潘 勇，李林林，方 欣，朱婷婷，周亞彬，胡 捷，王榮浩，劉 洋，譚再鈺，楊 梅，黃友誼，施友志

（1.湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，武漢 430040；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，a.園藝林學(xué)學(xué)院；b.生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢 430070）

煙葉發(fā)酵是改善雪茄煙葉品質(zhì)的重要工序，將在田間成熟及晾制完成的基礎(chǔ)上進(jìn)一步形成雪茄煙葉品質(zhì)［1-3］。發(fā)酵處理使煙葉中的內(nèi)含物質(zhì)進(jìn)一步分解和轉(zhuǎn)化，并使得煙葉內(nèi)各種化學(xué)成分更加協(xié)調(diào)；同時(shí)能夠提高雪茄煙葉中性香氣物質(zhì)的含量，降低煙葉雜氣和刺激性，獲得更好的香氣和吃味［4-8］。煙葉的工業(yè)發(fā)酵，又被稱為深度發(fā)酵或二次發(fā)酵［9］，主要目的是彌補(bǔ)初次發(fā)酵的不足，或提升煙葉的風(fēng)格特征，讓煙葉成分更加協(xié)調(diào)，以提升煙葉的工業(yè)可用性［10，11］。目前在雪茄煙葉發(fā)酵方面的研究主要集中于初次發(fā)酵［8］，而對(duì)工業(yè)發(fā)酵方面的研究較少，尤其是工業(yè)發(fā)酵對(duì)雪茄香氣的影響。本研究以工業(yè)發(fā)酵過程中不同階段的雪茄茄芯為研究對(duì)象，分析發(fā)酵過程中茄芯中性香氣成分的種類及含量的變化，篩選發(fā)酵前后的主要差異物質(zhì)，分析工業(yè)發(fā)酵對(duì)茄芯中性香氣成分的影響，為工業(yè)發(fā)酵提升茄芯煙葉品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料與試劑：試驗(yàn)煙葉為從洪都拉斯進(jìn)口的雪茄煙品種HABANO 生產(chǎn)的茄芯煙葉（已調(diào)制和初次發(fā)酵）。二氯甲烷、正構(gòu)烷烴（C8~C40）、乙酸苯乙酯等，均為色譜純。

儀器與設(shè)備：同時(shí)蒸餾萃取裝置，賽克斯玻璃儀器有限公司；RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；TRACE 1300+ISQ7000 氣質(zhì)聯(lián)用儀，賽默飛世爾科技公司。

1.2 煙葉發(fā)酵及取樣

雪茄茄芯的工業(yè)發(fā)酵按照湖北中煙三峽煙廠的生產(chǎn)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)要求進(jìn)行操作，生產(chǎn)周期約4 個(gè)月（2019 年8 月23 日至12 月26 日）。在整個(gè)發(fā)酵過程中，由經(jīng)驗(yàn)豐富的熟練加工人員根據(jù)堆垛發(fā)酵情況，對(duì)堆垛進(jìn)行翻堆處理，并根據(jù)發(fā)酵時(shí)間和翻堆情況，在原料（8 月23 日）、前期（9 月24 日）、中期（10 月29日）、后期（11 月22 日）及出堆（12 月26 日）5 個(gè)階段翻堆或出堆前按五點(diǎn)法取樣，樣品于-20 ℃保存。

1.3 中性香氣成分的提取

使用水蒸氣蒸餾-二氯甲烷溶劑萃取法（同時(shí)蒸餾萃取法）提取茄芯中性香氣成分。在1 L 圓底燒瓶中加入5.0 g 煙樣（過40 目篩）、0.5 g 檸檬酸、500 mL蒸餾水和50 μL 乙酸苯乙酯內(nèi)標(biāo)（2.226 μg/μL），使用恒溫電熱套進(jìn)行加熱；裝置的另一端接盛有40 mL 二氯甲烷的250 mL 圓底燒瓶，該端燒瓶置于恒溫水浴鍋中加熱，水浴溫度為60 ℃，蒸餾萃取2.5 h。萃取完成后，加入過量無水硫酸鈉干燥有機(jī)相，將有機(jī)相轉(zhuǎn)移到茄形瓶，然后使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至1 mL 左右，即得煙葉精油，用于GC-MS 分析。

1.4 GC-MS 分析條件

色譜柱：TG-5（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。載氣：He，流速：1.0 mL/min。進(jìn)樣口溫度為250 ℃，傳輸線溫度為280 ℃。離子源溫度為177 ℃。升溫程序：初始溫度60 ℃保留2 min，然后以2 ℃/min 的升溫速度升至230 ℃，保留15 min。分流比10∶1，進(jìn)樣量為2 μL。電離能為70 eV，電離方式為EI。質(zhì)量數(shù)范圍為35~500 amu，溶劑延遲6 min。由GC-MS得出正構(gòu)烷烴標(biāo)樣和發(fā)酵樣品中各香氣成分色譜峰的保留時(shí)間，計(jì)算物質(zhì)的保留指數(shù)，經(jīng)計(jì)算機(jī)通過NIST 譜庫進(jìn)行檢索匹配，結(jié)合數(shù)據(jù)庫中的匹配度和保留指數(shù)進(jìn)行定性。假定校正因子為1，采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行半定量分析。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)整理及基本圖表繪制使用軟件EXCEL2006、SPSS23.0、Origin2019 和聯(lián)川生物平臺(tái)（www.omicstudio.cn）中云工具進(jìn)行分析與繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程中茄芯中性香氣成分的種類

為探究發(fā)酵對(duì)雪茄茄芯香氣品質(zhì)的影響，采用同時(shí)蒸餾萃取結(jié)合GC-MS 方法檢測了雪茄茄芯不同發(fā)酵階段中的中性香氣成分，如表1 所示，從所有樣品中共檢測并鑒定出59 種中性香氣成分。根據(jù)香氣物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，這些中性香氣成分分為酮類、醇類、醛類、酯類、烴類、含氮化合物、芳香烴類和酚類8 類，其中酮類18 種（31%）、醇類14 種（24%）、醛類7種（12%）、烴類6 種（10%）、含氮化合物5 種（8%）、芳香烴類4 種（7%）、酯類3 種（5%）、酚類2 種（3%）（圖1a），表明酮類、醇類是雪茄茄芯的主要中性香氣成分。如圖1b 所示，中性香氣成分種類數(shù)量在雪茄茄芯發(fā)酵過程的變化較小，有40 種中性香氣成分一直存在于發(fā)酵的所有階段，表明工業(yè)發(fā)酵對(duì)雪茄煙葉中性香氣成分的種類數(shù)量無明顯影響。

圖1 雪茄茄芯發(fā)酵過程中中性香氣成分的種類占比（a）和種類韋恩圖（b）

2.2 發(fā)酵過程中茄芯中性香氣成分的動(dòng)態(tài)變化

使用聯(lián)川生物平臺(tái)（www.omicstudio.cn）中二維PCA 云工具對(duì)發(fā)酵不同階段的雪茄茄芯中性香氣成分進(jìn)行主成分分析，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行z-score 歸一化處理，以消除數(shù)值異常高的成分對(duì)后續(xù)分析的影響，減少數(shù)據(jù)間的“貧富差距”。如圖2a 所示，茄芯的原料、出堆樣品出現(xiàn)明顯分化，而發(fā)酵前期、中期和后期聚在一起，表明發(fā)酵過程中茄芯中性香氣成分的變化主要在原料和發(fā)酵前期之間，以及發(fā)酵后期和出堆之間，而發(fā)酵前期、中期和后期樣品中中性香氣成分的差異較小。發(fā)酵過程中雪茄茄芯中性香氣成分總量及不同類型的含量如圖2b 所示，中性香氣成分總量呈先減后增的變化趨勢，整體上發(fā)酵前后中性香氣成分總量增加明顯。不同種類中性香氣成分的含量變化中，醛類、酯類的含量在發(fā)酵過程無顯著性變化（P＞0.05），酚類、烴類的整體含量均呈顯著增加（P＜0.05）；其余種類物質(zhì)的含量在發(fā)酵過程中變化顯著，但發(fā)酵前后的含量無顯著差異（P＞0.05）。

2.3 發(fā)酵過程中茄芯中性香氣成分的變化趨勢

對(duì)雪茄茄芯深度發(fā)酵過程中中性香氣成分進(jìn)行STEM 變化趨勢聚類分析，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，以發(fā)酵原料為對(duì)照，計(jì)算所有樣本相對(duì)原料的含量倍數(shù)（Fold change，F(xiàn)C），并對(duì)含量倍數(shù)取Log2FC，預(yù)先設(shè)計(jì)4 種變化趨勢，變化跨度為2，將中性香氣成分分配給每個(gè)趨勢，結(jié)果如圖3 所示。由圖3 可知，發(fā)酵過程中茄芯中性香氣成分只有1 種模式，即先減后增型的變化趨勢顯著（P＜0.05），該模式變化下共有10 種中性香氣成分，包括茄酮、（2-trans，6-trans）-farnesal、新植二烯、植酮、8S，14-柏木二醇、法尼基丙酮、鄰苯二甲酸二丁酯、15，16-二去甲-8（17），11-賴百當(dāng)二烯-13-酮、香葉基芳樟醇、植物醇。其余3 種模式的變化趨勢不顯著（P＞0.05）。

圖3 雪茄茄芯發(fā)酵過程中中性香氣成分的STEM 變化趨勢聚類（a）和顯著性變化趨勢聚類（b）

2.4 發(fā)酵過程中茄芯的主要差異中性香氣成分

為了篩選出雪茄茄芯發(fā)酵過程中的主要差異中性香氣成分，以原料樣為對(duì)照，采用偏最小二乘法（PLS-DA）進(jìn)行分析，結(jié)合獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，以VIP＞1.0 和P＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn)篩選發(fā)酵前后差異中性香氣成分，結(jié)果如表2 所示。由表2 可知，從發(fā)酵過程中共篩選出14 種主要差異中性香氣成分，包括酮類的茄酮、（+）-香柏酮、植酮、法尼基丙酮、15，16-二去甲-8（17），11-賴百當(dāng)二烯-13-酮，醇類的8S，14-柏木二醇、柏木腦、香葉基芳樟醇、（1R，2E，4S，7E，11E）-4-異丙基-1，7，11-三甲基-2，7，11-環(huán)四烯-1-醇、植物醇；含氮化合物的3-乙?；拎?、2，3′-聯(lián)吡啶，以及烴類的新植二烯、西松烯。

表2 雪茄茄芯煙葉發(fā)酵過程中的主要差異中性香氣成分

3 討論

發(fā)酵是調(diào)制的延續(xù)，也是改善雪茄煙葉品質(zhì)的重要工序之一，香氣是煙葉的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)［12，13］，煙葉中各類香氣物質(zhì)及其含量與其香型等品質(zhì)特點(diǎn)密切相關(guān)［14］。本研究結(jié)果表明，一定程度的發(fā)酵整體上能夠提高茄芯中性香氣成分的含量，這與時(shí)向東等［15］的研究結(jié)果相符，但變化趨勢有所不同；本研究中茄芯中性香氣成分整體呈先減后增趨勢，前、中期的香氣總量減少，這可能是由于二次發(fā)酵前期溫度上升較快，發(fā)酵溫度較高，中性香氣成分揮發(fā)速度過快，而香氣前體物質(zhì)等經(jīng)過初次發(fā)酵含量有所下降，香氣生成速度較慢所致。從工業(yè)發(fā)酵前后共篩選出14 種差異中性香氣成分，這些成分是以質(zhì)體色素降解產(chǎn)物為主，包括植酮、法尼基丙酮、新植二烯、香葉基芳樟醇、植物醇等；而質(zhì)體色素降解產(chǎn)物是煙葉中主要香氣成分之一，與煙葉感官品質(zhì)關(guān)系密切［16］。此外，西柏烷類的茄酮，是煙草中含量最為豐富的中性香味成分之一，具有獨(dú)特的香味；棕色化反應(yīng)產(chǎn)物的3-乙酰基吡啶、2，3′-聯(lián)吡啶等與烤香、烘焙香和堅(jiān)果香等香味特征有關(guān)［17］，不同物質(zhì)可能對(duì)感官質(zhì)量的作用不同。工業(yè)發(fā)酵對(duì)雪茄茄芯原料具體感官品質(zhì)的影響以及主要中性香氣成分的代謝途徑等還有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

在工業(yè)發(fā)酵過程中，雪茄茄芯中性香氣成分的種類整體呈增加趨勢，但變化較??；其中性香氣成分的含量呈先減后增趨勢，整體上含量明顯增加；主成分分析表明中性香氣成分在原料和發(fā)酵前期之間，以及發(fā)酵后期和出堆之間變化較大。共篩選出14種雪茄茄芯關(guān)鍵中性香氣成分，包括茄酮、（+）-香柏酮、植酮、法尼基丙酮、15，16-二去甲-8（17），11-賴百當(dāng)二烯-13-酮、8S，14-柏木二醇、柏木腦、香葉基芳樟醇、（1R，2E，4S，7E，11E）-4-異丙基-1，7，11-三甲基-2，7，11-環(huán)四烯-1-醇、植物醇、3-乙?；拎?、2，3′-聯(lián)吡啶、新植二烯和西松烯。