0 h無差異,4 h達(dá)到最高約為0 h的4.8倍;CML50在SA處理下在莖尖和根中均高度表達(dá),莖尖中CML50表達(dá)量呈先升后降的趨勢,1 h 后急劇升高,2 h達(dá)到最高約為0 h的40.6倍,4 h時下降到0 h的17.6倍;根部中,CML50表達(dá)量1 h急劇增高, 2 h與1 h無差異,4 h達(dá)到最高約為0 h的42倍。說明CML48、CML50在SA脅迫誘導(dǎo)下均有表達(dá)變化,表明結(jié)球甘藍(lán)兩基因響應(yīng)SA脅迫。MeJA處理時,隨著MeJA脅迫處理時間的延長,在莖尖中CML48基因表達(dá)量呈先升后降的趨勢,處理2 h后的表達(dá)量達(dá)到最高為0 h的5.5倍,4 h時迅速下降至0 h的3.2倍,顯著高于對照;在根部,CML48表達(dá)量總體呈上升的趨勢,處理1 h后CML48表達(dá)量降到最低,2 h恢復(fù)到原來水平,4 h達(dá)到最高為0 h的2.6倍。CML50在莖尖和根中均高度表達(dá),莖尖中CML50基因表達(dá)量呈先升后降的趨勢,1 h表達(dá)量急劇增高,2 h達(dá)到最高,約為0 h的57倍,4 h后下降到0 h的27倍,總體處于較高的表達(dá)水平;根部中,MeJA處理時CML50呈上升趨勢, 4 h達(dá)到最高,約為0 h的39.4倍。綜上說明CML48和CML50在H2O2、SA及MeJA脅迫時于莖尖中的響應(yīng)高于根部,而處理后期在根部響應(yīng),但CML48在根中不響應(yīng)H2O2脅迫,表明CML48和CML50能夠響應(yīng)H2O2、SA、ABA及MeJA脅迫。

圖6 結(jié)球甘藍(lán) CML48在H2O2、SA、ABA and MeJA脅迫處理下的表達(dá)Fig.6 Expressions of CML48 under H2O2,SA,ABA and MeJA stresses

圖7 結(jié)球甘藍(lán) CML50在H2O2、SA、ABA及MeJA脅迫處理下的表達(dá)Fig.7 Expressions of CML50 under H2O2,SA,ABA and MeJA stresses

3 討 論

CMLs是植物中特有的一類Ca2+結(jié)合蛋白,在Ca2+信號傳導(dǎo)途徑中具有重要的作用。目前已在多種植物中克隆了CMLs基因,如巴西橡膠樹HbCML27[28]、無苞芥OpCML13[17]、結(jié)球甘藍(lán)BoCML49[29]及青稞CML19[30]、大白菜BrCML49[31]等,但不同基因的表達(dá)特征及功能研究仍不清楚。本研究從結(jié)球甘藍(lán)中克隆CML48和CML50基因,預(yù)測編碼蛋白均含有2個EF-hand結(jié)構(gòu)域,在EF-hand1、2上均有相同的保守谷氨酸(E)位點(diǎn),說明CML48和CML50均是EF-hand家族成員。生物信息學(xué)分析表明,均屬于親水蛋白,這與巴西橡膠樹HbCML27[28]和新疆無苞芥OpCMLl3[17]的預(yù)測分析結(jié)果一致。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明CML48和CML50均與甘藍(lán)、油菜和白菜親緣關(guān)系較近,氨基酸相似性均達(dá)到97%以上,與其他物種較遠(yuǎn)。在EF-hand1、2、4上均有相同的保守谷氨酸(E)位點(diǎn),說明CML48和CML50均是EF-hand家族成員。

對擬南芥的研究表明多個CMLs參與逆境脅迫感知:如AtCML24[32]、AtCML37[33]、AtCML38[34]、AtCML39[34]和AtCML42[35]等。ABA、MeJA和SA作為重要的植物激素信號分子,不僅能夠調(diào)控植物生長發(fā)育, 同時參與植物逆境反應(yīng)[36-37]。cml9突變體提高擬南芥對干旱和鹽害的耐受性[38]。新疆無苞芥OpCML13對逆境脅迫的響應(yīng)非常靈敏, 其在無苞芥響應(yīng)逆境生理生態(tài)環(huán)境中可能起著重要的作用[17];AtCML18在液泡中與Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NHXl (Na+/H+exchanger 1)互作,結(jié)合在NHXl的C端,兩者互作可能在植物響應(yīng)鹽害反應(yīng)中起作用[18];AtCML15也可以與NHX1互作,能減少Na+/H+交換的活性,在逆境脅迫時發(fā)揮作用[18]。野生大豆GsCML27的異位表達(dá)可以通過改變細(xì)胞離子(Na+、K+)含量和調(diào)節(jié)滲透壓力來降低耐鹽性[21]。趙陸滟等[27]研究表明8種不同非生物脅迫處理均能上調(diào)結(jié)球甘藍(lán)葉和根中BoCML39的表達(dá)。水稻OsMSR2受多種逆境條件的誘導(dǎo)表達(dá),超表達(dá)OsMSR2增強(qiáng)植株對ABA的敏感性,可能是通過調(diào)節(jié)ABA通路上的基因,提高擬南芥對干旱和鹽堿的抗性[23]。本研究得到的CML48和CML50均響應(yīng)非生物脅迫,說明兩者受不同逆境條件誘導(dǎo)。對兩者而言,CML50響應(yīng)逆境時均超高表達(dá),反應(yīng)比較靈敏;而CML48也有響應(yīng),但除在莖尖中高度響應(yīng)高溫脅迫外,其余表達(dá)量均相對較低,而在高溫脅迫和H2O2的根中無響應(yīng)。由于CML48和CML50基因在其他物種上研究較少,對于CML48和CML50在逆境脅迫調(diào)控的通路仍需進(jìn)一步研究。

CMLs參與植物的各種生長發(fā)育、激素調(diào)控的細(xì)胞活動、病原體防御及各種脅迫的誘導(dǎo)。對CMLs家族功能的研究,將有利于探索CMLs家族成員之間的聯(lián)系與區(qū)別,完善植物鈣信號系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)。目前CMLs家族基因的研究其功能的鑒定還處于初級階段,CMLs的功能還需進(jìn)一步 探究。

4 結(jié) 論

克隆得到結(jié)球甘藍(lán)CML48和CML50基因,均含有2個保守的EF-hand結(jié)構(gòu)域;CML48和CML50均與白菜、油菜的進(jìn)化關(guān)系最近;8種不同脅迫處理均能調(diào)控結(jié)球甘藍(lán)CML48和CML50基因在莖尖和根中的表達(dá)量,且CML50對各脅迫的響應(yīng)顯著高于CML48和CML48在莖尖中高度響應(yīng)高溫脅迫,而在根中不響應(yīng)高溫和H2O2脅迫,表明CML48和CML50響應(yīng)不同脅迫時的調(diào)控過程。