蘇媛,劉安平,劉學(xué)良,李維業(yè),劉海青,石春蘭,問靜,王永晶,牛貴姍,王開祥,韓達(dá)斌,楊增亮,祁彥凱

(1.西寧市食品藥品檢驗檢測中心,西寧 810007;2.青海省藥品審評核查中心,西寧 810007)

山地虎耳草在《中國植物志》[1]、《青海植物志》[2]、《青海經(jīng)濟(jì)植物志》[3]《中華藏本草》[4]均有記載,為虎耳草科虎耳草屬山地虎耳草SaxifragamontanaH.Smith的干燥全草[1]。其藏語名為“塞仁交木”[1]、“塞交塞?！盵3]、“塞迥色?！盵4],生長于海拔3200～4800 m的灌叢和高山草甸,青海省內(nèi)主產(chǎn)于海北、海南、黃南、玉樹、果洛等州及東部農(nóng)業(yè)區(qū);甘肅、陜西南部、西藏、四川西部和云南北部也均有分布[3]。于每年7—8月采花或全草,洗凈,晾干[4],全草入藥,消炎鎮(zhèn)痛,治頭痛頭傷等。經(jīng)項目組調(diào)研整理發(fā)現(xiàn),虎耳草屬山地虎耳草在青海、甘肅、西藏等地區(qū)也常被歸為“蒂達(dá)”(俗稱“藏茵陳”)類藥材使用[5]。目前,關(guān)于山地虎耳草化學(xué)成分研究方面的文獻(xiàn)較少,主要集中在藥材資源整理、調(diào)查等方面[6-13],筆者尚未發(fā)現(xiàn)其有效成分分離鑒定、質(zhì)量控制等方面的文獻(xiàn)報道,而“蒂達(dá)”類藥材,如黃花獐牙菜、篦齒虎耳草的主要成分研究報道中涉及金絲桃苷及當(dāng)藥醇苷等成分的含量測定[8,14-15]。本研究建立薄層色譜法鑒別金絲桃苷,高效液相色譜法同時測定金絲桃苷、當(dāng)藥醇苷含量的測定方法,為山地虎耳草的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Waters 2695型高效液相色譜儀,Waters 2998 PDA detector型二極管陣列檢測器(美國沃特斯有限公司);ME204電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司,感量:0.1 mg];XS105DU分析天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司,感量:0.01 mg);SB25-12DT新芝超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司);Milli-Q2355超純水機(jī)(美國密理博公司)。

1.2試劑 金絲桃苷對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號:111521-201809,含量:94.9%);當(dāng)藥醇苷對照品(成都普菲德生物技術(shù)有限公司,批號:19041505,含量:99.27%)。甲醇(色譜純,德國默克股份兩合公司,批號:I1148507118),乙腈(色譜純,德國默克股份兩合公司,批號:JA098730),磷酸(色譜純,上海安譜科學(xué)儀器有限公司,批號:20510018),其余試劑為分析純;水為超純水;硅膠GF254預(yù)制薄層板(青島海洋化工有限公司,批號:20211221)。

1.3樣品 12批實(shí)驗用山地虎耳草藥材均由項目組人員分別于青海貴德縣拉脊山、湟中縣、同德縣、互助縣采集,經(jīng)青海省藥品審評核查中心劉海青主任藥師鑒定。樣品來源見表1,各批樣品經(jīng)粉碎后過孔徑(355±13) μm(三號)篩密封保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 山地虎耳草來源

2 方法與結(jié)果

2.1金絲桃苷薄層色譜鑒別 分別取樣品粉末約1.5 g,加丙酮30 mL,超聲處理(250 W,50 kHz)20 min,濾過,濾液蒸干,殘渣加甲醇1 mL使溶解,作為供試品溶液。再取金絲桃苷對照品,加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液,作為對照品溶液。照薄層色譜法(《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則0502)實(shí)驗,吸取上述13種溶液各5 μL,分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上,以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(20：12：4：4)上層溶液為展開劑,展開,取出,晾干,噴以含1%亞硝酸鈉的1%甲醇溶液,加熱至斑點(diǎn)顯色清晰,置紫外光燈(波長365 nm)下檢視。結(jié)果見圖1。供試品色譜中,在與金絲桃苷對照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。

1.對照品;2～13.山地虎耳草樣品(SDHEC1～SDHEC12)。

2.2金絲桃苷和當(dāng)藥醇苷含量測定

2.2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性實(shí)驗 Waters SunFire C18柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),以乙腈為流動相A,水(含0.05%磷酸)為流動相B,進(jìn)行梯度洗脫(0～10 min,90%→88% A;10～20 min,88%→85% A;20～25 min,85%→82% A;25～30 min,82%→76% A;30～35 min,76%→45% A;35～37 min,45%→40%A;37～40 min,40%→90%A;40～45 min,90% A);流速為1.0 mL·min-1;檢測波長:254 nm;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:10 μL。在此色譜條件下金絲桃苷、當(dāng)藥醇苷與樣品中其他成分分離度均>1.5,理論板數(shù)按金絲桃苷、當(dāng)藥醇苷峰計算分別不低于83 000和23 000。見圖2。

A.空白溶劑;B.對照品;C.樣品;1.金絲桃苷;2.當(dāng)藥醇苷。

2.2.2對照品儲備溶液的制備 取金絲桃苷對照品和當(dāng)藥醇苷對照品,精密稱定,分別為0.049 82 g和0.018 12 g,置10 mL量瓶,加甲醇超聲使溶解,并稀釋至刻度,搖勻,即得。對照品儲備溶液濃度分別為4.982,1.812 mg·mL-1。

2.2.3供試品溶液的制備 分別取“1.3”項下制備的樣品粉末約0.2 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇25.00 mL,稱定質(zhì)量,超聲處理30 min(功率250 W,頻率50 kHz),取出,放至室溫,再稱定質(zhì)量,用甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

2.2.4線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.2.2”項下金絲桃苷和當(dāng)藥醇苷對照品儲備溶液各0.25,0.50,1.00,1.50,2.00,3.00 mL,置50 mL量瓶中,加甲醇定容,搖勻,制成混合對照品溶液,按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)行分析,以峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo),對照品進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,金絲桃苷、當(dāng)藥醇苷的回歸方程、相關(guān)系數(shù)分別為Y=2 987 259.52X-2 091.48(r=0.999 9),Y=6 665 003.60X-558.68(r=0.999 9)。進(jìn)樣量分別在0.124 6～1.494 6 μg,0.045 3～0.543 6 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)行分析,當(dāng)信噪比(S/N)為3時對各組分最低檢出限進(jìn)行測定,當(dāng)S/N為10時對各組分定量限進(jìn)行測定,結(jié)果表明金絲桃苷、當(dāng)藥醇苷的最低檢出限分別為0.498,0.272 ng,定量限分別為1.993,0.680 ng。

2.2.5精密度實(shí)驗 精密吸取“2.2.4”項下對照品混合溶液,按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)行分析,連續(xù)進(jìn)樣6次,計算峰面積RSD分別為金絲桃苷0.65%,當(dāng)藥醇苷0.60%(n=6)。結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.2.6穩(wěn)定性實(shí)驗 取“2.2.3”項下同一供試品溶液(樣品編號:SDHEC11),分別在0,2,4,8,16,24 h按“2.2.1”項色譜條件進(jìn)行分析,進(jìn)樣體積均為10 μL,記錄峰面積,結(jié)果金絲桃苷峰面積RSD為0.32%,當(dāng)藥醇苷峰面積RSD為1.59%(n=6)。結(jié)果表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7重復(fù)性實(shí)驗 取山地虎耳草樣品(樣品編號:SDHEC11)6份,按“2.2.3”項下方法制備成供試品溶液,按“2.2.1”項色譜條件進(jìn)行分析,測定金絲桃苷、當(dāng)藥醇苷的平均含量分別為0.438 3%,0.003 8%,RSD分別為0.77%,2.03%(n=6)。結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.8回收率實(shí)驗 取山地虎耳草樣品(樣品編號:SDHEC11)6份,每份約0.1 g,精密稱定,置錐形瓶中;精密量取“2.2.2”項金絲桃苷和藥醇苷對照品儲備溶液1.25,0.10 mL,置10 mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻;分別在6份供試品中精密加入上述対照品混合溶液1.00 mL,按“2.2.3”項方法制成供試品溶液,按“2.2.1”項色譜條件進(jìn)行分析,測得金絲桃苷、當(dāng)藥醇苷的量,計算加樣回收率,平均回收率分別為93.01%,90.95%;RSD分別為0.72%,1.27%(n=6)。結(jié)果表明該方法的回收率良好。

2.2.9樣品含量測定 分別取“1.3”項下制備的樣品粉末約0.2 g,精密稱定,按“2.2.3”項下方法制備成供試品溶液,然后按“2.2.1”項色譜條件進(jìn)行分析,經(jīng)二極管陣列檢測器檢測檢測以上2種待測成分,比對樣品與對照品紫外光譜一致后,按外標(biāo)法以峰面積積分值計算,得2種待測組分的百分含量,見表2。

表2 山地虎耳草中金絲桃苷和當(dāng)藥醇苷含量測定結(jié)果

3 討論

3.1指標(biāo)成分的選擇 本項目前期研究對山地虎耳草進(jìn)行化學(xué)成分分離分析,成功分離出獐牙菜苦苷、綠原酸、當(dāng)藥苷、金絲桃苷和當(dāng)藥醇苷5種成分。分析結(jié)果顯示,12批樣品中僅3批檢出當(dāng)藥苷,不同批次的樣品5種成分的含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別是0.026 6%～0.245 2%,0.032 1%～0.389 6%,0.017 1%～0.057 1%,0.201 4%～0.762 8%和0.004 1%～0.227 3%,其中獐牙菜苦苷和綠原酸雖然平均含量較大,但不同批次樣品中含量差別顯著。相比之下,選擇金絲桃苷和當(dāng)藥醇苷2種成分作為檢測指標(biāo),對山地虎耳草的實(shí)驗室質(zhì)量控制、生產(chǎn)加工和臨床用藥指導(dǎo)更有實(shí)際意義。

另一方面,在藏、蒙醫(yī)藥臨床應(yīng)用中,山地虎耳草被廣泛作為“蒂達(dá)”類常用藥材,全草入藥,具有清熱利膽、舒肝健胃、解毒等功效,臨床上常用于治療急性黃疸型肝炎、膽囊炎、流行性感冒等疾病[16];現(xiàn)代藥理實(shí)驗證明金絲桃苷能顯著提高抗氧化酶的活力,在保護(hù)心腦缺血-再灌注損傷的同時,能增強(qiáng)免疫,保護(hù)肝臟,抗抑郁[17-18],還具有抗乙型肝炎病毒[19-20]、抗炎癥與抗血栓作用[21];當(dāng)藥醇苷主要功能是減輕肝細(xì)胞的損傷,有效抑制炎癥遞質(zhì)(腫瘤壞死因子)的形成,減輕細(xì)胞間質(zhì)的炎癥反應(yīng),促進(jìn)受損肝細(xì)胞的修復(fù)[22];這與山地虎耳草的臨床主治功能相吻合。

綜合上述原因,最終確定以金絲桃苷作為薄層鑒別定性檢測指標(biāo)、金絲桃苷和當(dāng)藥醇苷作為山地虎耳草的定量檢測指標(biāo)。

3.2薄層色譜鑒別的考察 針對不同極性提取溶劑(甲醇、丙酮、乙酸乙酯),不同提取方法(冷浸、超聲、回流),不同提取時間(10,20,30 min),不同展開劑[三氯甲烷-甲醇-水-冰醋酸(65：35：4：1),乙酸乙酯-冰醋酸-水(8：1：1),乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(10：6：1：2)的上層溶液],不同顯色劑(5%亞硝酸鈉的5%甲醇溶液、三氯化鋁試液),不同薄層板(硅膠G薄層板、硅膠GF254薄層板、聚酰胺薄膜)進(jìn)行比較考察。根據(jù)色譜分離效果、斑點(diǎn)顯色結(jié)果,最終確定適宜的樣品制備方法和薄層色譜展開條件,該條件重復(fù)性較好,層析的結(jié)果穩(wěn)定,斑點(diǎn)清晰一致。

3.3含量測定色譜系統(tǒng)的優(yōu)化

3.3.1測定波長的選擇 采用光電二極管陣列檢測器(DAD)對樣品進(jìn)行全波長190～800 nm掃描,對不同波長下色譜圖中金絲桃苷和當(dāng)藥醇苷的出峰情況、峰形大小、吸收峰的數(shù)量及強(qiáng)弱進(jìn)行對比分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在波長254 nm下檢測時,上述2種化學(xué)成分可以較好地表達(dá),因此選擇254 nm為檢測波長。

3.3.2色譜柱的選擇 采用3種C18色譜柱,Waters SunFire(4.6 mm×150 mm,5 μm)、Shimadzu Inertsil ODS-SP(4.6 mm×250 mm,5 μm)、Waters XBridge(4.6 mm×250 mm,5 μm),分離金絲桃苷和當(dāng)藥醇苷,結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離效果均較好、分離度及理論板數(shù)均達(dá)到要求,因此選擇保留時間短的色譜柱。

3.3.3流動相體系的選擇 采用3種不同梯度體系分離金絲桃苷和當(dāng)藥醇苷,綜合比較分離效果、峰形大小等因素,最終確定以第2種梯度體系即“2.2.1”項下梯度體系作為流動相。

3.3.4提取溶劑比較 采用甲醇、丙酮、乙酸乙酯3種溶劑,取樣品粉末約0.2 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入上述溶液25.00 mL,稱定質(zhì)量,超聲處理30 min。結(jié)果表明甲醇提取效率最高,因此選用甲醇作為提取溶劑。

3.3.5提取時間比較 取樣品粉末約0.2 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇25.00 mL,分別采用超聲15,20,30,45 min提取。結(jié)果表明提取時間45 min較30 min,提取出含量并無顯著上升,因此選超聲提取30 min作為提取時間。

3.4結(jié)果分析 測定結(jié)果顯示,不同產(chǎn)地、不同批次,以及不同采收期山地虎耳草中金絲桃苷、當(dāng)藥醇苷的含量有一定差異。青?；ブh的樣品中金絲桃苷含量普遍較高,3份樣品平均含量為0.691 1%;當(dāng)藥醇苷含量較高的樣品均產(chǎn)于青海同德縣,該產(chǎn)地5份樣品平均含量為0.102 2%;表明山地虎耳草生長的地理位置環(huán)境對其有效成分含量有一定影響,可考慮在上述區(qū)域進(jìn)行采收。采收于果期的樣品3中兩種成分的含量明顯較低,可考慮應(yīng)在花期進(jìn)行采收。

后續(xù)研究中將在采收時記錄產(chǎn)地坐標(biāo)和采收期的詳細(xì)信息,進(jìn)一步分析不同產(chǎn)地及不同采收期對山地虎耳草中金絲桃苷、當(dāng)藥醇苷含量差異的影響,并繼續(xù)擴(kuò)大采樣范圍,增加樣品批次,對顯微鑒別、水分、灰分及浸出物項目進(jìn)行質(zhì)量控制方法的探索,初步建立山地虎耳草的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

雖然各地在“蒂達(dá)”的臨床使用方面已有習(xí)用藥材及特色的治療體系,且大部分地區(qū)已找到合適的優(yōu)勢基原品種替代品,但由于藏區(qū)部分地區(qū)交通不便以及各民族語言差異等,各地市場流通、醫(yī)療機(jī)構(gòu)及制藥企業(yè)使用的基原植物并不統(tǒng)一[23];同時,有關(guān)藥材的質(zhì)量、等級、有效性與安全性仍缺乏統(tǒng)一完善的評價標(biāo)準(zhǔn),導(dǎo)致臨床用藥沒有統(tǒng)一規(guī)范,藥材及成藥制劑出現(xiàn)混用亂用現(xiàn)象[24],存在一定的用藥安全風(fēng)險,為了確保更加有效、安全的臨床用藥,本文建立 “蒂達(dá)”類常用藥材山地虎耳草的薄層色譜定性鑒別法,并采用高效液相色譜法,建立同時測定山地虎耳草中金絲桃苷和當(dāng)藥醇苷2種成分的定量分析方法。本研究結(jié)果利用現(xiàn)代檢驗檢測技術(shù)手段,對傳統(tǒng)藏藥材進(jìn)行定性、定量分析,能夠客觀、科學(xué)、快速、準(zhǔn)確地作出評價,對山地虎耳草藥材的生產(chǎn)加工、臨床使用和質(zhì)量控制均具有一定的參考價值,為“蒂達(dá)”類藥材的綜合質(zhì)量評價及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化的研究提供了實(shí)驗數(shù)據(jù),也為廣大人民群眾的用藥有效性和安全性提供前期理論研究依據(jù)。