枳漆酶基因家族鑒定及其響應(yīng)鹽脅迫的表達(dá)分析

徐小勇 顧銘洲 梁夢(mèng)鴿 姜麗娟

摘要：漆酶（LAC）是植物木質(zhì)素生物合成中催化木質(zhì)素單體聚合的關(guān)鍵酶，在調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫響應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。對(duì)枳漆酶基因家族進(jìn)行鑒定和分析，并探究其在鹽脅迫下的表達(dá)模式，可為進(jìn)一步研究枳漆酶基因功能提供重要的參考信息。采用生物信息學(xué)手段鑒定枳漆酶基因家族成員，對(duì)其家族成員的理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、啟動(dòng)子順式作用元件等進(jìn)行分析，并通過(guò)qRT-PCR方法分析其鹽脅迫表達(dá)模式。結(jié)果表明，枳基因組中共有20個(gè)LAC基因家族成員，其中18個(gè)分布在5條已知染色體上，2個(gè)分布在未知染色體上，被預(yù)測(cè)定位到細(xì)胞膜和細(xì)胞核中；共有6～14個(gè)外顯子，5～13個(gè)內(nèi)含子，9～11個(gè)motif；系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示，20個(gè)枳LAC基因家族成員與17個(gè)擬南芥LAC基因家族成員共分成7個(gè)亞組，20個(gè)枳LAC基因家族成員分布在其中的6組；20個(gè)枳LAC基因家族成員與擬南芥LAC基因間存在19對(duì)共線(xiàn)性關(guān)系；啟動(dòng)子區(qū)域含有24種順式作用元件，其中厭氧誘導(dǎo)元件、干旱響應(yīng)元件和茉莉酸甲酯響應(yīng)元件數(shù)量最多；16個(gè)枳LAC基因在鹽脅迫下顯著上調(diào)表達(dá)，推測(cè)枳漆酶基因參與了鹽脅迫響應(yīng)。

關(guān)鍵詞：枳；漆酶基因；進(jìn)化樹(shù)；順式作用元件；鹽脅迫

中圖分類(lèi)號(hào)：S188+.3??文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A??文章編號(hào)：1002-1302（2023）09-0052-08

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（編號(hào)：2018YFD1000107）；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金［編號(hào)：CX（21）3024］。

作者簡(jiǎn)介：徐小勇（1979—），男，江西奉新人，博士，副教授，主要從事果樹(shù)生物技術(shù)研究。E-mail：xyxu@yzu.edu.cn。

漆酶（Laccase，LAC，EC 1.10.3.2）是一種含銅的多酚氧化酶，屬于銅藍(lán)氧化酶家族，可催化酚類(lèi)等多種底物的氧化，并將氧氣還原成水［1］。漆酶最早在1883年由日本學(xué)者Yoshida從漆樹(shù)的漆液中發(fā)現(xiàn)［2］，之后在細(xì)菌、真菌、昆蟲(chóng)和其他植物中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)［3］。已有研究發(fā)現(xiàn)，漆酶參與植物細(xì)胞壁木質(zhì)素生物合成途徑的最后階段，即木質(zhì)素單體的聚合［4］。因此，漆酶在植物生長(zhǎng)發(fā)育、生物和非生物脅迫響應(yīng)中具有重要的調(diào)控作用［4］。

漆酶由多基因編碼，隨著眾多植物基因組數(shù)據(jù)的公布，不少物種已經(jīng)完成了漆酶基因家族的鑒定。例如，在模式植物擬南芥中，17個(gè)漆酶基因被鑒定出來(lái)，其中AtLAC4、AtLAC11和AtLAC17與木質(zhì)素合成有關(guān)［5-6］；在水稻（Oryza sativa）基因組中，共有30個(gè)LAC［7］；在柳枝稷草（Panicum virgatum）中共鑒定出49個(gè)LAC［8］；在梨（Pyrus bretschneideri）中共鑒定出40個(gè)LAC［9］；在茶樹(shù)（Camellia sinensis）中共鑒定出43個(gè)LAC［10］；在荔枝（Litchi chinensi）中共鑒定出61個(gè)LAC［11］；在桃（Prunus persica）、茄（Solanum melongena）中皆鑒定出48個(gè)LAC［12-13］。值得注意的是，漆酶基因在逆境脅迫中的作用正獲得越來(lái)越多的關(guān)注。一般而言，漆酶基因在脅迫下會(huì)富集表達(dá)，特別是在鹽脅迫條件下。例如，玉米ZmLAC1、擬南芥AtLAC2、水稻OsChI1和胡蘿卜DcLAC1在鹽脅迫下都顯著上調(diào)表達(dá)，而過(guò)表達(dá)漆酶基因能提高植物的耐鹽性［14-17］。

柑橘是世界第一大果樹(shù)，也是我國(guó)栽培面積最大、經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的果樹(shù)。然而柑橘以露地栽培為主且對(duì)環(huán)境條件要求較高，易受多種生物、非生物逆境脅迫的影響，極大程度地限制了我國(guó)柑橘產(chǎn)業(yè)的良性健康發(fā)展。因此，亟待開(kāi)展柑橘抗逆基因挖掘與鑒定研究［18-21］。枳是蕓香科枳屬小喬木，具有抗寒、抗旱、適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是我國(guó)目前應(yīng)用最多、最廣的柑橘砧木。本研究根據(jù)已公布的枳基因組數(shù)據(jù)［22］，采用生物信息學(xué)手段鑒定枳漆酶基因家族成員，分析其理化特征、基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、啟動(dòng)子順式作用元件和鹽脅迫表達(dá)模式，以期挖掘與鹽脅迫響應(yīng)相關(guān)的漆酶基因，為枳LAC基因功能研究提供理論基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

本試驗(yàn)于2022年3月在揚(yáng)州大學(xué)園藝園林學(xué)院實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成。

1.2?枳漆酶基因家族的鑒定

枳（Poncirus trifoliata L.）基因組序列、蛋白質(zhì)序列及其注釋信息均下載自CPBD數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//citrus.hzau.edu.cn/）。從植物參考基因組數(shù)據(jù)庫(kù)Ensembl（http：//plants.ensembl.org）中下載擬南芥的基因組相關(guān)數(shù)據(jù)（基因組序列和注釋信息）。

以擬南芥的17個(gè)LAC蛋白序列作為查詢(xún)序列，設(shè)置檢索閾值（E-value）為10-5，通過(guò)TBtools軟件的BLAST功能搜索枳蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得候選枳LAC蛋白序列，通過(guò)NCBI、SMART數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//smart.embl-heidelberg.de/）進(jìn)行蛋白保守結(jié)構(gòu)域的鑒定。通過(guò)在線(xiàn)工具Expasy-ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）對(duì)枳LAC基因家族成員進(jìn)行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測(cè)。使用在線(xiàn)軟件Plant-mPLoc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）對(duì)枳LAC蛋白家族進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

1.3?枳LAC基因家族基因結(jié)構(gòu)和motif 分析

通過(guò)在線(xiàn)工具M(jìn)EME（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）進(jìn)行motif分析，motif數(shù)目設(shè)置為10個(gè)，其他均為默認(rèn)值，利用TBtools軟件對(duì)基因結(jié)構(gòu)和motif數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化作圖。

1.4?枳和擬南芥LAC基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

使用枳、擬南芥的LAC蛋白序列，用Mega X進(jìn)行多序列比對(duì)，并用最大似然法（Maximum likelihood，ML）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，Bootstrap參數(shù)設(shè)置為1 000，其他參數(shù)選擇默認(rèn)值。用Evolview在線(xiàn)軟件對(duì)系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)進(jìn)行編輯和美化。

1.5?枳和擬南芥LAC基因家族的共線(xiàn)性分析

用MCScanX 程序?qū)﹁?、擬南芥的基因組信息進(jìn)行比對(duì)，并通過(guò)TBtools軟件的Multiple SystenyPlot工具分析其共線(xiàn)性關(guān)系。

1.6?枳LAC基因啟動(dòng)子順式作用元件分析

選取枳LAC基因轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游2 000 bp的序列作為啟動(dòng)子區(qū)域，利用在線(xiàn)工具PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）獲得每個(gè)枳LAC基因啟動(dòng)子區(qū)域中所有的順式作用元件，并篩選出重要的響應(yīng)元件，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.7?植物材料和鹽脅迫處理

選擇發(fā)育一致的45日齡枳幼苗，將幼苗在含有300 mmol/L氯化鈉的溶液中進(jìn)行鹽脅迫處理，處理后0～5 d采收根系。所有樣本直接收集到液氮中，于-80 ℃保存，直至提取RNA。每個(gè)試驗(yàn)設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)采5株幼苗樣品。

1.8?RNA提取和qRT-PCR檢測(cè)

采用乙二胺四乙酸（EDTA）法提取總RNA，用凝膠電泳和生物分析儀檢測(cè)RNA質(zhì)量，用TransScript逆轉(zhuǎn)錄酶（TaKaRa公司產(chǎn)品），具體操作參照制造商的說(shuō)明書(shū)。qRT-PCR的基因特異性引物序列見(jiàn)表1。以2 μL cDNA為模板，用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ Plus （2×）（TaKaRa公司產(chǎn)品）進(jìn)行25 μL PCR反應(yīng)，每個(gè)引物濃度為10 μmol/L。采用CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（BIO-RAD）進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，以柑橘β肌動(dòng)蛋白基因（ACTB）為內(nèi)控基因。反應(yīng)過(guò)程如下：95 ℃預(yù)變性 3 min；95 ℃延伸時(shí)間30 s，根據(jù)特定引物設(shè)置的退火溫度（T）下退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)束后，于65～95 ℃進(jìn)行熔化曲線(xiàn)分析。所有qRT-PCR分析重復(fù)3次。采用2ΔΔCT法評(píng)估基因的表達(dá)水平。

2?結(jié)果與分析

2.1?LAC基因家族成員鑒定及其對(duì)應(yīng)蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測(cè)

通過(guò)BLAST和保守結(jié)構(gòu)域鑒定方法，共在枳基因組中發(fā)現(xiàn)20個(gè)LAC基因成員（表2），根據(jù)其在染色體的分布將其命名為PtrLAC1～PtrLAC20（圖1）。其中，PtrLAC1位于3號(hào)染色體上，PtrLAC2、PtrLAC3位于4號(hào)染色體上，PtrLAC4、PtrLAC5位于5號(hào)染色體上，PtrLAC6～PtrLAC13位于6號(hào)染色體上，PtrLAC14～PtrLAC18位于8號(hào)染色體上，PtrLAC19、PtrLAC20位于未知染色體上。枳LAC基因編碼的氨基酸長(zhǎng)度介于553～1 112之間，相對(duì)分子量介于60.55～120.82之間，等電點(diǎn)介于5.02～9.88之間，親水性介于-0.247～0.000之間。此外，枳LAC蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)位于26.00～38.14范圍，都低于40.00，表明這20個(gè)LAC基因成員都是穩(wěn)定的。用在線(xiàn)軟件Plant-mPLoc進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，所有枳LAC蛋白都位于細(xì)胞膜上，此外，發(fā)現(xiàn)PtrLAC7位于細(xì)胞核上。這揭示枳LAC蛋白可能參與細(xì)胞壁的木質(zhì)素合成。

2.2?枳PtrLAC基因結(jié)構(gòu)和motif分析

如圖2所示，枳LAC基因共有6～14個(gè)外顯子、5～13個(gè)內(nèi)含子?？傮w而言，基因之間的基因結(jié)構(gòu)差異較小，多數(shù)為6個(gè)外顯子、5個(gè)內(nèi)含子。基因結(jié)構(gòu)比較特殊的基因?yàn)镻trLAC7、PtrLAC13，有較多外顯子、內(nèi)含子。Motif分析發(fā)現(xiàn)，枳LAC蛋白含有 9～11個(gè)motif。除PtrLAC7、PtrLAC13外，所有枳LAC蛋白具有相同Motif。有趣的是，PtrLAC13缺失motif 2，而PtrLAC7相較于其他枳LAC基因家族成員多1個(gè)motif 8。

2.3?系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)及共線(xiàn)性分析

為了探究枳PtrLAC基因與模式植物擬南芥的進(jìn)化關(guān)系，構(gòu)建它們的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖3）。根據(jù)進(jìn)化樹(shù)的結(jié)果，將其分為7個(gè)亞組。PtrLAC10、PtrLAC11、PtrLAC12、PtrLAC14、PtrLAC15、PtrLAC16、PtrLAC19和PtrLAC20在第1組；PtrLAC3、PtrLAC6、PtrLAC13和PtrLAC17在第2組；PtrLAC1在第4組；PtrLAC7、PtrLAC8和PtrLAC9在第5組；PtrLAC4在第6組；PtrLAC2、PtrLAC5和PtrLAC18在第7組。上述結(jié)果表明，枳LAC基因家族可能存在功能多樣性。共線(xiàn)性分析結(jié)果顯示，枳和擬南芥LAC基因間存在19對(duì)共線(xiàn)性關(guān)系（圖4），暗示這些LAC基因?qū)赡軄?lái)自共同的祖先，具有相似的功能。

2.4?啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件分析

順式作用元件分析結(jié)果表明，枳LAC基因啟動(dòng)子區(qū)域共有24種順式作用元件，包括生長(zhǎng)發(fā)育元件、激素響應(yīng)元件和逆境響應(yīng)元件三大類(lèi)型（圖5）。其中逆境響應(yīng)元件類(lèi)型最多，共有11個(gè)。生長(zhǎng)發(fā)育元件主要有分生組織特異性元件（CAT-box，70% LAC成員）和玉米醇溶蛋白代謝調(diào)控元件（O2-site，35% LAC成員）。激素響應(yīng)元件主要有茉莉酸甲酯響應(yīng)元件（CGTCA-motif或TGACG-motif，90% LAC成員）、脫落酸響應(yīng)元件（ABRE，80% LAC成員）和生長(zhǎng)素響應(yīng)元件（AuxRR-core，50% LAC成員），表明枳LAC基因可能受到多種激素的調(diào)控表達(dá)。逆境響應(yīng)元件主要有厭氧誘導(dǎo)元件（ARE，所有LAC成員）、干旱響應(yīng)元件（MBS，90% LAC成員）和低溫響應(yīng)元件（LTR，50% LAC成員），暗示枳LAC基因可能響應(yīng)多種逆境脅迫。

2.5?鹽脅迫處理對(duì)枳LAC基因表達(dá)的影響

已有研究發(fā)現(xiàn)，多種植物的LAC基因在鹽脅迫下誘導(dǎo)表達(dá)［14-17］。因此，本研究采用qRT-PCR方法分析所有枳LAC基因在鹽脅迫處理下的表達(dá)模式。如圖6所示，鹽脅迫處理使得80%的枳LAC基因在不同時(shí)間點(diǎn)顯著上調(diào)表達(dá)，其中多數(shù)集中在處理后第1天（PtrLAC3、PtrLAC5、PtrLAC6、PtrLAC10、PtrLAC11、PtrLAC13、PtrLAC15和PtrLAC18）和第5天（PtrLAC1、PtrLAC4、PtrLAC9、PtrLAC14和PtrLAC19），僅PtrLAC2、PtrLAC7、PtrLAC12、PtrLAC17的相對(duì)表達(dá)量出現(xiàn)下調(diào)。值得注意的是，PtrLAC9的相對(duì)表達(dá)量在處理5 d時(shí)急劇升高（約為初始值的47倍）。由此推測(cè)，PtrLAC9基因是鹽脅迫響應(yīng)的關(guān)鍵LAC基因之一。

3?討論與結(jié)論

植物漆酶參與木質(zhì)素單體的聚合，從而影響木質(zhì)素合成和組分，在植物的生長(zhǎng)和發(fā)育、應(yīng)答生物或非生物脅迫反應(yīng)中具有重要調(diào)控作用。迄今，尚未見(jiàn)關(guān)于枳漆酶基因家族的研究報(bào)道。本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法在枳中共鑒定出20個(gè)LAC基因（PtrLAC1～PtrLAC20）。但對(duì)多數(shù)植物而言，枳LAC基因成員的數(shù)目較少［7-13］。枳LAC基因在染色體上的分布不均勻，較集中在第6號(hào)、8號(hào)染色體上，與甜橙LAC基因的染色體定位一致［23］；共有6～14個(gè)外顯子、9～11個(gè)motif，主要定位在細(xì)胞膜上，這些特征在不同物種之間的差異較大［7-13，23］。值得注意的是，PtrLAC7定位到細(xì)胞膜和細(xì)胞核上，且多1個(gè)motif 8，暗示該基因可能具有特殊功能。

在本研究中，枳LAC基因啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件分析結(jié)果顯示，其啟動(dòng)子區(qū)域含有24種順式作用元件，包括生長(zhǎng)發(fā)育元件、激素響應(yīng)元件和逆境響應(yīng)元件，暗示著枳LAC基因可能受到多種植物激素和環(huán)境逆境誘導(dǎo) 并參與植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程調(diào)

控。對(duì)于不同植物而言，LAC基因啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件在數(shù)量、種類(lèi)上具有一定差異，尤其是富集的順式作用元件種類(lèi)［8，10，24］。例如，茶樹(shù)LAC基因主要富集厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件、茉莉酸甲酯和乙烯響應(yīng)元件［10］；多數(shù)柳枝稷草LAC基因存在脫落酸響應(yīng)元件、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件和干旱響應(yīng)元件［8］；枳LAC基因富含干旱響應(yīng)元件、厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件和茉莉酸甲酯響應(yīng)元件。但上述預(yù)測(cè)的順式作用元件有待通過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證。

系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析將20個(gè)枳LAC基因家族成員與17個(gè)擬南芥LAC基因家族成員分成7個(gè)亞組，與前人的研究結(jié)果［9，23］一致。同一亞組的枳LAC基因與擬南芥LAC基因可能具有相同或相似的功能?？紤]到AtLAC4、AtLAC11和AtLAC17與木質(zhì)素合成有關(guān)，筆者推測(cè)PtrLAC6和PtrLAC17（與AtLAC4聚類(lèi)）、PtrLAC13（與AtLAC11聚類(lèi)）及PtrLAC14和PtrLAC15（與AtLAC17聚類(lèi)）參與枳木質(zhì)素生物合成。此外，AtLAC7、AtLAC8和AtLAC9這3個(gè)基因在缺鐵、創(chuàng)傷或鹽脅迫下上調(diào)表達(dá)［25］。因此，我們預(yù)測(cè)同一亞組下的PtrLAC7、PtrLAC8和PtrLAC9可能與脅迫響應(yīng)相關(guān)。本研究的qRT-PCR分析結(jié)果顯示，PtrLAC8、PtrLAC9在鹽脅迫下顯著上調(diào)表達(dá)，而PtrLAC7顯著下調(diào)表達(dá)，可見(jiàn)這3個(gè)基因確實(shí)與鹽脅迫響應(yīng)相關(guān)，但它們是否參與枳鹽脅迫響應(yīng)調(diào)控尚不清楚。目前筆者所在本課題組正在進(jìn)行PtrLAC9的功能鑒定研究，有望進(jìn)一步揭示其功能。

參考文獻(xiàn)：

［1］Giardina P，F(xiàn)araco V，Pezzella C，et al. Laccases：a never-ending story［J］. Cellular and Molecular Life Sciences，2020，67（3）：369-385.

［2］Yoshida H. LXIII.-Chemistry of lacquer （Urushi）. Part Ⅰ. communication from the chemical society of Tokio［J］. Journal of the Chemical Society，Transactions，1883，43：472-486.

［3］Janusz G，Pawlik A，Swiderska-burek U，et al. Laccase properties，physiological functions，and evolution［J］. International Journal of Molecular Sciences，2020，21（3）：25.

［4］Wang J H，F(xiàn)eng J J，Jia W T，et al. Lignin engineering through laccase modification：a promising field for energy plant improvement［J］. Biotechnology for Biofuels，2015，8：145.

［5］Berthet S，Demont-Caulet N，Pollet B，et al. Disruption of LACCASE4 and 17 results in tissue-specific alterations to lignification of Arabidopsis thaliana stems［J］. The Plant Cell，2011，23（3）：1124-1137.

［6］Zhao Q，Nakashima J，Chen F，et al. LACCASE is necessary and nonredundant with PEROXIDASE for lignin polymerization during vascular development in Arabidopsis［J］. The Plant Cell，2013，25（10）：3976-3987.

［7］Liu Q Q，Luo L，Wang X X，et al. Comprehensive analysis of rice laccase gene （OsLAC） family and ectopic expression of OsLAC10 enhances tolerance to copper stress in Arabidopsis［J］. International Journal of Molecular Sciences，2017，18（2）：e209.

［8］Li R，Zhao Y，Sun Z，et al. Genome-wide identification of switchgrass laccases involved in lignin biosynthesis and heavy-metal responses［J］. International Journal of Molecular Sciences，2022，23：6530.

［9］Lu C Y，Yang T Y，Zhang Y W，et al. Genome-wide analyses and expression patterns under abiotic stress of LAC gene family in pear （Pyrus bretschneideri）［J］. Plant Biotechnology Reports，2021，15（3）：403-416.

［10］Yu Y C，Xing Y X，Liu F J，et al. The laccase gene family mediate multi-perspective trade-offs during tea plant （Camellia sinensis） development and defense processes［J］. International Journal of Molecular Sciences，2022，22（22）：12554.

［11］李鄭華，姜成東，王?鵬，等. 荔枝漆酶（LAC）基因家族鑒定及表達(dá)分析［J/OL］. 分子植物育種，2022：1-22. ［2022-11-03］.https：//kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.s.20220507.1344.008.html.

［12］Qui K，Zhou H，Pan H，et al. Genome-wide identification and functional analysis of the peach （P. persica） laccase gene family reveal members potentially involved in endocarp lignification［J］. Trees，2022，36：1477-1496.

［13］Wan F X，Zhang L Q，Tan M Y，et al. Genome-wide identification and characterization of laccase family members in eggplant （Solanum melongena L.）［J］. Peer J，2022，10：e12922.

［14］Liang M X，Haroldsen V，Cai X N，et al. Expression of a putative laccase gene，ZmLAC1，in maize primary roots under stress［J］. Plant Cell and Environment，2006，29（5）：746-753.

［15］Cai X N，Davis E J，Ballif J，et al. Mutant identification and characterization of the laccase gene family in Arabidopsis［J］. Journal of Experimental Botany，2006，57（11）：2563-2569.

［16］Cho H Y，Lee C，Hwang S G，et al. Overexpression of the OsChI1 gene，encoding a putative laccase precursor，increases tolerance to drought and salinity stress in transgenic Arabidopsis［J］. Gene，2014，552（1）：98-105.

［17］Ma J，Xu Z S，Wang F，et al. Isolation，purification and characterization of two laccases from carrot （Daucus carota L.） and their response to abiotic and metal ions stresses［J］. Protein Journal，2015，34（6）：444-452.

［18］Huang X S，Wang W，Zhang Q，et al. A basic helix-loop-helix transcription factor，PtrbHLH，of Poncirus trifoliata confers cold tolerance and modulates peroxidase-mediated scavenging of hydrogen peroxide［J］. Plant Physiology，2013，162（2）：1178-1194.

［19］Dai W S，Wang M，Gong X Q，et al. The transcription factor FcWRKY40 of Fortunella crassifolia functions positively in salt tolerance through modulation of ion homeostasis and proline biosynthesis by directly regulating SOS2 and P5CS1 homologs［J］. New Phytologist，2018，219（3）：972-989.

［20］Khan M，Hu J B，Dahro B，et al. ERF108 from Poncirus trifoliata （L.） Raf. functions in cold tolerance by modulating raffinose synthesis through transcriptional regulation of PtrRafS［J］. Plant Journal，2021，108（3）：705-724.

［21］Zhang Y，Ming R H，Khan M，et al. ERF9 of Poncirus trifoliata （L.） Raf. undergoes feedback regulation by ethylene and modulates cold tolerance via regulating a glutathione S-transferase U17 gene［J］. Plant Biotechnol Journal，2022，20（1）：183-200.

［22］Huang Y，Xu Y T，Jiang X L，et al. Genome of a citrus rootstock and global DNA demethylation caused by heterografting［J］. Horticulture Research，2021，8 （1）：69.

［23］Xu X Y，Zhou Y P，Wang B，et al. Genome-wide identification and characterization of laccase gene family in Citrus sinensis［J］. Gene，2019，689：114-123.

［24］Sun Z，Zhou Y，Hu Y，et al. Identification of wheat LACCASEs in response to Fusarium graminearum as potential deoxynivalenol trappers［J］. Frontiers in Plant Science，2022，13：832800.

［25］Turlapati P V，Kim K W，Davin L B，et al. The laccase multigene family in Arabidopsis thaliana：towards addressing the mystery of their gene function（s）［J］. Planta，2011，233（3）：439-470.