基于分子連接性指數(shù)相似度探討歸肺和大腸經(jīng)中藥成分“印跡模板”的分布特征及實驗驗證

賀琪，盛丹丹，陳 澤，周 敏，周 欣，梁紫珊，陳定芳,4，賀福元,4,5,6*

1. 湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007

2. 湖南中醫(yī)藥大學藥學院，湖南 長沙 410208

3. 中藥成藥性與制劑制備湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208

4. 湖南中醫(yī)藥大學 中藥炮制與制劑制備工程技術實驗室，湖南 長沙 410208

5. 湖南中醫(yī)藥大學 中醫(yī)藥超分子機理與數(shù)理特征化實驗室，湖南 長沙 410208

6. 中藥藥性與藥效國家中醫(yī)藥管理局重點實驗室，湖南 長沙 410208

中藥歸經(jīng)理論最早見于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，歸即歸屬，指藥物作用的歸屬；經(jīng)即人體的臟腑經(jīng)絡；歸經(jīng)即藥物作用的定位，就是將藥物的作用與人體的臟腑經(jīng)絡密切聯(lián)系起來，以說明藥物作用對機體某部分的選擇性。因此，利用中藥歸經(jīng)理論可引藥上升、下降、達表、入里，直達病所[1]。肺與大腸通過“立體多維”的經(jīng)絡循行構成表里關系，其中任何一方功能失調，都會波及到對方[2]。然這種作用關系可通過只歸肺經(jīng)中藥成分客體“印跡模板”的拓撲結構特征得到探知，因此展開歸肺和大腸經(jīng)中藥成分的“印跡模板”特征分布分析，對探討肺經(jīng)與大腸經(jīng)的表里關系具有重大的意義。

人和中藥都是巨復超分子，各種分子按“印跡模板”形成超分子聚集體[3]。在這個過程中，各種分子通過自組織、自組裝、自識別與自復制作用逐級形成巨復超分子，母體必然保留子體的“印跡模板”特征，關聯(lián)表里內(nèi)外、上下左右形成經(jīng)絡臟腑[4]。因此，通過探索中藥與人體之間相互匹配的“印跡模板”特征，就有可能闡明中藥歸經(jīng)理論，從而揭示中醫(yī)經(jīng)絡“印跡模板”物質基礎特征。

定量結構-性質關系/定量結構-保留時間關系（quantitative structure-property relationship/quantitative structure-retention relationship，QSPR/QSRR）是運用數(shù)學統(tǒng)計分析和應用化學理論計算方法，建立數(shù)學模型來定量地描述和研究有機物的結構與性質或保留時間之間的對應關系，已于1977 年開始陸續(xù)在色譜學中得到應用。在缺乏對照品，也沒有可以利用的相對保留時間可參考的情況下，人們希望能通過利用藥物結構參數(shù)或某些容易獲得的物化性能參數(shù)來預測藥物色譜保留時間，于是建立了QSPR/QSRR 法[5]。該方法同樣可用于中藥成分與人體經(jīng)絡臟腑作用關系的研究，解決中藥歸經(jīng)難以闡釋這個問題[6]。由于QSPR/QSRR 可表征中藥成分結構與色譜印跡行為，同樣也能表征中藥成分結構與人體定量作用規(guī)律，可將中藥對人體歸經(jīng)的作用規(guī)律研究轉移至體外對色譜學行為規(guī)律的研究]7-8]，將極大地化簡中藥歸經(jīng)研究的難度。

本研究以全國中醫(yī)藥行業(yè)高等教育“十三五”規(guī)劃教材《中藥學》為基本標準，從443 味中藥中歸納只歸肺和大腸經(jīng)的11 味藥，分別是番瀉葉、羅漢果、紫蘇子、馬兜鈴、胖大海、苦杏仁、皂莢、金沸草、訶子、石榴皮、松子仁。先對其所含成分的化學結構進行類別分析，并對其中相同成分進行整理、刪減、合并，最終共獲886 種中藥成分。再計算出 0 ～8 階分子連接性指數(shù)（molecular connectivity index，MCI），匯總成各類別的MCI 信息[9]，并與其平均值進行相似度比較，按相似度高低排序獲得歸肺和大腸經(jīng)成分類型和對照品，并對MCI 相似度與對照品保留時間進行線性回歸，獲得印跡參數(shù)；利用QSPR/QSRR 原理對比分析中藥與對照品的印跡參數(shù)重疊，將中藥對人體的歸經(jīng)印跡研究轉移至體外的色譜印跡研究，簡化并創(chuàng)立中藥歸經(jīng)體外研究方法，為人體經(jīng)絡“印跡模板”空間結構的物質基礎研究奠定基礎[10]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Acquity UPLC H-Class 系統(tǒng)、四元溶劑泵、自動進樣裝置、在線真空脫氣裝置、PDA 檢測器、Empower 3 色譜工作站、柱溫箱（以上均來自美國沃特世公司）；RE-2000A 旋轉蒸發(fā)器（鞏義市中天儀器科技有限公司）；SHB-IIIA 循環(huán)水式多用真空泵（北京市中興偉業(yè)儀器有限公司）；DZTW 調溫電熱套（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；1000C 多功能粉碎機（永康市玖藍五金制品有限公司）；JCS-31002C 電子天平（哈爾濱眾匯衡器有限公司）；HH數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市金城國勝實驗儀器廠）；SB-5200DTD 超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；DZF-6050 型真空干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）。

1.2 試藥

番瀉葉、石榴皮、金沸草、訶子、皂莢、羅漢果、胖大海、苦杏仁及紫蘇子購于湖南長沙高橋中藥材市場，由湖南中醫(yī)藥大學藥學院中藥鑒定教研室石繼連副教授鑒定，均符合《中國藥典》2020 版一部規(guī)定。對照品蘆丁（批號DSTDL001701）、3,3′-二甲基鞣花酸-4′-O-葡萄糖苷（批號DST210420-021）、山柰苷（批號DSTDQ-005101）、山柰酚-3-O-蕓香糖苷（批號DST200619-075）、大黃素-1-O-葡萄糖苷（批號DST210425-072）、大黃酚-8-O-β-D-葡萄糖苷（批號DSTDM000801）、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷（批號DST201106-066）均購于湖南長沙玖弘生物科技有限公司，以上對照品質量分數(shù)均大于98%；乙腈（色譜純，美國TEDIA），甲酸（色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司），甲醇（色譜純，美國TEDIA），無水乙醇（分析純，湖南匯虹試劑有限公司），自制純化水。

2 方法與步驟

2.1 MCI 法

MCI 是由Kier 和Hall 等加以發(fā)展而形成的一種新的拓撲方法，最早可以追溯到1975 年由Randic提出。其能夠定量描述分子的結構信息[11-12]，如分支、不飽和度、大小、環(huán)和雜原子等，并充分反映分子的連接信息和化學環(huán)境，是表征分子結構的重要參數(shù)。MCI 與分子的多種理化性質（包括液體沸點、密度、分子極化度、摩爾折射率、分配系數(shù)、有機物的水溶性、立體參數(shù)等）及生物效應（酶抑制活性、抗菌活性、麻醉活性、毒性等）有關[13]。本研究采用自編軟件計算0～8 階MCI。

mXt為m階的MCI；Nm為階數(shù)為m的t類型子圖的數(shù)目；δi為原子i的非原子點價，即與原子i相連接的其他非氫原子數(shù)目；t代表子圖類型

隨著階數(shù)m的增高，mXt表達的結構信息能力亦增強，可獲得m×t的矩陣數(shù)據(jù)信息集。本研究階數(shù)Nm為0～8 階，子圖類型t為8，因此能獲得72個MCI 數(shù)據(jù)信息集。對于本研究中兩兩72 個MCI信息集可按照夾角余弦值計算其相似度。將兩矩陣看作是二維數(shù)組向量，任意矩陣數(shù)組元素aij和bij相似度的公式如下。

2.2 總量統(tǒng)計矩分析法

總量統(tǒng)計矩分析法是指紋圖譜定性、定量分析方法之一，其總量零階矩表示作用強度，可用于定量分析；總量一階矩和總量二階矩表示作用特征，可用于定性分析。本研究基于高效液相色譜理論和統(tǒng)計學方法，對相關的中藥成分指紋圖譜應用總量統(tǒng)計矩進行評價分析。以零階矩、一階矩、二階矩等參數(shù)對圖譜性質進行刻畫，達到定性、定量分析中藥的目的[14]。總量零階矩（AUCT）即一定總量下曲線的總響應面積；總量一階矩（MCRTT）為總量中心矩或總量平均保留時間，用λT表示；總量二階矩（VCRTT）為平均保留時間方差，用σT2表示。其中AUCT可用于定量分析，MCRTT、VCRTT可用于定性分析。本研究將MCI 與HPLC 指紋圖譜結合，探討歸肺和大腸經(jīng)中藥成分MCI 與中藥指紋圖譜之間的聯(lián)系，再通過總量統(tǒng)計矩進行實驗驗證。

2.3 實驗步驟

2.3.1 歸肺和大腸經(jīng)中藥的收集及其所含成分MCI 的計算 根據(jù)全國中醫(yī)藥行業(yè)高等教育“十三五”規(guī)劃教材《中藥學》，歸納只歸肺和大腸經(jīng)的中藥。利用 TCMSP 數(shù)據(jù)庫（http://localhost/ce/index.php）以及MCI 計算軟件完成各成分MCI 的計算，再通過Excel 表的合并計算獲得歸肺和大腸經(jīng)中藥各類成分的平均MCI 以及中藥的總體平均MCI。

2.3.2 供試品溶液的制備 分別取單味藥材番瀉葉、石榴皮、金沸草、訶子、皂莢、羅漢果、胖大海、苦杏仁、紫蘇子約20 g 加入圓底燒瓶，加8 倍量水回流提取2 次，每次1 h，紗網(wǎng)濾過，合并2 次濾液，趁熱抽濾，減壓濃縮至浸膏，分別加適量50%甲醇超聲處理至完全溶解，定容至生藥質量濃度為0.5 g/mL，以3000 r/min 轉速離心15 min，取上清液過0.22 μm 有機濾膜后置液相色譜儀樣品瓶中，待測。

2.3.3 對照品溶液的制備 分別取蘆丁、3,3′-二甲基鞣花酸-4′-O-葡萄糖苷、山柰苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、大黃素-1-O-葡萄糖苷、大黃酚-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷對照品適量，精密稱定1 mg，置棕色量瓶中，加50%甲醇定容至5 mL，分別制成0.2 mg/mL 的對照品溶液，并超聲處理5 min，過0.22 μm 有機濾膜進置液相色譜儀樣品瓶中，待測。

2.3.4 HPLC 測定條件 色譜柱為Ultimate AQ-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為0.4%磷酸水溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脫（0～20 min，100%～95% A；20～30 min，95%～90% A；30～65 min，90%～75% A；65～70 min，75%～55% A；70～75 min，55%～100% A）。體積流量為1.0 mL/min，進樣量為1 μL，檢測波長為260 nm。

2.4 統(tǒng)計學分析

采用統(tǒng)計描述、相似度和線性回歸比較分析樣本間的差異。

3 結果

3.1 化學成分頻次統(tǒng)計及MCI 和相似度的計算

從443 味中藥中歸納只歸肺和大腸經(jīng)的11 味藥，分別是番瀉葉、羅漢果、紫蘇子、馬兜鈴、胖大海、苦杏仁、皂莢、金沸草、訶子、石榴皮、松子仁。歸肺和大腸經(jīng)中藥所含成分種類分布統(tǒng)計如表1 所示。用Xp、Xvp、Xc、Xvc、Xpc、Xvpc、Xch、Xvch 分別代表0～8 階的路徑、點價路徑、簇、點價簇、路徑簇、點價路徑簇、環(huán)、點價環(huán)的不同連接形式的MCI，見圖1，并計算各類成分平均MCI與總體平均MCI 的相似度（圖1 中各圖標題后的括號內(nèi)數(shù)值為相似度）。

圖1 中藥各類成分的平均MCI 及總體平均MCIFig. 1 Average molecular connectivity index of various components and overall components in traditional Chinese medicine

表1 歸肺和大腸經(jīng)中藥所含成分類型分布Table 1 Type distribution of compositions contained in traditional Chinese medicine attributed to lung and intestine meridian

3.2 歸肺和大腸經(jīng)中藥成分的拓撲結構相似度

將886個成分MCI與歸肺和大腸經(jīng)的平均MCI逐個進行相似度計算并且進行排序，相似度最高的前10 位成分是旋覆花內(nèi)酯、α-古蕓烯、2(R)-(6-甲氧基-4-喹啉基)-[(2R,4R,5S)-5-乙烯基喹啉-2-基]甲醇、(±)-紫蘇醛、β-欖香烯、4-甲氧基苯乙酮、旋覆花內(nèi)酯A、旋覆花內(nèi)酯B、1,2,3,7-四甲基吲哚、inuviscolide。以上成分多為萜類、苯丙素或生物堿類，對照品不易獲得，很難進行實驗驗證?？紤]到黃酮、蒽醌、鞣質類成分平均MCI 相似度均在0.95以上，且主要集中在番瀉葉、訶子、石榴皮中，易從中尋找到適宜的歸肺和大腸經(jīng)成分“印跡模板”表征物質。

對表1 中的96 個黃酮、蒽醌、鞣質類成分的MCI與其平均MCI 的相似度進行排序，前10 位成分的MCI相似度通過0～8 階MCI 比較的情況分別用Xp、Xvp、Xc、Xvc、Xpc、Xvpc、Xch、Xvch 表示，見圖2。

圖2 黃酮、蒽醌、鞣質類成分平均MCI 相似度排名前10 位成分Fig. 2 Average MCI similarity ranked top 10 components in flavonoids, anthraquinone and tannins

4 實驗驗證

4.1 9 味藥材的HPLC 指紋圖譜的總量統(tǒng)計矩參數(shù)

對番瀉葉、訶子、金沸草、皂莢、紫蘇子、苦杏仁、羅漢果、胖大海、石榴皮9 味歸肺和大腸經(jīng)的中藥（因馬兜鈴為管制中藥，松子仁在《中國藥典》中無收載，二者未采用）按照“2.3.2”項方法制備供試品溶液，按照“2.3.4”項下色譜條件進樣測定，HPLC 圖譜如圖3 所示。再運用中藥指紋圖譜總量統(tǒng)計矩（相似度）法分析，獲得總量零、一階、二階矩參數(shù)，結果見表2。

圖3 9 味歸肺和大腸經(jīng)中藥的HPLC 圖譜Fig. 3 HPLC fingerprint of nine traditional Chinese medicines attributed to lung and large intestine meridian

表2 9 味歸肺和大腸經(jīng)中藥的總量統(tǒng)計矩參數(shù)Table 2 Total statistical moment parameters of nine traditional Chinese medicines attributed to lung and large intestine meridian

4.2 7 個對照品的HPLC 圖譜

為準確建立結構與保留時間的關系，從而推導出歸肺與大腸經(jīng)的“印跡模板”特征。故在篩選驗證的成分時相似度不能太近，選取排在前50%的成分，建立相似度與保留時間的線性關系。從黃酮、蒽醌、鞣質類成分中選取排名依次為5、8、10、16、40、44、49 的大黃素-1-O-β-D-葡萄糖苷、大黃酚-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、3,3′-二甲基鞣花酸-4′-O-葡萄糖苷、山柰苷、蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷。按照“2.3.3”項下方法制備對照品溶液，按照“2.3.4”項下色譜條件測定其HPLC 指紋圖譜，如圖4 所示。圖4 中大黃酚-8-Oβ-D-葡萄糖苷和大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷的保留時間重疊。大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷保留時間與MCI相似度的相關性為0.867 3，回歸方程為S＝0.988 4＋1.797×10-4tR，R＝0.866 2（P＜0.01），見表3。提示歸肺和大腸經(jīng)成分的“印跡模板”特征性可用HPLC的保留時間測定。

圖4 7 個對照品的HPLC 圖譜Fig. 4 HPLC fingerprints of seven references substances

表3 7 個對照品的HPLC 保留時間與MCI 相似度的相關性及平均峰面積Table 3 Correlation between HPLC retention time and MCI similarity and average peak area of seven reference substances

4.3 7 個對照品和9 味藥材總量統(tǒng)計矩比較

按總量統(tǒng)計矩的加合性計算公式獲得7 個對照品與9 味藥材的整體總量統(tǒng)計矩參數(shù)，如表4 所示。二者的一階矩接近，說明7 個成分的整體“印跡模板”印跡作用與9 味歸肺與大腸經(jīng)的成分簇“印跡模板”印跡作用相近，但零階矩、二階矩相差很大，說明二者的成分簇的種類和數(shù)目不同，但7 個成分基本上能表征歸肺和大腸經(jīng)成分簇的“印跡模板”總體特征。

表4 7 個對照品和9 味藥材總量統(tǒng)計矩比較Table 4 Statistical moment comparison of total amount of seven reference substances and nine herbs

5 結論

本研究篩選出番瀉葉、訶子等11 味歸肺和大腸經(jīng)的中藥，計算出已報道成分的MCI，包括了萜類、黃酮類、苯丙素類、鞣質類、甾體類、有機酸類、糖苷類、生物堿類、醌類、其他類886 個成分，再根據(jù)各部位、成分與平均MCI 的相似性確定了前10位成分，多為萜類、苯丙素或生物堿類，其對照品難以獲得，考慮到黃酮、蒽醌、鞣質類成分平均MCI相似度均在0.95 以上，且在番瀉葉、訶子、石榴皮中集中分布，故以黃酮、蒽醌、鞣質類成分為代表，根據(jù)相似度排序選取蘆丁、山柰苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、大黃素-1-O-β-D-葡萄糖苷、3,3′-二甲基鞣花酸-4′-O-葡萄糖苷、大黃酚-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷7 個成分作為對照品，其保留時間對MCI 相似度進行回歸，二者相關系數(shù)為0.866 2（P＜0.01），說明MCI 能很好預測其印跡行為，各成分與色譜印跡作用存在較好的QSRR 性。7 個對照品按指紋圖譜峰面積得到的總量一、二階統(tǒng)計矩分別為45.48 min、26.39 min2，其15%的區(qū)間為 [44.46 min，46.50 min]。利用總量統(tǒng)計矩法分析9 味藥材的HPLC 圖譜，測得1008 個峰，與查閱到的成分數(shù)相近。按指紋峰數(shù)目算得總量統(tǒng)計一、二階矩分別為43.39 min、348.80 min2，其15%的區(qū)間為 [39.70 min，47.08 min]，與7 個對照品的總量統(tǒng)計矩的15%區(qū)間相互重疊，也就是有15%（正常是95%）把握認為二者不是一類歸經(jīng)物質，反之就有85%（正常是5%）把握認為是相同的歸經(jīng)物質，即7 個成分化學結構能85%把握表征歸肺和大腸經(jīng)中藥成分“印記模板”的特征。由于7 個成分的母核分別為蒽醌、黃酮、鞣酸類，因此可以初步判斷歸肺和大腸經(jīng)的物質基礎可用蒽醌類、黃酮類、鞣酸類為“印跡模板”的中藥成分群進行表征。

上述研究表明，MCI 能夠定量描述分子的結構信息，越接近者分子結構越相似，理化性質越相近，藥理作用越相似，并可利用QSRR 原理分析色譜印跡行為，并通過色譜學總量統(tǒng)計矩參數(shù)表征出來，相互進行驗證，這樣可將中藥成分體內(nèi)歸經(jīng)的復雜問題轉變成體外可測的色譜學印跡行為進行研究，極大地降低了中藥藥性的研究難度。如7 個成分按中藥化學母核歸屬為蒽醌類、黃酮類、鞣酸類，其母核結構類型迥異，但保留時間卻接近，特別是3,3′-二甲基鞣花酸-4′-O-葡萄糖苷和大黃素-1-O-β-D-葡萄糖苷的化學結構完全不同，但其保留時間卻相差不大，因此MCI 是表征中藥成分化學結構、關聯(lián)其化學性質、描述其生理藥理和藥劑學性質的重要方法，若與QSPR/QSRR 結合，將構建起中藥復方物質基礎、藥性、藥理研究的重用研究方法與工具。

前期本團隊創(chuàng)立了中醫(yī)藥超分子“氣析”理論，以中藥歸經(jīng)的物質基礎研究為重要內(nèi)容，若結合MCI，從中藥物質結構定量表征入手，先系統(tǒng)描述所歸經(jīng)成分的分子結構拓撲特征，尋找到基本成分結構，再與各類成分平均MCI 比較其相似性，從QSPR/QSRR 計算的角度獲得中藥歸經(jīng)信息，再進行色譜印跡行為驗證，就可初步確定中藥歸經(jīng)的客體分子特征，再運用超分子的結構分析技術，最終可揭示中藥歸經(jīng)的主客體分子結構全貌，實現(xiàn)中醫(yī)藥現(xiàn)代化。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突