宋曉霞 ,劉玉玲 ,張琦

1鄭州人民醫(yī)院 婦產(chǎn)科,鄭州 450053;2 鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科,鄭州 450000;3 重慶市長(zhǎng)壽區(qū)婦幼保健院,重慶401200

子宮內(nèi)膜癌(Endometrial Cancer,EC)是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤,我國(guó)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率位居女性惡性腫瘤的第二位,隨著我國(guó)人口老齡化的加劇,其發(fā)病率和死亡率均呈逐年上升趨勢(shì)[1-2]。目前,子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病和轉(zhuǎn)移機(jī)制尚不清楚。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,LncRNA)是一類長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸,不編碼蛋白質(zhì)的功能性RNA 分子[3-4]。雖然LncRNA 不具有編碼蛋白質(zhì)的功能,但能夠通過調(diào)節(jié)m RNA 剪切、降解和翻譯等生理過程發(fā)揮作用[5]。序列相似性家族83成員H 反義RNA 1(FAM83H-AS1)是一種與癌癥進(jìn)展密切相關(guān)的Lnc RNA,其異常的高表達(dá)水平與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。目前還沒有FAM83H-AS1在子宮內(nèi)膜癌中的作用及其機(jī)制相關(guān)研究,FAM83 H-AS1對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用仍不清楚。本研究主要通過檢測(cè)人子宮內(nèi)膜癌組織及癌旁組織中LncRNAFAM83HAS1的表達(dá)水平,并通過細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證LncRNAFAM83H-AS1對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料

本研究搜集2018年10月至2020年10月就診于鄭州人民醫(yī)院的39例子宮內(nèi)膜癌患者的腫瘤組織以及配對(duì)的癌旁組織,其中包括子宮內(nèi)膜樣癌20例(其中G1 5例,G2 7例,G3 8例),非內(nèi)膜樣癌19例(其中包括漿液性癌10例,粘液性癌5例,透明細(xì)胞癌4例)。組織標(biāo)本于手術(shù)期間取得,并立即在-80 ℃下冷凍直到下一步使用。在實(shí)驗(yàn)樣本收集之前,從每個(gè)參與者處獲得了書面知情同意,研究方案經(jīng)鄭州人民醫(yī)院臨床研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)備案。

納入標(biāo)準(zhǔn):①年齡25～75歲;②符合《婦產(chǎn)科常見疾病指南》[5]中子宮內(nèi)膜癌診斷標(biāo)準(zhǔn);③經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診者;④入院前3個(gè)月無性激素類藥物治療史者;⑤術(shù)前未接受過放療、化療等抗腫瘤治療方案者;⑥依從性良好。

排除標(biāo)準(zhǔn):①腦外傷、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染引起的癡呆等;②精神疾病患者;③酗酒或藥物濫用史患者;④心肝腎嚴(yán)重功能障礙患者;⑤合并其他腫瘤性疾病者;⑥血液性系統(tǒng)疾病患者。

4種子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系(HEC-1B,HEC-1A,ishikawa以及RL-952)和1株正常子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞系(hEEC)購自湖南豐暉生物科技有限公司(湖南)。

1.2 主要方法

1.2.1 qRT-PCR

采用qRT-PCR 分析了在臨床上收集的39 例子宮內(nèi)膜癌患者的腫瘤組織以及配對(duì)的癌旁組織中FAM83H-AS1的表達(dá)水平。具體步驟:通過TRIzol試劑(Thermofisher scientific,USA)提取,并且使用NanoDrop 1 000 分光光度計(jì)(Thermofisher scientific,USA)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。使用Agilent 2100生物分析儀(Agilent Technologies)評(píng)估提取的RNA 的質(zhì)量,使用PrimeScript synthesis cDNA kit(Takara Biotechnology,Japan)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,SYBR Green PCR Master Mix(Takara Biotechnology,Japan)進(jìn)行qPCR,將GAPDH mRNA含量標(biāo)準(zhǔn)化。引物序列如下:FAM83H-AS1:(R)5′-AGCTCCACCTCCCGGGTTCACG-3′(F)5′-CGTGAACCCGGGAGGTGGAGCT3′。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系按照說明書嚴(yán)格進(jìn)行。

1.2.2 構(gòu)建低表達(dá)FAM83H-AS1的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系

靶向FAM83H-AS1的shRNA 由生工生物科技有限公司(Sangon Biotech,Shanghai,China)合成,并插入p LKO.1-TRC克隆載體(Addgene)中,靶向序列分別為:′-CTTGCGATCGGGTCGATCGATCTTAGCTTTGCGA-3′ (shRNA1) 和 5′-GTCCGTAGCTAGCTAAAGTCGATTCGATCGTACAAGA -3′(shRNA-2)。另外將p LKO.1-TRC對(duì)照載體用作對(duì)照的空載體(命名為Scr-shRNA)。

1.2.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(CCK-8法)

轉(zhuǎn)染后24 h收集細(xì)胞并進(jìn)行重懸,將細(xì)胞密度為1×106個(gè)/m L,濃度為2×105個(gè)/m L 的單細(xì)胞懸液接種到96孔板中,并在細(xì)胞接種后96 h進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(CCK-8)測(cè)定(Beyotime,China)。96 h后取出孔板,將10μLCCK-8溶液添加到每個(gè)孔中并在37℃下孵育2 h后,使用酶標(biāo)儀(Bio-Rad Laboratories,USA)在450 nm 的波長(zhǎng)下分析細(xì)胞的增殖活性。將來自三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果取平均值進(jìn)行分析。

1.2.4 TUNEL染色

首先用PBS或HBSS洗滌一次。如果細(xì)胞貼得不牢,可以干燥樣品使細(xì)胞貼得更牢;用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min;用PBS或HBSS洗滌一次;加入含0.3% Triton X-100 的PBS,室溫孵育5 min;在樣品上加50μL TUNEL檢測(cè)液,37 ℃避光孵育60 min;PBS或HBSS洗滌3次。最后用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察?？梢允褂玫募ぐl(fā)波長(zhǎng)范圍為450-500 nm,發(fā)射波長(zhǎng)范圍為515-565 nm。

1.2.5 Ed U 染色

顯微鏡下觀察細(xì)胞,配制2×Ed U 工作液,加入2×Ed U 工作液,孵育-固定-棄去培養(yǎng)液,用4%多聚甲醛溶液來固定,固定時(shí)間20 min。洗滌-滲透劑-洗滌,Ed U 檢測(cè)。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)

使用胰酶消化細(xì)胞,1 000 rpm 離心收集所有細(xì)胞;使用4 ℃預(yù)冷的PBS 洗滌細(xì)胞2 次;用0.5 mL PBS懸浮細(xì)胞,緩慢加入到預(yù)冷的70%乙醇溶液中(用PBS配制,-20℃預(yù)冷),快速混勻,使用封口膜封口,-20℃固定過夜;將固定過的細(xì)胞以4℃,1 000 rpm,離心5 min,棄上清液,轉(zhuǎn)移到EP管中,用PBS洗滌2次。計(jì)數(shù)細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為1×106 個(gè)細(xì)胞/mL,取1mL進(jìn)行試驗(yàn)。4 ℃,1 000 rpm,離心5 min 取細(xì)胞沉淀;加入900μL PBS 緩沖液重懸細(xì)胞;加入100 μL RNaseA 溶液,使RNaseA 終濃度為100μg/mL),37℃孵育30min;4℃,1 000 rpmin離心5 min,棄去上清液;加入450μL PBS 懸浮細(xì)胞,加入450μL PI染液,避光冰置20 min;上流式細(xì)胞儀檢測(cè),分析記錄結(jié)果。

1.2.7 Transwell實(shí)驗(yàn)

采用了Transwell實(shí)驗(yàn)分析了HEC-1A 和HEC-1B細(xì)胞的遷移和侵襲能力的改變。Matrigel膠4℃過夜,提前開制冰機(jī),槍盒預(yù)冷。Matrigel膠的原液為8.6 mg/mL。用無血清培養(yǎng)基將Matrigel膠分別配制成100μg/mL和30μg/m L的溶液;向24孔板的每孔中加入400μL體積、濃度為30 mg/mL的Matrigel膠溶液,將transwell小室置于溶液內(nèi),再滴加200μL濃度為30 mg/mL的Matrigel膠溶液,冰上放置1 h后吸棄溶液、晾干;將100 ng/mL的Matrigel膠溶液吹打均勻后,吸取100 uL緩慢滴加于transwell上室基底膜上?；蝿?dòng)均勻后置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)放置0.5 h;將細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜;將小室放入含有600μL無血清培養(yǎng)基的24孔板小孔中后,放置孵育箱活化30 min以上;消化細(xì)胞,將其制成單細(xì)胞懸液,吸取1 mL至標(biāo)記好的1.5 mL EP管內(nèi),離心后用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液;取200μL細(xì)胞懸液加入到小室上室中,在小室的下室中加入600μL含15%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基,放于孵育箱中培養(yǎng)24 h;棄培養(yǎng)基,用含4%多聚甲醛的固定液室溫固定細(xì)胞20 min,接著用0.1%結(jié)晶紫染色20 min,然后用棉簽擦去小室上層細(xì)胞,沖洗晾干小室;于倒置顯微鏡下采集圖像(100×),隨機(jī)選取6個(gè)不同視野計(jì)數(shù)分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析方法

對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析使用GraphPad Prism 8.0軟件,對(duì)于臨床樣本分析,使用paired-t-test檢測(cè)數(shù)據(jù)間的顯著性差異,對(duì)于細(xì)胞實(shí)驗(yàn),使用one-Way ANOVA 或者Two-Way ANOVA 方差分析,方差分析之后使用Tukey's multiple comparison test進(jìn)行獨(dú)立檢驗(yàn),P<0.05為差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 LncRNA FAM 83H-AS1在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)水平明顯增高

LncRNAFAM83H-AS1在癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織(圖1)。為了進(jìn)一步分析FAM83H-AS1的表達(dá)水平與患者的臨床表型的相關(guān)性,研究分析了FAM83H-AS1的表達(dá)水平與患者的年齡、腫瘤大小、FIGO 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤組織學(xué)分級(jí)以及組織學(xué)類型的關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn)FAM83H-AS1的表達(dá)水平與患者的年齡、腫瘤大小無明顯的相關(guān)性(P>0.05)。但是,在FAM83 HAS1陽性的患者中,具有更高的FIGO 分期,此外,研究還發(fā)現(xiàn),非內(nèi)膜樣癌FAM83 H-AS1的表達(dá)水平更高,且腫瘤的組織學(xué)分級(jí)越高,就更具有轉(zhuǎn)移的可能,預(yù)示著預(yù)后情況更為不佳。見表1。

表1 子宮內(nèi)膜癌腫瘤組織中FAM 83H-AS1的表達(dá)水平與子宮內(nèi)膜癌臨床病理特征相關(guān)性

圖1 FAM 83H-AS1在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)水平明顯提高

2.2 低表達(dá)FAM 83H-AS1的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系構(gòu)建成功

為了驗(yàn)證FAM83H-AS1在子宮內(nèi)膜癌中的作用,我們首先采用sh RNA 靶向FAM83H-AS1 轉(zhuǎn)染至子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1A 和HEC-1B細(xì)胞中,通過qRT-PCR 檢測(cè)細(xì)胞中FAM83 H-AS1的表達(dá)水平用于確認(rèn)敲低效率,發(fā)現(xiàn)sh RNA-1與sh RNA-2均具有良好的敲低效應(yīng),并且sh RNA-1的效率更高,見圖2。

圖2 shRNA對(duì)FAM 83H-AS1敲低效率的檢測(cè)

2.3 敲低FAM 83H-AS1削弱子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖活性

采用CCK-8試劑盒分析在敲低FAM83H-AS1之后,檢測(cè)HEC-1A 和HEC-1B 細(xì)胞的增殖活性。結(jié)果顯示,在敲低FAM83 H-AS1的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1A 和HEC-1B 細(xì)胞中,在24 h后細(xì)胞活性顯著低于轉(zhuǎn)染Scr-sh RNA 的細(xì)胞(圖3A),進(jìn)一步將子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系HEC-1A 和HEC-1B 接種在瓊脂糖凝膠平皿中,用于分析細(xì)胞的克隆形成數(shù)量,接種后7天,對(duì)平板進(jìn)行結(jié)晶紫染色,研究結(jié)果顯示敲低FAM83 H-AS1的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1A 和HEC-1B細(xì)胞在平板中形成的細(xì)胞克隆數(shù)量顯著減少(圖3B)。并且,我們采用Ed U 染色檢測(cè)細(xì)胞中的增殖細(xì)胞數(shù)量,我們發(fā)現(xiàn)Ed U 陽性細(xì)胞數(shù)量明顯減少(圖3C)。

圖3 敲低FAM 83H-AS1削弱子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖活性

2.4 敲低FAM 83H-AS1促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的凋亡

而后,采用TUNEL 染色檢測(cè)了在敲低FAM83 H-AS1 的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1A 和HEC-1B細(xì)胞的凋亡小體的形成數(shù)量,觀察到在sh-NC的細(xì)胞中,平均每個(gè)視野有2～3個(gè)綠色熒光基團(tuán)(凋亡小體),然而在敲低FAM83 H-AS1的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中,平均每個(gè)視野的凋亡小體數(shù)量明顯增加(圖4A)。并且,我們進(jìn)一步采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中的凋亡比例,我們觀察到敲低FAM83HAS1會(huì)顯著促進(jìn)的細(xì)胞凋亡(圖4B)。以上結(jié)果均充分說明敲低FAM83H-AS1會(huì)導(dǎo)致子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的活性降低,并且促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。

圖4 敲低FAM 83H-AS1促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的凋亡

3 討論

在人類基因組中大約只有2%的基因編碼蛋白質(zhì);大多數(shù)基因組不會(huì)翻譯成蛋白質(zhì),而是可以編碼一系列非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA)[6]。在最近的幾十年中,已經(jīng)鑒出了一組稱為長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,LncRNA)的非編碼RNA。大多數(shù)LncRNA通常位于細(xì)胞核中,在那里它們可能在表觀遺傳調(diào)控中起關(guān)鍵作用,包括通過染色質(zhì)修飾,但是,越來越多的研究已經(jīng)確定了細(xì)胞質(zhì)中也存在LncRNA。這表明LncRNA在基因的表達(dá)、翻譯以及翻譯后調(diào)控中都起到重要作用[7]。研究表明,具有序列相似性的83位成員H 反義RNA 1(FAM83H-AS1)LncRNA家族的異常表達(dá)與癌癥患者的預(yù)后不良有關(guān)。在之前Ma等[8]的研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn),肝癌患者中高表達(dá)的FAM83H-AS1與總生存期(Overall Survival,OS)具有明顯相關(guān)性。在胃癌中,FAM83H-AS1高表達(dá)能夠影響胃癌患者的OS和無病生存率(Diseas-Free Survival,DFS),FAM83H-AS1在胃癌的發(fā)生發(fā)展中扮演者癌基因的作用[4]。另一項(xiàng)研究[9]表明,卵巢癌患者腫瘤組織中FAM83H-AS1的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織,并且高表達(dá)FAM83H-AS1與卵巢癌的腫瘤分化程度,與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)中,主要采用了qRT-PCR檢測(cè)了在臨床收集的39例子宮內(nèi)膜癌患者的腫瘤組織及其配對(duì)的癌旁組織中FAM83H-AS1的差異表達(dá)情況,為了進(jìn)一步分析FAM83H-AS1的表達(dá)水平與患者的臨床表型的相關(guān)性,研究分析了FAM83H-AS1的表達(dá)水平與患者的年齡、腫瘤大小、FIGO 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度以及組織學(xué)類型的關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn)FAM83H-AS1的表達(dá)水平與患者的年齡、腫瘤大小無明顯的相關(guān)性(P>0.05)。但是,在高表達(dá)FAM83H-AS1的患者中,具有更高的FIGO分期,此外,研究還發(fā)現(xiàn),非內(nèi)膜樣癌FAM83H-AS1的表達(dá)水平更高,且腫瘤的組織學(xué)分級(jí)更高,就更具有轉(zhuǎn)移的可能,預(yù)示著預(yù)后情況更為不佳。進(jìn)一步使用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒將靶向FAM83H-AS1的shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1A和HEC-1B細(xì)胞中,通過qRT-PCR檢測(cè)shRNA的轉(zhuǎn)染效率。隨后的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)敲低FAM83H-AS1會(huì)顯著抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞在體外的增殖,其主要表現(xiàn)在低表達(dá)FAM83H-AS1HEC-1A和HEC-1B的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖活性被顯著抑制,在平板上形成的克隆數(shù)量也顯著減少。而且,進(jìn)一步通過TUNEL染色發(fā)現(xiàn),敲低FAM83H-AS1會(huì)顯著促進(jìn)HEC-1A 與HEC-1B細(xì)胞中的凋亡小體的形成,從而揭示了低表達(dá)FAM83H-AS1會(huì)明顯促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的凋亡。

以上結(jié)果說明,LncRNAFAM83H-AS1高表達(dá)可能與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān),并可能與促進(jìn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移有關(guān)。但是由于樣本數(shù)量較少,LncRNAFAM83H-AS1在子宮內(nèi)膜癌發(fā)病機(jī)制中的作用以及表達(dá)與調(diào)控機(jī)制有待于進(jìn)一步研究,此外,該基因是否可作為子宮內(nèi)膜癌患者的易感篩查指標(biāo),以及如何找到有效下調(diào)LncRNAFAM83H-AS1的方法,是我們下一步研究的目標(biāo)。