胡錦碩,劉 鑫,周春花,石琴華,鄧仕標(biāo)

(1.南昌大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江西 南昌 330031;2.撫州醫(yī)學(xué)院,江西 撫州 344000)

人蛔蟲和豬蛔蟲是對人類和豬的健康有重要影響意義的小腸寄生性線蟲?；紫x感染估計超過8億人,蛔蟲病是一種被忽視的貧困疾病。輕度感染可能無癥狀,但中度至重度感染這些大型蠕蟲可導(dǎo)致腹部癥狀,甚至致命的小腸梗阻。幼兒感染可導(dǎo)致營養(yǎng)不良、生長遲緩和認(rèn)知發(fā)展抑制?；紫x感染也會給養(yǎng)豬行業(yè)帶來重大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。

人蛔蟲和豬蛔蟲具有相似的結(jié)構(gòu)特征,有相同的生活史,學(xué)術(shù)上有關(guān)人蛔蟲和豬蛔蟲二者的分類學(xué)關(guān)系始終存在爭論。有學(xué)者認(rèn)為兩者都是有效的物種,可能來自共同的祖先[2];也有學(xué)者認(rèn)為先出現(xiàn)豬蛔蟲再出現(xiàn)人蛔蟲[3]或先出現(xiàn)人蛔蟲再出現(xiàn)豬蛔蟲[4-5];還有學(xué)者認(rèn)為人蛔蟲和豬蛔蟲是同物異名種,相似的形態(tài)學(xué)和低的遺傳距離似乎支持這一觀點(diǎn)[2],但宿主特異性的證據(jù)又不支持這一觀點(diǎn)[6],人蛔蟲和豬蛔蟲種群重測序至不同的候選區(qū)域,GO富集到不同的條目和KEGG分析富集到不同的通路[5],也不支持這一觀點(diǎn)。

人蛔蟲和豬蛔蟲在流行上基本上具有各自相對獨(dú)立的傳播圈[7-9]。但人、豬蛔蟲又顯示出相同的基因型,如相同的核酸電泳帶型[8-9],相同的G2型(占20%左右)[10],以及相同的人蛔蟲的H9序列和豬蛔蟲的P9型(占2.5%)[11],這些結(jié)果表明兩者之間存在交叉感染甚至雜交的可能性。Criscione等首次發(fā)現(xiàn)并報道了人源性蛔蟲和豬源性蛔蟲的雜交個體[12]。隨后Zhou等對交叉感染和雜交個體在我國的發(fā)生頻率及其在人豬宿主之間、南北地區(qū)之間和以及不同基因型(G1-G3)之間的分布做了深入的研究,并提出人蛔蟲的絕大多數(shù)是人型蛔蟲,豬型蛔蟲是豬蛔蟲的主要部分,雜交型蛔蟲則是交叉感染的人型蛔蟲和豬型蛔蟲交配產(chǎn)生的雜交個體,或是交叉感染的豬型蛔蟲和人型蛔蟲交配產(chǎn)生的雜交個體[13]。

人型、豬型、雜交型蛔蟲種群的線粒體系統(tǒng)發(fā)育基因組學(xué)研究表明雜交型蛔蟲和人型、豬型蛔蟲存在差異[14]。基于人蛔蟲基因組測序表明人、豬蛔蟲雜交體能感染人[15]。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上,運(yùn)用多個微衛(wèi)星標(biāo)記探究3個蛔蟲種群的遺傳多樣性。了解其遺傳學(xué)差異,以便理清它們生活策略的某些方面,提高我們對疾病流行病學(xué)的認(rèn)識,并設(shè)計控制策略。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用的蛔蟲樣本取自江西省新建縣,采集時使用生理鹽水將蟲體清洗干凈,-80 ℃保存。人型、豬型和雜交型蛔蟲的鑒定詳見Zhou等[13]。人型蛔蟲(n=33)來自人體內(nèi);豬型(n=33)蛔蟲來自豬體內(nèi);雜交型蛔蟲(n=6)中5條來自豬體內(nèi),1條來自人體內(nèi)。

1.2 基因組DNA的提取

樣本解凍后剪下一小段蟲體體壁(約50 mg)放入已滅菌的1.5 mL離心管中并剪碎。用蛋白酶K消化過夜,采用Promaga公司試劑盒(Wizard?SV Genomic DNA Purification System)提取基因組DNA。

1.3 微衛(wèi)星擴(kuò)增

采用常染色體微衛(wèi)星引物(GenBank?中檢索號為:DQ988845、DQ988847、DQ988848、DQ988849、DQ988857、DQ988859、DQ988860和DQ988863)進(jìn)行擴(kuò)增,在上游引物5'端加上熒光標(biāo)記(FAM或HEX或TAMRE)。引物詳細(xì)信息見Criscione等[12]。PCR反應(yīng)體系總積為25 μL,其中包括2x Premix Taq (Takara) 12.5 μL、10 μmol·L-1的上游引物和下游引物各1.5 μL、50 ng·μL-1的DNA模板1 μL以及滅菌雙蒸水13.5 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性6 m,10次高溫PCR循環(huán)(95 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 m),35次低溫PCR循環(huán)(95 ℃變性30 s、47 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 m),72 ℃延伸5 m。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳確定擴(kuò)增產(chǎn)物的長度符合預(yù)期的范圍后進(jìn)行毛細(xì)管電泳,等位基因的大小由ABI3730xl DNA分析儀確定。引物合成、毛細(xì)管電泳均由上海生工生物工程有限公司完成。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用CERVUS V2.0軟件計算每個微衛(wèi)星標(biāo)記的遺傳多樣性指標(biāo)(觀測雜合度、期望雜合度和多態(tài)信息含量)、等位基因的頻率和數(shù)目。通過Arlequin 3.5計算人型、豬型和雜交型蛔蟲間的遺傳分化程度FST和分子變異方差分析。

2 結(jié)果

2.1 3個蛔蟲種群的等位基因數(shù)及等位基因頻率差異

本研究使用的微衛(wèi)星多態(tài)性位點(diǎn)中檢測到等位基因數(shù)最多的是ALGA20位點(diǎn),具有33個等位基因;等位基因數(shù)最少的是ALGA31位點(diǎn),具有9個等位基因。人型、豬型和雜交型蛔蟲種群檢測到的等位基因數(shù)分別為130、51、42(表1)。人型、豬型和雜交型蛔蟲種群檢測到的等位基因數(shù)最多的均為ALGA20位點(diǎn),分別具有27、9、9個等位基因;檢測到的等位基因數(shù)最少的位點(diǎn)均是ALGA31,等位基因數(shù)分別為8、1、2(表1)。人型、豬型和雜交型蛔蟲均具有各自種群的特有等位基因,其中特有等位基因數(shù)最多的是人型蛔蟲種群,最少的是雜交型蛔蟲種群(表1)。

表1 3個蛔蟲種群在8個微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因數(shù)及特有等位基因Tab.1 Alleles and specific alleles at eight microsatellite loci in three Ascaris populations

人型、豬型和雜交型蛔蟲種群中不同位點(diǎn)的等位基因頻率有所不同,人型、豬型和雜交型蛔蟲種群的等位基因頻率范圍分別為0～0.767 9、0～1.00、0～0.583 3。微衛(wèi)星位點(diǎn)ALGA20在人型蛔蟲種群中多態(tài)性最高,在雜交型蛔蟲種群中也是如此。微衛(wèi)星位點(diǎn)ALAC09、ALGA20和ALAC01在豬型蛔蟲種群中均為最高的多態(tài)性。微衛(wèi)星位點(diǎn)ALGA32在人型、豬型和雜交型蛔蟲中具有相同的優(yōu)勢等位基因。微衛(wèi)星位點(diǎn)ALGA47在人型與雜交型蛔蟲中具有相同的優(yōu)勢等位基因。微衛(wèi)星位點(diǎn)ALAC07、ALGA20、ALGA31、ALGA32在人型和豬型蛔蟲中具有一致的優(yōu)勢等位基因,其他4個微衛(wèi)星位點(diǎn)的優(yōu)勢等位基因則存在差異。

2.2 人型、豬型和雜交型蛔蟲種群遺傳多樣性分析

人型、豬型和雜交型蛔蟲種群的平均等位基因數(shù)分別為16、6和5;期望雜合度分別為0.84、0.60和0.70;多態(tài)信息含量分別為0.81、0.55和0.61。3個蛔蟲種群均有較高的遺傳多樣性,人型蛔蟲種群的遺傳多樣性最高,而豬型蛔蟲的遺傳多樣性最低。

2.3 3個蛔蟲種群的基因流與遺傳分化

人型、豬型和雜交型蛔蟲種群間存在基因流,基因流最大的在雜交型和人型蛔蟲種群間,為7.42;最小在雜交型和豬型蛔蟲種群間,為2.54(表2)。人型與豬型、人型與雜交型、豬型與雜交型蛔蟲種群間的遺傳分化分別為0.12、0.06、0.16(表2)。進(jìn)一步的分子變異方差分析顯示,絕大部分的變異(17.22%+71.21%)來自個體間,而只有小部分的變異來自種群間(表3)。F統(tǒng)計量即FIT、FIS和FST值分別為0.29、0.19和0.12,且P值均為0.00,說明蛔蟲的變異主要來自個體間(表3)。

表2 3個蛔蟲種群間的基因流與遺傳分化(右三角為基因流,左三角為遺傳分化)Tab.2 Gene flow and genetic differentiation among three Ascaris populations (gene flow in the right triangle and genetic differentiation in the left triangle)

表3 人型、豬型和雜交型蛔蟲種群的分子變異方差分析Tab.3 Analysis of molecular variance and variance in human-type Ascaris,pig-type Ascaris,and hybrid Ascaris

3 討論

本研究選用的微衛(wèi)星位點(diǎn)遺傳多態(tài)性水平較高,承載著較多的遺傳信息,能反映出種群的進(jìn)化歷史。在這些位點(diǎn)中,人型、豬型和雜交型蛔蟲種群均存在各自的優(yōu)勢等位基因和特有等位基因,等位基因頻率分布不均勻。優(yōu)勢等位基因通常為一個種最原始和最保守的,在進(jìn)化過程中會受到DNA突變等機(jī)制的影響而變成其他的等位基因,微衛(wèi)星標(biāo)記的多態(tài)性水平可以很好地體現(xiàn)一個物種的進(jìn)化歷程[16]。人型蛔蟲、豬型蛔蟲和雜交型蛔蟲在寄主選擇上的差異可能與優(yōu)勢等位基因和特有等位基因的差異有關(guān)。

從人型、豬型和雜交型蛔蟲種群的期望雜合度和多態(tài)信息含量來看,它們都存在較大的遺傳變異,這反映了人型、豬型和雜交型蛔蟲種群的遺傳多樣性水平的差異,究其原因可能與寄主差異有關(guān)[17];也可能是因?yàn)榛驖u滲過程中被整合的基因通過重組被分解并等待選擇,有害的等位基因會被清除,而有利的等位基因通過漂移來避免丟失,其基因頻率可能會增加[18]。

本研究得出豬型與雜交型蛔蟲種群間的遺傳分化較大(處于0.15～0.25),而人型與豬型、人型與雜交型蛔蟲種群間的遺傳分化中等(處于0.05～0.15)。進(jìn)一步的分子方差分析顯示,人型、豬型和雜交型蛔蟲種群間的FST=0.12,種群間的遺傳分化水平中等,并且種群間遺傳變異只占11.57%,個體間遺傳變異占88.43%,說明3個蛔蟲種群間遺傳分化水平與種群內(nèi)相比較弱,這可能與種群間的基因交流有關(guān)。3個蛔蟲種群間的基因流值(2.54～7.42)較大,說明蛔蟲種群間都存在較為普遍的基因交流,即基因漸滲。其中人型和雜交型蛔蟲種群間基因交流(值最大)比其他種群間都要普遍,這與基因組測序得出的人、豬蛔蟲的雜交體感染人的結(jié)果相一致[15]?；驖u滲在種群水平意味著某一個種群的遺傳信息被轉(zhuǎn)移至另一個種群[19]?；驖u滲的前提是雜交,在寄生蟲中普遍存在,如雜交常見于埃及血吸種與其他血吸種[18]。人蛔蟲和豬蛔蟲雜交的數(shù)據(jù)已被人陸陸續(xù)報道。有采用單個分子標(biāo)記的限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)在非流行區(qū)和流行區(qū)均發(fā)現(xiàn)了雜交型蛔蟲[20-21]。也有采用多個微衛(wèi)星標(biāo)記結(jié)合貝葉斯分析在流行區(qū)發(fā)現(xiàn)了雜交個體[12-13]。漸滲雜交因?yàn)榫幋a生物醫(yī)學(xué)重要性狀(包括毒力、宿主特異性或耐藥性)的基因在物種間轉(zhuǎn)移提供了潛在途徑而備受關(guān)注[22]。

本研究的雜交型蛔蟲大多來自豬的體內(nèi),而先前的研究大多是來自人的體內(nèi)[12-13]。新近基于基因組測序也發(fā)現(xiàn)了人蛔蟲和豬蛔蟲雜交復(fù)合體感染人的分子證據(jù)[15]。這反映了蛔蟲傳播動力學(xué)的變化的事實(shí),提醒我們有必要對蛔蟲病的防治制定新的策略,對當(dāng)?shù)刎i蛔蟲感染的治療同時也要加強(qiáng)對人蛔蟲病的治療,以減少豬群受到來自人群蛔蟲的感染。此外,雜交本身可能產(chǎn)生新的寄生蟲基因型組合,通過宿主免疫逃逸或寄生蟲致病力增強(qiáng)擴(kuò)大宿主范圍,這種重新組合的寄生蟲基因型可以從雜交區(qū)逃逸。這些雜交個體的存在需要引起關(guān)注?；陔s交可能在蛔蟲種群的進(jìn)化動態(tài)中發(fā)揮的作用,應(yīng)該重新評估蛔蟲病的長期控制措施。

人、豬蛔蟲除了存在有宿主特異性寄生的人型蛔蟲和豬型蛔蟲外,還可能存在無宿主特異性寄生(即能同時感染人和豬)的類型,而且人型蛔蟲或豬型蛔蟲能夠在一定的條件下(比如信號通路發(fā)生改變、去甲基化或者免疫驅(qū)動等)轉(zhuǎn)化成無宿主特異性寄生的類型,這就產(chǎn)生了交叉?zhèn)鞑?進(jìn)而產(chǎn)生了雜交個體。雜交個體可能無宿主特異性。

4 結(jié)論

本研究將微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于人型、豬型和雜交型蛔蟲的遺傳多樣性研究,為蛔蟲的遺傳結(jié)構(gòu)、分子流行病學(xué)提供多角度的信息。本研究得出3個蛔蟲種群的遺傳多樣性水平均較高,且人型蛔蟲種群的最高,而豬型蛔蟲的最低,遺傳變異主要來自種群個體間,人型和雜交型蛔蟲種群間的基因交流更頻繁,3個蛔蟲種群間存在差異。人型、豬型、雜交型蛔蟲的核基因組信息應(yīng)該進(jìn)一步研究,因?yàn)樗梢愿钊氲仃U明兩者的分類地位和演變。