娜迪熱·艾爾肯,彭軍,3,范芳芳,李茜

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830000;2.新疆中藥炮制研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆 烏魯木齊 830000;3.新疆理化技術(shù)研究所干旱區(qū)植物資源與化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆 烏魯木齊 830000)

支氣管哮喘(哮喘)是一種常見(jiàn)的慢性炎癥性呼吸道疾病,影響著超過(guò)3.3億兒童和成人,預(yù)計(jì)到2025年受影響的人口將增加到4億[1]。隨哮喘患病率的升高,已成為我國(guó)的一項(xiàng)重大公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)。驅(qū)動(dòng)蛋白家族 3A 基因(Kif3a)是哮喘的易感性位點(diǎn)之一,在Kif3a敲除的哮喘小鼠模型中小鼠氣道反應(yīng)明顯增高[2]。Hedgehog(HH)基因家族共包括3個(gè)成員Sonic hedgehog(SHH)、Indian hedgehog(IHH)和Desert hedgehog(DHH),SHH信號(hào)通路的上調(diào)誘導(dǎo)過(guò)敏性哮喘[3-4]。Kif3a的敲除或者突變會(huì)阻斷Hedgehog信號(hào)的傳導(dǎo)[5]。因此,Kif3a可通過(guò)調(diào)控SHH信號(hào)通路改善哮喘氣道炎癥,有效緩解哮喘癥狀。目前臨床治療中,常用藥物是抗炎糖皮質(zhì)激素及支氣管擴(kuò)張劑等,但長(zhǎng)期使用引起不良反應(yīng)[6]。近年來(lái),中藥在減輕哮喘癥狀、控制哮喘發(fā)作、防止哮喘復(fù)發(fā)等方面具有治療優(yōu)勢(shì)[7]。

洋甘菊又名母菊,拉丁名MatricarlachamomillaL.,《中華本草》中記載其具有散氣消炎、軟堅(jiān)消腫、祛風(fēng)止痛等功效?，F(xiàn)代研究表明,洋甘菊具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗抑郁、抗癌、保肝、抗糖尿病等多種藥理活性[8]。洋甘菊作為新疆地區(qū)習(xí)用藥材,是新疆傳統(tǒng)名方祖卡木顆粒的主要藥材之一,治療呼吸系統(tǒng)疾病歷史悠久[9]。洋甘菊醇提取物通過(guò)調(diào)節(jié)Th1/Th2的平衡對(duì)Balb/c小鼠巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生影響,發(fā)揮抗炎作用[10]。在一項(xiàng)關(guān)于短期服用傳統(tǒng)草藥的臨床試驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)洋甘菊可以顯著改善兒童普通感冒的哮喘癥狀[11]。然而,洋甘菊在改善和緩解哮喘癥狀的作用機(jī)制仍不清楚。前期,我們已通過(guò)工藝優(yōu)化獲得洋甘菊的活性組分,總黃酮含量為30.55 mg·g-1,其主要活性成分為黃酮(芹菜素、木犀草素)或類(lèi)黃酮醇衍生物(槲皮素)[12]。本實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步研究洋甘菊活性組分改善脂多糖(LPS)誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞(16HBE)的損傷,并探討其保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 16HBE購(gòu)自上海雅吉生物。

1.2 儀器與試劑 Smart Cell HF-90CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(上海力康儀器有限公司);TDL-60B臺(tái)式低速離心機(jī)(上海安亭儀器廠);LSRFortessa流式細(xì)胞儀(BD);MyCycler Thermal Cycler PCR儀(Bio-Rad);7500 Fast Real Time PCR instrument(ABI);Mini-PROTEAN Tetra system蛋白轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad);xMarkTM酶標(biāo)儀(Bio-Rad)。

角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基 KM(Sciencell,批號(hào)：2101);青霉素-鏈霉素雙抗(10 000 U)(Gibco,批號(hào)：15070-063);PBS磷酸鹽緩沖液粉劑(北京中杉金橋生物,批號(hào)：ZLI-9062);CCK-8細(xì)胞增殖/毒性檢測(cè)試劑盒(全式金生物,批號(hào)：FC101-03);脂多糖(Sigma,批號(hào)：L2630);乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(南京建成,批號(hào)：A020-2-2);地塞米松(Sigma,批號(hào)：D4902);Annexin V-PE/7AAD Kit(BD,批號(hào)：559763)。一抗：beta-Actin (批號(hào)：100166-MM10)購(gòu)自義翹神州;SHH (C9C5)抗體(批號(hào)：#2207)和KIF3A (D7G3)抗體(批號(hào)：#8507)購(gòu)自美國(guó)CST公司;Anti-Gli1抗體(批號(hào)：ab273018)購(gòu)自Abcam公司;Ptch1 抗體(批號(hào)：PA5-87508)購(gòu)自賽默飛。二抗：山羊抗兔IgG辣根過(guò)氧化物酶(批號(hào)：ab205718)和山羊抗小鼠IgG辣根過(guò)氧化物酶(批號(hào)：ab205719)購(gòu)自Abcam公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 洋甘菊活性組分的制備 洋甘菊活性組分的制備工藝參數(shù)[12]：70%乙醇,料液比1∶10(W/V),回流提取1次,時(shí)間1 h。

1.3.2 16HBE的培養(yǎng)與炎癥模型細(xì)胞建立 16HBE采用角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基 KM(含1%雙抗)于37 ℃、飽和濕度、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細(xì)胞密度超80%,即可進(jìn)行傳代培養(yǎng),進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后用于實(shí)驗(yàn)。LPS(2.5 μg·mL-1)干預(yù)16HBE 16 h,建立炎癥細(xì)胞模型。

1.3.3 洋甘菊活性組分藥物干預(yù)濃度及時(shí)間摸索 收集16HBE,用完全培養(yǎng)基制備成5×104mL-1單細(xì)胞懸液,接種至96孔板中(100 μL/孔),37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h貼壁后,加入不同濃度洋甘菊活性組分(0、1、10、100、200、400 μg·mL-1),分別干預(yù)24 h和48 h。

1.3.4 實(shí)驗(yàn)分組 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞分成以下4組：空白對(duì)照組、LPS模型組、陽(yáng)性藥物組(1 μmol·L-1地塞米松干預(yù)2 h)、洋甘菊活性組分組(200 μg·mL-1,48 h)。

1.3.5 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖 將16HBE接種至96孔板中(5×103/孔),37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h貼壁后,分別按照“1.3.2”和“1.3.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行干預(yù)。加入100 μL配制好的10% CCK-8溶液,繼續(xù)孵育1 h后用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的OD值。

1.3.6 LDH水平檢測(cè) 將16HBE接種至96孔板中(5×103/孔),37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h貼壁后,按照“1.3.2”項(xiàng)下方法干預(yù)后,收集上清,在室溫下以1 000 r·min-1離心10 min,用酶標(biāo)儀測(cè)定上清中LDH活性。

1.3.7 流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集16HBE,用完全培養(yǎng)基制備成5×104mL-1單細(xì)胞懸液,接種至6孔板中;按實(shí)驗(yàn)分組處理后,將每組細(xì)胞瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液與細(xì)胞一并吸至離心管內(nèi)(內(nèi)含已經(jīng)懸浮的發(fā)生凋亡或壞死的細(xì)胞),1 000 r·min-1離心5 min,棄上清。用預(yù)冷的PBS洗滌2遍,棄干凈上清。加入500 μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞,過(guò)200目篩網(wǎng),制成單細(xì)胞懸液。每管加入5 μL Annexin V-PE和10 μL 7-AAD,輕輕混勻,4 ℃避光放置5 min。在30 min內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3.8 實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)基因表達(dá) 用TRIzol試劑提取細(xì)胞中的總RNA,使用cDNA反轉(zhuǎn)試劑盒將所有RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法定量分析kif3a、SHH、Ptch1、Glil mRNA的表達(dá)情況。引物采用 Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì),由生工生物技術(shù)公司合成。引物序列見(jiàn)表1。熱循環(huán)程序包括在94 ℃下保持2 min, 30個(gè)循環(huán),如下：94 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s。內(nèi)參為GAPDH。采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)mRNA表達(dá)量。

表1 熒光定量mRNA檢測(cè)引物信息表

1.3.9 Western blot分析 用RIPA裂解后,從細(xì)胞中提取總蛋白。用BCA法測(cè)定蛋白濃度后,對(duì)蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳和PVDF膜轉(zhuǎn)移,隨后5%的脫脂牛奶封閉1 h。PVDF膜在4 ℃下孵育一抗過(guò)夜,抗體稀釋倍數(shù)為1∶1 000。室溫下孵育二抗1 h。使用ECL檢測(cè)試劑盒檢測(cè)免疫標(biāo)記條帶(蛋白質(zhì)條帶)的化學(xué)發(fā)光信號(hào)。

2 結(jié)果

2.1 LPS誘導(dǎo)炎癥模型 結(jié)果顯示,通過(guò)2.5 μmol·L-1LPS干預(yù)16HBE 16 h建立炎癥細(xì)胞模型。LPS干預(yù)后,細(xì)胞增殖能力降低(n=5,與空白對(duì)照組比較,P<0.05),LDH釋放增加(n=5,與空白對(duì)照組比較,P<0.05),見(jiàn)圖1。

圖1 LPS干預(yù)對(duì)細(xì)胞增殖及釋放LDH的影響

2.2 洋甘菊活性組分對(duì)細(xì)胞增殖的影響 結(jié)果顯示,通過(guò)加入0、1、10、100、200、400 μg·mL-1的洋甘菊活性組分,分別干預(yù)24 h和48 h,發(fā)現(xiàn)洋甘菊活性組分干預(yù)濃度200 μg·mL-1,時(shí)間48 h后細(xì)胞活性被有效逆轉(zhuǎn),見(jiàn)圖2(n=5)。LPS干預(yù)后顯著抑制了細(xì)胞的增殖,而干預(yù)濃度200 μg·mL-1的洋甘菊活性組分可以有效逆轉(zhuǎn)LPS對(duì)細(xì)胞的損傷,促進(jìn)16HBE增殖,見(jiàn)圖3(n=5,與空白對(duì)照組比較,P<0.05;與模型組比較,P<0.05)。因此,采用濃度200 μg·mL-1的洋甘菊活性組分進(jìn)行后續(xù)研究。

圖2 洋甘菊活性組分濃度摸索

圖3 洋甘菊活性組分對(duì)LPS干預(yù)后細(xì)胞增殖及凋亡的影響

2.3 洋甘菊活性組分對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 結(jié)果顯示,2.5 μmol·L-1LPS干預(yù)后顯著誘導(dǎo)16HBE的凋亡。200 μg·mL-1洋甘菊活性組分干預(yù)48 h后,逆轉(zhuǎn)了LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡見(jiàn)圖3和圖4(n=5,與空白對(duì)照組比較,P<0.01;與模型組比較,P<0.01)。

A.空白對(duì)照組;B.LPS模型組;C.LPS模型+地塞米松組;D.LPS模型+洋甘菊活性組分組圖4 洋甘菊活性組分對(duì)LPS干預(yù)后細(xì)胞凋亡的影響

2.4 洋甘菊活性組分對(duì)Kif3a和SHH信號(hào)通路中關(guān)鍵指標(biāo)基因表達(dá)的影響 Kif3a是調(diào)控微管功能和運(yùn)輸?shù)漠惾垠w驅(qū)動(dòng)蛋白2的亞基,其基因位點(diǎn)被多次證明與哮喘相關(guān),通過(guò)前期蛋白組學(xué)實(shí)驗(yàn)篩選出Kif3a可能調(diào)控Sonic Hedgehog(SHH)信號(hào)通路。LPS干預(yù)后,16HBE中Kif3a基因表達(dá)水平降低,SHH信號(hào)通路激活,其中SHH、Ptch1、Glil基因表達(dá)升高。洋甘菊活性組分有效逆轉(zhuǎn)以上指標(biāo)的變化,促進(jìn)Kif3a基因表達(dá),抑制SHH信號(hào)通路激活,其中SHH、Ptch1、Glil基因表達(dá)降低,見(jiàn)圖5(n=3,與空白對(duì)照組比較,P<0.05;與LPS模型組比較,P<0.05)。

A.洋甘菊活性組分對(duì)LPS干預(yù)后Kif3a基因表達(dá)影響;B.洋甘菊活性組分對(duì)LPS干預(yù)后SHH基因表達(dá)影響;C.洋甘菊活性組分對(duì)LPS干預(yù)后Ptch1基因表達(dá)影響;D.洋甘菊活性組分對(duì)LPS干預(yù)后Glil基因表達(dá)影響圖5 洋甘菊活性組分對(duì)LPS干預(yù)后Kif3a基因及SHH通路的影響

2.5 洋甘菊活性組分對(duì)Kif3a和SHH信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響 結(jié)果顯示,LPS干預(yù)后,16HBE中Kif3a蛋白表達(dá)水平降低,SHH信號(hào)通路激活,其中SHH、Ptch1、Glil蛋白表達(dá)升高。洋甘菊活性組分有效逆轉(zhuǎn)以上指標(biāo)的變化,上調(diào)Kif3a蛋白表達(dá),抑制SHH信號(hào)通路激活,其中SHH、Ptch1、Glil蛋白表達(dá)降低,見(jiàn)圖6和圖7(n=3,與空白對(duì)照組比較,P<0.05;與LPS模型組比較,P<0.05)。

A.洋甘菊活性組分對(duì)LPS干預(yù)后Kif3a蛋白表達(dá)影響;B.洋甘菊活性組分對(duì)LPS干預(yù)后SHH蛋白表達(dá)影響;C.洋甘菊活性組分對(duì)LPS干預(yù)后Ptch1蛋白表達(dá)影響;D.洋甘菊活性組分對(duì)LPS干預(yù)后Glil蛋白表達(dá)影響圖6 洋甘菊活性組分對(duì)LPS干預(yù)后Kif3a蛋白及SHH通路的影響

圖7 洋甘菊活性組分對(duì)LPS干預(yù)后Kif3a蛋白及SHH通路的影響

3 討論

哮喘是一種常見(jiàn)的慢性呼吸系統(tǒng)疾病,近年來(lái)其發(fā)病率呈不斷上升趨勢(shì),給個(gè)人身心健康和家庭生活質(zhì)量帶來(lái)了嚴(yán)重影響。其發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,主要的發(fā)生由于Th2的過(guò)表達(dá),致使Th1/Th2之間失衡,并且Th2細(xì)胞分泌的物質(zhì)與氣道炎癥、分泌物增多及纖維化密切相關(guān)[13]。哮喘的病理變化的基礎(chǔ)是氣道炎癥,因此本研究中采用LPS誘導(dǎo)16HBE,建立哮喘炎癥細(xì)胞模型。LPS干預(yù)后,16HBE受損、活力顯著降低并誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。洋甘菊富含黃酮類(lèi)活性成分,具有抗氧化、消炎等功效。本研究中發(fā)現(xiàn),洋甘菊活性組分在濃度200 μg·mL-1處理48 h時(shí),可以顯著逆轉(zhuǎn)LPS對(duì)細(xì)胞的損傷并促進(jìn)增殖,減弱LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,對(duì)哮喘炎癥16HBE起到保護(hù)作用。因此,進(jìn)一步探討洋甘菊活性組分在治療和改善哮喘炎癥16HBE的作用機(jī)制。

近年來(lái),Kif3a基因已被發(fā)現(xiàn)在哮喘患者中異常表達(dá),并且哮喘氣道炎癥中發(fā)揮重要作用的IL-4以及IL-13位于該區(qū)域,因此該靶點(diǎn)是參與哮喘氣道炎癥調(diào)控的可能機(jī)制,是治療哮喘的新的靶點(diǎn)和方向[2,14]。它可編碼驅(qū)動(dòng)蛋白2(kinesin-2)的運(yùn)動(dòng)亞單位,在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、分化、細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)染哂兄匾饔肹15]。Kif3a是纖毛運(yùn)動(dòng)蛋白馬達(dá)的一部分,在肺中活動(dòng)纖毛可協(xié)助黏液纖毛發(fā)揮清除作用,纖毛細(xì)胞通過(guò)多種信號(hào)通路(如SHH)介導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo),影響細(xì)胞形態(tài)發(fā)生、穩(wěn)態(tài)和器官的修復(fù)[15-16]。Hedgehog(HH)信號(hào)通路中HH蛋白與Ptch結(jié)合可解除對(duì)Smo的抑制作用,導(dǎo)致下游Gli修飾為轉(zhuǎn)錄激活因子,進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)激活Gli1和Ptch1等靶基因轉(zhuǎn)錄。目前,已有一些研究表明SHH信號(hào)通路在支氣管哮喘的發(fā)病過(guò)程中起著重要的作用[15,17-18]。本研究中,LPS干預(yù)后,16HBE內(nèi)Kif3a在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平顯著降低,SHH、Ptch1、Gli1在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平顯著升高,表明哮喘炎癥細(xì)胞中SHH信號(hào)通路處于異常激活狀態(tài)。之前研究發(fā)現(xiàn),Kif3a敲除的小鼠對(duì)空氣過(guò)敏原煙曲霉和室內(nèi)塵螨提取物高度敏感,導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性和Th2介導(dǎo)的嗜酸性粒細(xì)胞炎癥增加[15]。本實(shí)驗(yàn)中,洋甘菊活性組分處理后可顯著逆轉(zhuǎn)蛋白表達(dá),增加Kif3a轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平并降低SHH、Ptch1、Gli1轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)。因此,洋甘菊活性組分可以通過(guò)上調(diào)Kif3a,并進(jìn)一步下調(diào)SHH信號(hào)通路,保護(hù)LPS誘導(dǎo)損傷的16HBE。

本研究表明,洋甘菊活性組分可逆轉(zhuǎn)LPS對(duì)16HBE的損傷和凋亡,通過(guò)Kif3a調(diào)控SHH信號(hào)通路,改善哮喘氣道炎癥,在哮喘治療中發(fā)揮作用。