李路 王文義 潘丹虹 林晴 付長(zhǎng)龍 鄭春松 馬德尊 葉錦霞

【摘 要】目的：觀察榮筋拈痛方對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨組織自噬的影響，探討其防治膝骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制。方法：將24只SD大鼠按照隨機(jī)分層法分為假手術(shù)組、模型對(duì)照組、榮筋拈痛方組，每組8只。除假手術(shù)組外，其他組采用改良Hulth法復(fù)制膝骨關(guān)節(jié)炎模型。給藥12周后，從假手術(shù)組和模型對(duì)照組中隨機(jī)抽取3只大鼠拍攝膝關(guān)節(jié)MRI，觀察模型是否成功。采集大鼠膝關(guān)節(jié)組織，HE染色法觀察軟骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，采用Mankin病理評(píng)分對(duì)關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)評(píng)分；免疫組織化學(xué)法觀察軟骨組織酵母自噬相關(guān)基因6同源物（Beclin1）及微管相關(guān)蛋白Ⅰ輕鏈3B（LC3B）的定位與表達(dá)。結(jié)果：MRI顯示，假手術(shù)組關(guān)節(jié)間隙正常，關(guān)節(jié)面平整；模型對(duì)照組關(guān)節(jié)間隙增寬，關(guān)節(jié)軟骨面不平整、局部缺損，結(jié)締組織增生，骨贅形成。榮筋拈痛方組大鼠骨關(guān)節(jié)炎模型關(guān)節(jié)軟骨的大體外觀及HE染色均改善明顯，Mankin軟骨評(píng)分高于模型對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。榮筋拈痛方組自噬蛋白Beclin1及LC3B表達(dá)均呈上升趨勢(shì)。結(jié)論：榮筋拈痛方可能通過(guò)提高自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3B的表達(dá)，改善軟骨細(xì)胞狀態(tài)，延緩關(guān)節(jié)軟骨退變。

【關(guān)鍵詞】 膝骨關(guān)節(jié)炎；榮筋拈痛方；軟骨組織；自噬；大鼠

Effect of Rongjin Niantong Fang（榮筋拈痛方）on the Expression of Beclin1 and LC3B in Cartilage Tissue of Rats with Knee Osteoarthritis

LI Lu，WANG Wen-yi，PAN Dan-hong，LIN Qing，F(xiàn)U Chang-long，ZHENG Chun-song，MA De-zun，YE Jin-xia

【ABSTRACT】Objective：To observe the effect of Rongjin Niantong Fang（榮筋拈痛方）on autophagy of cartilage tissue in rats with knee osteoarthritis，and explore its mechanism of prevention and treatment of knee osteoarthritis.Methods：Twenty four SD rats were randomly stratified into a sham operation group，a model control group，and a Rongjin Niantong Fang group，with 8 rats in each group.Except the sham operation group，other groups used the improved Hulth method to replicate knee osteoarthritis models.After 12 weeks of administration，3 rats were randomly selected from the sham operation group and the model control group to take MRI images of knee joint and observe whether the model was successful.Collect knee joint tissue from rats，observe the morphology and structure of cartilage tissue using HE staining method，and score the tissue morphology of joint cartilage using Mankin pathological score;immunohistochemical method was used to observe the localization and expression of yeast autophagy related gene 6 homolog（Beclin1）and microtubule associated protein I light chain 3B（LC3B）in cartilage tissue.Results：MRI showed that the joint space in the sham operation group was normal and the joint surface was flat;in the model control group，the joint space widened，the articular cartilage surface was uneven with local defects，and there were connective tissue hyperplasia，and osteophyte formation.The general appearance and HE staining of the articular cartilage in the Rongjin Niantong Formula group of rats with osteoarthritis model improved significantly，and the Mankin cartilage score was higher than the model control group，with a statistically significant difference（P < 0.01）.The expression of autophagy proteins Beclin1 and LC3B in the Rongjin Niantong Fang group showed an upward trend.Conclusion：Rongjin Niantong Fang may improve the state of chondrocytes and delay joint cartilage degeneration by increasing the expression of autophagy related proteins Beclin1 and LC3B.

【Keywords】 knee osteoarthritis;Rongjin Niantong Fang（榮筋拈痛方）;cartilage tissue;autophagy;rats

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種關(guān)節(jié)退行性疾病，其發(fā)病特征以膝關(guān)節(jié)腫痛、關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行性退變、軟骨下骨逐漸硬化為主［1］。隨著老齡化進(jìn)程加速，KOA發(fā)病率日益提高，給家庭和社會(huì)造成了很大的負(fù)擔(dān)。現(xiàn)代研究表明，軟骨細(xì)胞自噬與KOA的發(fā)生、發(fā)展聯(lián)系密切［2-3］。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，榮筋拈痛方治療KOA療效確

切［4］，體外實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)榮筋拈痛方可調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞自噬水平，改善軟骨細(xì)胞炎癥狀態(tài)［5］。本研究通過(guò)觀察榮筋拈痛方對(duì)KOA大鼠軟骨組織自噬的影響，探討其防治KOA的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng) 物 2月齡SPF級(jí)雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量（160±20）g，購(gòu)自杭州醫(yī)學(xué)院，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（浙）2019-0002。飼養(yǎng)環(huán)境設(shè)施由福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（閩）2019-0007。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處理方式符合倫理學(xué)要求。

1.2 藥 物 榮筋拈痛方（由牛膝、當(dāng)歸、羌活、獨(dú)活、防風(fēng)、甘草組成，專利號(hào)ZL20171028 4659.8）；榮筋拈痛方顆粒（江陰天江藥業(yè)有限公

司，批號(hào)2006001），藥物質(zhì)量安全可控［4］。

1.3 試 劑 Beclin1一抗、LC3B一抗（批號(hào)bs-1353R、bs-4843R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；二抗SP-9001試劑盒、DAB顯色試劑盒（批號(hào)222510112、ZLI-9019，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；無(wú)水乙醇、中性樹(shù)膠、二甲苯（批號(hào)100092683、10004160、10023418，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；異氟烷（批號(hào)20092101，瑞沃德生命科技有限公司）；HE染色試劑盒（批號(hào)G1003，武漢賽維爾生物科技有限公司）。

1.4 儀 器 生物自動(dòng)脫水機(jī)（型號(hào)ZT-14S，湖北省亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司）；生物組織自動(dòng)包埋機(jī)（型號(hào)TB-718E，湖北泰維醫(yī)療科技有限責(zé)任公司）；石蠟切片機(jī)（型號(hào)RM2135，德國(guó)萊卡公司）；磁共振儀［型號(hào)BioSpec 7，布魯克（北京）科技有限公司］；顯微圖像采集系統(tǒng)（型號(hào)DM4000B，德國(guó)Leica公司）；多功能真彩色細(xì)胞圖象分析管理系統(tǒng)（Image-Pro Plus，美國(guó)Media Cybernetics公司）。

2 方 法

2.1 分組與動(dòng)物模型制作 2月齡SPF級(jí)雄性SD大鼠24只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，采用隨機(jī)分層法分為假手術(shù)組、模型對(duì)照組和榮筋拈痛方組，每組

8只。術(shù)前用體積分?jǐn)?shù)為1.5%的異氟烷進(jìn)行吸入性麻醉，模型對(duì)照組和榮筋拈痛方組采用改良Hulth法完成KOA造模。大鼠膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)入路，切斷內(nèi)側(cè)副韌帶、前交叉韌帶，摘除內(nèi)側(cè)半月板［6］。假手術(shù)組僅劃開(kāi)雙側(cè)膝關(guān)節(jié)處皮膚，開(kāi)口大小和模型對(duì)照組相同，隨即縫合傷口。為預(yù)防感染，使用20萬(wàn)U的青霉素對(duì)大鼠進(jìn)行肌注，并常規(guī)消毒

傷口。

2.2 藥物干預(yù) 藥物劑量按照人和動(dòng)物藥物臨床等效劑量換算，榮筋拈痛方組劑量為1.9 g·kg-1·d-1，將榮筋拈痛方顆粒用生理鹽水配制為溶液灌胃。假手術(shù)組、模型對(duì)照組均予等量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的生理鹽水，按1 mL·（100 g）-1·d-1灌胃，持續(xù)12周。

2.3 大鼠膝關(guān)節(jié)MRI掃描 藥物干預(yù)結(jié)束后，隨機(jī)抽取假手術(shù)組、模型對(duì)照組大鼠各3只，拍攝膝關(guān)節(jié)MRI，觀察KOA進(jìn)展情況。采用異氟烷吸入性麻醉裝置對(duì)大鼠進(jìn)行持續(xù)麻醉，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)大鼠生命體征直至掃描完成。將大鼠仰臥位固定于檢查板，膝伸直輔以軟墊固定，環(huán)形表面線圈固定于關(guān)節(jié)正上方，線圈中心正對(duì)脛骨平臺(tái)，采用冠狀位和矢狀面T2WI序列進(jìn)行成像。T2WI序列采用TurboRARE序列，參數(shù)如下：TR = 4554.863 ms，

TE = 35.0 ms，層厚0.4 mm，矩陣320×320，F(xiàn)OV 30 mm×20 mm，掃面層數(shù)13層，平均次數(shù)

4次，掃描時(shí)間9 min 43 s 22 ms。

2.4 動(dòng)物取材 各組大鼠術(shù)前用體積分?jǐn)?shù)為1.5%的異氟烷吸入性麻醉成功后，取大鼠右側(cè)膝關(guān)節(jié)股骨髁及脛骨平臺(tái)以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛固定48 h，再進(jìn)行常規(guī)脫鈣、脫水、透明，最后使用石蠟進(jìn)行包埋，5 μm切片備染，進(jìn)行蘇木精-伊紅染色（HE染色）和免疫組化檢測(cè)。

2.5 指標(biāo)檢測(cè)

2.5.1 大體觀察 各組動(dòng)物處死后，取右側(cè)股骨髁以及脛骨平臺(tái)，對(duì)軟骨面進(jìn)行肉眼觀察。

2.5.2 HE染色觀察軟骨組織形態(tài)并進(jìn)行Mankin評(píng)分 組織切片進(jìn)行HE染色，使用光鏡觀察軟骨組織變化，并采集圖片。每組隨機(jī)選6張組織切片，對(duì)各組組織切片的形態(tài)進(jìn)行Mankin評(píng)分［7］。

2.5.3 免疫組化觀察關(guān)節(jié)軟骨組織自噬蛋白Beclin1和LC3B的定位與表達(dá) 將各組石蠟包埋塊切片、脫蠟、脫水，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的H2O2孵育5 min；使用微波加熱，進(jìn)行抗原修復(fù)，使用山羊血清封閉液室溫封閉。孵育一抗、二抗：在切片上滴加一抗，4 ℃過(guò)夜，滴加二抗（IgG），37 ℃

孵育20 min。DAB顯色，蘇木素復(fù)染1 min。乙醇梯度脫水、使用二甲苯進(jìn)行透明［3］，最后使用中性樹(shù)膠完成封片，200倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，采用多功能真彩色細(xì)胞圖像分析管理系統(tǒng)，分析所獲取的圖片并得出陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)百分率。每組隨機(jī)選6只大鼠參與統(tǒng)計(jì)。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分級(jí)0～ < 1% =

0級(jí)、1%～10% = 1級(jí)、11%～ 50% = 2級(jí)、51%～ 80% = 3級(jí)、81%～ 100% = 4級(jí)。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，組間比較采用ANOVA方差分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 各組大鼠一般情況 假手術(shù)組大鼠狀態(tài)良好，模型對(duì)照組、榮筋拈痛方組大鼠術(shù)后1周出現(xiàn)自主活動(dòng)減少、活動(dòng)受限等現(xiàn)象，1周左右活動(dòng)逐漸恢復(fù)正常，且榮筋拈痛方組大鼠表現(xiàn)優(yōu)于模型對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，假手術(shù)組大鼠膝關(guān)節(jié)外觀形態(tài)正常，髕骨及髕韌帶形態(tài)正常。模型對(duì)照組膝關(guān)節(jié)腫大較明顯，側(cè)面可見(jiàn)瘢痕增生組織形成。給予榮筋拈痛方后膝關(guān)節(jié)腫脹度減輕，骨贅增生明顯減少。見(jiàn)

圖1。

3.2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)MRI觀察 假手術(shù)組可見(jiàn)關(guān)節(jié)間隙正常，內(nèi)外側(cè)半月板結(jié)構(gòu)完整，股骨髁和脛骨平臺(tái)關(guān)節(jié)面平整。模型對(duì)照組關(guān)節(jié)間隙增寬，內(nèi)側(cè)半月板缺如，關(guān)節(jié)軟骨面不平整、軟骨層變薄、局部缺損，結(jié)締組織增生，形成明顯骨贅，關(guān)節(jié)腫脹、積液明顯，模型制作成功。見(jiàn)圖2。

3.3 各組大鼠膝關(guān)節(jié)組織形態(tài)學(xué)觀察 各組股骨髁軟骨組織的HE染色顯示：假手術(shù)組關(guān)節(jié)軟骨表面相對(duì)光滑完整，層次分明，結(jié)構(gòu)完整；軟骨細(xì)胞分布均勻，大小適中，無(wú)雙核現(xiàn)象出現(xiàn)，潮線清晰可見(jiàn)。模型對(duì)照組關(guān)節(jié)軟骨表面出現(xiàn)缺損，層次紊亂，結(jié)構(gòu)破壞；軟骨細(xì)胞形態(tài)異常，變小，分布紊亂，較多雙核現(xiàn)象；潮線不清晰，扭曲或中斷；呈現(xiàn)典型骨關(guān)節(jié)炎性改變。給予榮筋拈痛方后大鼠關(guān)節(jié)軟骨退變程度明顯好轉(zhuǎn)，軟骨表面較為光滑完整，層次有所改善，軟骨細(xì)胞形態(tài)稍有異常，細(xì)胞變大，分布較均一，少量雙核現(xiàn)象；潮線略不清晰。見(jiàn)圖3。

3.4 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨Mankin評(píng)分比較 與假手術(shù)組比較，模型對(duì)照組膝關(guān)節(jié)軟骨Mankin評(píng)分顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；榮筋拈痛方組雖Mankin評(píng)分增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ﹥ 0.05）。與模型對(duì)照組比較，榮筋拈痛方組Mankin評(píng)分降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

（P < 0.01）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨Mankin評(píng)分比較? ?（分，）

組別 動(dòng)物數(shù)/只 Mankin評(píng)分

假手術(shù)組 6 ? ? ? ? 1.00±0.63

模型對(duì)照組 6 ? ? ? ? 9.67±1.031）

榮筋拈痛方組 6 ? ? ? ? 2.00±0.892）

注 與假手術(shù)組比較，1）P < 0.01；與模型對(duì)照組比較，2）P < 0.01。

3.5 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織蛋白表達(dá)比較 光鏡顯微鏡下，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)及基質(zhì)棕黃色或棕褐色為陽(yáng)性，藍(lán)染為陰性。與假手術(shù)組比較，模型對(duì)照組和榮筋拈痛方組軟骨組織中Beclin1和LC3B陽(yáng)性率明顯降低（P < 0.01）；與模型對(duì)照組比較，榮筋拈痛方組Beclin1和LC3B陽(yáng)性率有不同程度的提高（P < 0.01）。見(jiàn)表2，圖4、圖5。

表2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織蛋白表達(dá)差異比較

（%，）

組別 動(dòng)物數(shù)/只 Beclin1陽(yáng)性率 LC3B陽(yáng)性率

假手術(shù)組 6 ? 45.67±2.52 ? 40.67±3.51

模型對(duì)照組 6 ? ? 8.67±2.521） ? ? 7.33±0.581）

榮筋拈痛方組 6 ? 20.33±6.662） ? 24.33±2.082）

注 與假手術(shù)組比較，1）P < 0.01；與模型對(duì)照組比較，2）P < 0.01。

4 討 論

KOA是骨傷科臨床常見(jiàn)退行性疾病，多發(fā)于中老年人，屬中醫(yī)學(xué)“痹證”“痿證”范疇。課題組從中醫(yī)學(xué)“筋骨”理論出發(fā)，提出KOA病機(jī)為“本痿標(biāo)痹”，主張補(bǔ)肝腎、益氣血以治痿，祛風(fēng)濕、止痹痛以治痹［8］，國(guó)醫(yī)大師陳可冀院士基于中醫(yī)“肝主筋、腎主骨”理論和對(duì)《清宮配方集成》中骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）治療方藥數(shù)據(jù)挖掘基礎(chǔ)上審定組方而成榮筋拈痛方，治療OA具有較好的療效。榮筋拈痛方由牛膝、當(dāng)歸、獨(dú)活、羌活、防風(fēng)和甘草組方。牛膝苦、甘、酸、平，歸肝腎經(jīng)。重用牛膝以補(bǔ)肝腎而壯筋骨，且牛膝能活血以通利肢節(jié)筋脈，為君藥。臣以當(dāng)歸養(yǎng)血和血，以榮筋骨血脈。牛膝、當(dāng)歸，君臣相伍，補(bǔ)肝腎，壯筋骨，又兼活血，寓治風(fēng)先治血，血行風(fēng)自滅之意。獨(dú)活善治伏風(fēng)，除久痹，且性擅下行；羌活祛風(fēng)濕，利關(guān)節(jié)，止痛；防風(fēng)祛風(fēng)勝濕止痛。三藥相配，除一身之痹痛，以達(dá)祛風(fēng)濕、止痹痛之效，為佐藥。甘草善治四肢拘攣，緩急止痛，更調(diào)和諸藥，為使藥。諸藥配合，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕和止痹痛之效，長(zhǎng)期應(yīng)用于痹證日久、肝腎兩虛之OA的臨床治療，療效確切。前期研究證實(shí)，榮筋拈痛方能有效緩解患者的癥狀及體征，延緩KOA的進(jìn)展［4］，具有抑制炎癥、抑制分解代謝、促進(jìn)合成代謝的功效；同時(shí)，能調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞自噬水平，減輕軟骨細(xì)胞炎癥［4］。本研究進(jìn)一步探討其在動(dòng)物水平的作用。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，改良Hulth法建立的大鼠OA模型有以下優(yōu)勢(shì)：僅切斷大鼠前交叉韌帶，操作比較簡(jiǎn)單、創(chuàng)傷較小，可保持一定的膝關(guān)節(jié)穩(wěn)定性，有利于成功復(fù)制動(dòng)物模型［9］。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型對(duì)照組關(guān)節(jié)間隙明顯增寬，關(guān)節(jié)軟骨面不平整、局部缺損，伴有骨贅增生，表明改良Hulth法建立的大鼠OA模型比較成功。榮筋拈痛方干預(yù)后，與模型對(duì)照組比較，膝關(guān)節(jié)腫脹度減輕，骨贅增生明顯減少，HE染色也發(fā)現(xiàn)軟骨表面較為光滑完整，軟骨層次優(yōu)于模型對(duì)照組，軟骨細(xì)胞形態(tài)異常也有好轉(zhuǎn)，明顯減輕了軟骨結(jié)構(gòu)損傷，延緩了膝骨關(guān)節(jié)軟骨退變。

自噬是一種維持真核細(xì)胞分解代謝穩(wěn)態(tài)的重要途徑［10］，是細(xì)胞進(jìn)行“自我吞噬”的過(guò)程，在應(yīng)激條件下，細(xì)胞器、大分子被吞噬直至分解，參與體內(nèi)循環(huán)，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。Beclin1是在自噬中起正調(diào)控作用的酵母Atg6同源物［11］，是自噬的關(guān)鍵調(diào)控因子，負(fù)責(zé)自噬體的成核，參與溶酶體的融合和降解，它的表達(dá)上調(diào)是自噬過(guò)程激活的重要標(biāo)

志［12］。LC3B是自噬體標(biāo)志性基因LC3的亞型之一，其含量隨自噬泡的增加而增加，可作為自噬診斷指標(biāo)［13］。Beclin1和LC3B的表達(dá)增加表明軟骨細(xì)胞自噬能力增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)免疫組化結(jié)果顯示，模型對(duì)照組軟骨組織中Beclin1和LC3B表達(dá)明顯降低，說(shuō)明KOA模型中自噬功能降低；而給予榮筋拈痛方后軟骨組織中Beclin1和LC3B表達(dá)明顯增高，表明提高了軟骨細(xì)胞的自噬功能，減輕了軟骨組織損傷。

綜上所述，榮筋拈痛方可改善KOA大鼠軟骨結(jié)構(gòu)，延緩病理進(jìn)程，提高自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平。KOA發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中伴隨著自噬的動(dòng)態(tài)變化，本研究未能將榮筋拈痛方在KOA不同階段對(duì)軟骨細(xì)胞自噬水平的影響進(jìn)行闡明，探討其通過(guò)何種機(jī)制對(duì)軟骨自噬產(chǎn)生影響?？蛇M(jìn)一步（下轉(zhuǎn)第11頁(yè)）

（上接第5頁(yè)）進(jìn)行病毒載體等實(shí)驗(yàn)，研究榮筋拈痛方對(duì)KOA的作用機(jī)制，有利于揭示KOA的發(fā)病機(jī)制，確立治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)，為其臨床診斷與治療提供參考。

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收稿日期：2023-01-19；修回日期：2023-02-27