閆更軒，王向向，田 緣，3，劉治廷，張淑梅，夏海華

（1.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱 150010；2.東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150040；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030）

解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）是一種革蘭氏陽性兼性厭氧菌，在28~37 ℃、pH 6.5~7.0 的條件下適宜生長。解淀粉芽孢桿菌生長速度快、產(chǎn)量高、安全無致病性，可以合成多種具有抑菌活性的次級代謝產(chǎn)物，包括脂肽、抑菌蛋白及聚酮化合物等，是發(fā)酵工業(yè)的重要宿主菌株［1］。脂肽作為一類由親水性肽鏈和親脂性脂肪烴鏈組成的兩親性表面活性劑，主要包括表面活性素（Surfactin）、豐原素（Fengycin）以及伊枯草菌素（Iturin）三大類［2］。多數(shù)脂肽具有抗菌活性，在細(xì)菌或真菌病害防治中發(fā)揮重要作用。表面活性素對藤黃微球菌具有強(qiáng)烈的抑制作用；豐原素可有效抑制灰霉病菌、稻瘟病菌的生長；伊枯草菌素可對分布于多種環(huán)境中的白色念珠菌起到抑制生長作用，為果實保鮮中念珠菌的污染防治提供了新策略［3-6］。

解淀粉芽孢桿菌是生產(chǎn)脂肽的重要菌株，但受菌種本身基因表達(dá)限制，目前脂肽的發(fā)酵產(chǎn)量十分有限，應(yīng)用基因工程技術(shù)進(jìn)行菌種創(chuàng)制有望成為提高脂肽產(chǎn)量的重要策略。研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌TF28 在脂肽產(chǎn)量上具備優(yōu)勢，TF28 菌株的脂肽合成水平受碳源類型的影響較大［7］，探究脂肽合成途徑和碳源利用及碳代謝過程的關(guān)聯(lián)對提高脂肽的產(chǎn)量有重要意義。本研究分別對在以葡萄糖、果糖和木糖為主要碳源條件下培養(yǎng)的菌株轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行比較研究，為揭示碳源代謝與脂肽合成調(diào)控途徑間的關(guān)聯(lián)性提供有力依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑和儀器 葡萄糖、果糖、木糖、酵母膏、硫酸銨、硫酸鎂、氯化鈣、硫酸錳、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉均為市售分析純。細(xì)菌總RNA 提取試劑盒購自Tiangen 公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit 及熒光定量PCR 試劑盒TB Green?Premix Ex Taq?（Tli RNaseH Plus）購自Takara 公司，-80 ℃超低溫冰箱購自Thermo 公司，ABI StepOne 熒光定量PCR 儀購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

1.1.2 菌株 解淀粉芽孢桿菌TF28 由（此處隱去單位）保藏。

1.1.3 培養(yǎng)基 復(fù)蘇培養(yǎng)基：牛肉膏8.0 g/L，酵母膏5.0 g/L，根據(jù)接種類型分別額外添加10.0 g/L 的葡萄糖、果糖和木糖。

葡萄糖培養(yǎng)基：葡萄糖40 g/L，酵母膏2 g/L，硫酸銨2 g/L，硫酸鎂2.11 g/L，氯化鈣0.1 g/L，硫酸錳0.1 g/L，磷酸二氫鉀1.5 g/L，磷酸氫二鈉3 g/L。

果糖培養(yǎng)基：將葡萄糖培養(yǎng)基中的葡萄糖替換為等量的果糖。

木糖培養(yǎng)基：將葡萄糖培養(yǎng)基中的葡萄糖替換為等量的木糖。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 以葡萄糖、果糖和木糖為碳源（以下分別簡稱為葡萄糖組、果糖組及木糖組），將保藏的解淀粉芽孢桿菌TF28 純化后接種于復(fù)蘇培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期（約10 h），按1%的接種量分別轉(zhuǎn)接至葡萄糖培養(yǎng)基、果糖培養(yǎng)基和木糖培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至對數(shù)期，培養(yǎng)條件為30 ℃，180 r/min。培養(yǎng)后的菌體離心（4 000 r/min，5 min），去除上清液，液氮速凍后利用干冰運(yùn)輸至上海生工生物有限公司，采用Total RNA Extractor 試劑盒提取各樣品總RNA，并通過Qubit2.0 RNA 檢測試劑盒進(jìn)行RNA 質(zhì)量檢測，構(gòu)建文庫并完成轉(zhuǎn)錄組測序。測序平臺為Illumina，每組樣品進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)。以葡萄糖為碳源生長的解淀粉芽孢桿菌TF28 為對照組（葡萄糖組），以果糖、木糖為碳源生長的解淀粉芽孢桿菌TF28 為試驗組（分別為果糖組、木糖組）。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)處理 原始序列（Raw reads）需完成數(shù)據(jù)質(zhì)控，通過Trimmomatic 軟件對雙端序列進(jìn)行過濾，以獲得相對純凈的測序有效數(shù)據(jù)［8］。應(yīng)用Bowtie2 軟件將有效數(shù)據(jù)映射至解淀粉芽孢桿菌TF28 參考基因組上（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/848？genome_assembly_id=217758），利用BEDTools 完成基因覆蓋率統(tǒng)計分析［9］。

1.2.3 基因表達(dá)差異分析 基因表達(dá)水平的計算通過FPKM（Fragments per kilobase of exon per million fragments mapped）方法完成。以葡萄糖組解淀粉芽孢桿菌TF28 基因為對照，使用DESeq2 進(jìn)行基因表達(dá)差異分析，分別計算果糖組、木糖組解淀粉芽孢桿菌TF28 基因轉(zhuǎn)錄豐度，挖掘差異基因，基因表達(dá)量差異倍數(shù)Log2（FC）＞1，P＜0.05［10］。

1.2.4 基因聚類分析 通過WEGO（http：//wego.genomics.org.cn）將全部差異基因映射至Gene ontology（GO）數(shù)據(jù)庫的各個條目，統(tǒng)計在不同條目下差異基因富集數(shù)量。應(yīng)用Cluster profiler 完成Kyoto encyclopedia of genes and genomes（KEGG）通路富集分析，計算KEGG pathway 各層級上富集的差異基因數(shù)量［11］。富集分析均覆蓋全部基因組，通過超幾何分布計算差異基因顯著富集的條目或通路。

1.2.5 實時熒光定量PCR 驗證 基于實時熒光定量PCR（Real-time quantitative PCR，RT-qPCR）技術(shù)檢測葡萄糖組、果糖組和木糖組的解淀粉芽孢桿菌TF28 差異基因表達(dá)水平，與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果進(jìn)行對比，驗證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的準(zhǔn)確性。根據(jù)解淀粉芽孢桿菌TF28 的全基因組設(shè)計RT-qPCR 檢測引物（表1），引物委托蘇州金唯智有限公司合成。解淀粉芽孢桿菌TF28 的總RNA 提取參考Tiangen 總RNA 提取試劑盒說明文檔，總RNA 經(jīng)檢測合格并定量后，應(yīng)用PrimeScript RT reagent Kit 將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA 為模板進(jìn)行RT-qPCR 檢測。RT-qPCR 反應(yīng)體系為：TB Green Premix Ex Taq 10 μL，cDNA 模板2 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，滅菌去離子水6.8 μL。PCR 反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃30 s；95 ℃5 s、60 ℃30 s，40 個循環(huán)；72 ℃10 min。TF28 菌株的16S rRNA 作為內(nèi)參基因，采用2（-ΔΔCT）方法統(tǒng)計各基因的相對表達(dá)水平。

表1 RT-qPCR 引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 測序質(zhì)量統(tǒng)計

測序堿基質(zhì)量主要受試劑、儀器及菌體RNA 質(zhì)量的影響，直接反應(yīng)出測序結(jié)果的可信度。堿基質(zhì)量值的計算公式為：

式中，Q表示堿基質(zhì)量值，e表示堿基識別出錯的概率。

分別對葡萄糖組、果糖組和木糖組的菌體轉(zhuǎn)錄組過濾前后測序數(shù)據(jù)質(zhì)量進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果見表2、表3。

表2 測序原始數(shù)據(jù)質(zhì)量統(tǒng)計

表3 測序后過濾數(shù)據(jù)質(zhì)量統(tǒng)計

葡萄糖組樣品的轉(zhuǎn)錄組共包含35 711 663 條reads，過濾后得到34 889 479 條reads；果糖組樣品的轉(zhuǎn)錄組共包含27 418 183 條reads，過濾后得到26 783 949 條reads；木糖組樣品的轉(zhuǎn)錄組共包含22 327 617 條reads，過濾后得到21 777 502 條reads；葡萄糖組、果糖組、木糖組樣品的轉(zhuǎn)錄組中有效reads 數(shù)量占總reads 數(shù)量的比重分別為97.70%、97.69%、97.54%，均大于97.00%；過濾后，各組樣品Q20均大于98.00%，Q30均大于94.00%，GC 含量均大于48.00%。綜上，此次測序數(shù)據(jù)質(zhì)量可用于后續(xù)相關(guān)研究。

2.2 參考基因組比對分析

應(yīng)用Bowtie2 軟件將過濾后的數(shù)據(jù)與解淀粉芽孢桿菌TF28 基因組進(jìn)行比對，結(jié)果見表4。3 組樣品的轉(zhuǎn)錄本定位至解淀粉芽孢桿菌TF28 基因組上的reads 數(shù)、多重比對reads 數(shù)占總reads 數(shù)量的比例分別超過98.00%、1.00%，表明本研究的所有樣品均未受到其他外源生物轉(zhuǎn)錄本的污染。

表4 過濾后的數(shù)據(jù)與TF28 基因組的比對結(jié)果

2.3 基因表達(dá)量分析

本研究共分析了解淀粉芽孢桿菌TF28 參考基因組上3 948 個基因的表達(dá)水平?；虮磉_(dá)水平通過FPKM（Fragments per kilobase of exon per million fragments mapped）來衡量，F(xiàn)PKM同時考慮了測序深度和基因長度對讀長數(shù)量的影響，是目前常用的基因表達(dá)水平估算方法。各樣品基因表達(dá)水平的情況如表5 所示。碳源改變將對解淀粉芽孢桿菌TF28 的基因表達(dá)水平分布趨勢造成影響。與對照相比，以果糖、木糖為碳源的樣品組檢測到的高水平表達(dá)基因（FPKM＞100）數(shù)量較多，具備研究價值。

表5 不同表達(dá)水平分布區(qū)間的基因數(shù)統(tǒng)計

2.4 差異基因篩選

通過統(tǒng)計各基因表達(dá)量，篩選差異基因，繪制火山圖，結(jié)果如圖1 所示。以葡萄糖為碳源的樣品為對照，果糖作為碳源的樣品可獲得差異基因688 個，其中上調(diào)基因522 個，下調(diào)基因166 個，差異基因占全部檢測基因的17.43%；木糖作為碳源的樣品可獲得差異基因855 個，其中上調(diào)基因691 個，下調(diào)基因164 個，差異基因占全部檢測基因的21.65%；果糖和木糖作為碳源的樣品共有的差異基因為594 個，其中表達(dá)量增加的基因383 個，表達(dá)量下降的基因125個，表達(dá)趨勢不同的基因86 個。

圖1 差異基因火山圖

2.5 差異基因的GO 注釋

對差異基因進(jìn)行GO 注釋分析，圖2 顯示了包含以果糖、木糖為碳源的樣品組全部差異基因的注釋結(jié)果。相對于以葡萄糖為碳源的對照組，差異基因?qū)儆谏镞^程（Biological process）分類的主要包括代謝過程（Metabolic process）、細(xì)胞進(jìn)程（Cellular process）、定位（Localization）等；屬于細(xì)胞組分（Cellular component）分類的主要包括細(xì)胞（Cell）、細(xì)胞器（Cell part）以及細(xì)胞膜（Membrane）等；屬于分子功能（Molecular function）分類的主要包括催化活性（Catalytic activity）、結(jié)合（Binding）以及轉(zhuǎn)運(yùn)活性（Transporter activity）等。上述GO 注釋分析結(jié)果顯示，碳源種類的改變影響了許多解淀粉芽孢桿菌TF28 中參與代謝合成、酶的表達(dá)、胞內(nèi)代謝物轉(zhuǎn)運(yùn)等進(jìn)程的功能基因表達(dá)量，可能會對該菌能夠合成的次級代謝產(chǎn)物類別及水平產(chǎn)生影響。

圖2 差異基因的GO 注釋結(jié)果

2.6 差異代謝途徑KEGG 富集分析

對差異基因進(jìn)行KEGG 富集分析，以明確差異基因參與的主要生化代謝途徑及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。對差異基因在各個代謝途徑的富集情況進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果如圖3 所示。以果糖為碳源的樣品組差異基因富集于115 個代謝途徑中，富集程度較高的代謝途徑主要包括ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)子（ABC transporters）、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成（Valine，leucine and isoleucine biosynthesis）、果糖和甘露糖代謝（Fructose and mannose metabolism）、生物素代謝（Biotin metabolism）等，而包含了最多差異基因的代謝途徑主要包括ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)子（ABC transporters）、氨基酸生物合成（Biosynthesis of amino acids）等；以木糖為碳源的樣品組差異基因富集情況略有差別，富集程度較高的生物素代謝（Biotin metabolism）被半胱氨酸和蛋氨酸代謝（Cysteine and methionine metabolism）及脂肪酸生物合成（Fatty acid biosynthesis）所取代，此外，差異基因分布于雙組分系統(tǒng)（Two-component system）、群體感應(yīng)（Quorum sensing）等代謝途徑中的數(shù)量較多。

圖3 差異基因KEGG 富集散點(diǎn)圖

雙組分系統(tǒng)直接調(diào)控細(xì)菌絕大多數(shù)生理過程，包括細(xì)菌的趨化性、感知滲透壓、孢子的形成、營養(yǎng)元素的代謝以及次級代謝產(chǎn)物的合成等，在芽孢桿菌中，對脂肽的合成有重要影響，因此該途徑中的差異基因類型值得關(guān)注［12］。通過統(tǒng)計差異基因數(shù)量，發(fā)現(xiàn)木糖組分布于雙組分系統(tǒng)的差異基因有21個，而果糖組只有10 個?；? 組共有的差異基因所表達(dá)的蛋白類型進(jìn)行COG 注釋，發(fā)現(xiàn)差異基因主要編碼脂肪酸去飽和酶（Fatty acid desaturase，TH57_RS14500）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)組氨酸激酶（Signal transduction histidine kinase，TH57_RS14505）等，表明上述基因可能在脂肽合成過程中起調(diào)控作用。

2.7 實時熒光定量PCR 驗證

為評估RNA-Seq 結(jié)果的可靠性，隨機(jī)篩選6 個差異基因，通過RT-qPCR 對基因的相對表達(dá)水平進(jìn)行檢測，并和轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果進(jìn)行對比（圖4）。結(jié)果表明，各差異基因在果糖組及木糖組中的表達(dá)水平變化趨勢與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致，說明本研究RNA-Seq 檢測數(shù)據(jù)的可信度較高。

3 小結(jié)與討論

脂肽的兩親性結(jié)構(gòu)賦予了其高效的抗菌生物活性，在農(nóng)作物病害防治領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。脂肽的生物安全性高，既可應(yīng)用于生物防治，也可應(yīng)用于蔬菜和水果的運(yùn)輸保藏，且保藏效果相較一些常見的保鮮劑更具優(yōu)勢［13］。然而，現(xiàn)有脂肽發(fā)酵技術(shù)仍然難以實現(xiàn)較高的產(chǎn)率，其原因在于野生菌種次級代謝產(chǎn)物類型多樣、合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜、受菌體生理活性限制等。脂肽的合成同時包含側(cè)鏈脂肪酸合成、脂肪酸活化及氨基酸配位等過程，其中有大量基因發(fā)揮各自的調(diào)控作用［14］。為提高菌種合成脂肽效率，可應(yīng)用合成生物學(xué)技術(shù)，明確調(diào)控基因的類別和功能，通過定向改造優(yōu)勢底盤菌株的代謝通路來增強(qiáng)脂肽的合成調(diào)控系統(tǒng)，包括群體感應(yīng)系統(tǒng)、雙組分系統(tǒng)等，為脂肽生產(chǎn)菌株的改良提供遺傳資源。

有研究表明，芽孢桿菌的脂肽產(chǎn)率受培養(yǎng)碳源類型的影響，例如果糖作為碳源時，枯草芽孢桿菌中豐原素及表面活性素的合成量更高［15］。為挖掘調(diào)控脂肽合成的關(guān)鍵基因，本研究以解淀粉芽孢桿菌TF28 為樣品，通過轉(zhuǎn)錄組測序分析該菌株在葡萄糖、果糖和木糖3 種碳源條件下基因表達(dá)水平差異情況。與葡萄糖組相比，在果糖組、木糖組中篩選到較多的差異基因，但果糖組和木糖組間的差異基因數(shù)量較少，表明解淀粉芽孢桿菌TF28 在不同碳源條件下，其碳代謝途徑和效率存在差異。

脂肽為脂質(zhì)與氨基酸的化合物或復(fù)合體，KEGG 富集結(jié)果顯示，在替換為能夠提高脂肽產(chǎn)率的碳源（果糖、木糖）后，部分氨基酸合成途徑相關(guān)基因表達(dá)水平發(fā)生顯著變化，如用于合成表面活性素及豐原素的蘇氨酸（ko00260，16 個差異基因）、纈氨酸（ko00290，11 個差異基因）等；脂肪酸合成途徑（ko00061，14 個差異基因）、脂肪酸降解途徑（ko00071，6 個差異基因）同樣發(fā)生了變化，結(jié)合各種脂肽產(chǎn)量的發(fā)酵檢測結(jié)果推測，脂肽的上游途徑可能得到了增強(qiáng)。下游脂肽合成途徑中，未篩選到表面活性素合成相關(guān)的差異基因，但在豐原素（TH57_RS04740，TH57_RS04715，TH57_RS04720）、伊枯草菌素（TH57_RS04875，TH57_RS20350，TH57_RS20340）中均檢測到表達(dá)量上調(diào)的基因，表明培養(yǎng)碳源類型的不同可能影響了脂肽合成相關(guān)基因表達(dá)。

在芽孢桿菌中，群體感應(yīng)系統(tǒng)在脂肽操縱子表達(dá)的過程中起到重要調(diào)節(jié)作用［16］。在本研究發(fā)現(xiàn)phrC、aprE、lepB、oppABCDF、rapK、degU、spo0F、spo0B等群體感應(yīng)調(diào)控基因均發(fā)生了上調(diào)，其中phrC、degU已被證實和脂肽的合成調(diào)控有關(guān)［17，18］。rapK是表面活性素的負(fù)調(diào)控因子，但本研究的測序結(jié)果顯示，rapK在果糖組和木糖組的表達(dá)量皆發(fā)生了上調(diào)，其對脂肽合成的調(diào)控作用可能需要進(jìn)一步驗證［19］。此外，雙組分系統(tǒng)中許多基因的表達(dá)發(fā)生了改變，碳貯藏調(diào)控因子csrA的表達(dá)發(fā)生上調(diào)，表明碳代謝過程受到影響；PhoR/PhoP 雙組分系統(tǒng)被證實和表面活性素及豐原素的合成有關(guān)，而其下游的調(diào)控因子phoA的表達(dá)在果糖組和木糖組中均下調(diào)，意味著phoA可能和脂肽的合成存在關(guān)聯(lián)；spo0F的上游環(huán)境相關(guān)因子kapB的表達(dá)量增加，其全局調(diào)控作用同樣值得關(guān)注。本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，篩選到了一批可能與脂肽合成相關(guān)的調(diào)控因子，后續(xù)將依托本研究結(jié)果繼續(xù)對基因功能進(jìn)行解析，為脂肽的生產(chǎn)和應(yīng)用提供支持。