李 強(qiáng),羅 金,陽佳寧,高宏濤,劉 璇,賀建武,2

(1.吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,湖南 吉首 416000;2.吉首大學(xué)杜仲綜合利用技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室,湖南 吉首 416000)

纖維素是生態(tài)圈中最豐富的有機(jī)物質(zhì),是植物生物量的主要組成部分,但纖維素尤其是木質(zhì)纖維素中相鄰多糖可構(gòu)成高度有序的結(jié)晶序列,難以降解進(jìn)而影響其高效利用.近年來,相關(guān)研究顯示食草性動(dòng)物的消化道及糞便中具有較強(qiáng)纖維素降解功能的微生物菌群[1-4].梁澤毅等[5]認(rèn)為牦牛常年生活在低壓缺氧、嚴(yán)寒、食物匱乏環(huán)境中,較其他反芻動(dòng)物擁有更快的纖維素降解速率,他們系統(tǒng)梳理了不同品種、不同年齡段牦牛瘤胃微生物群落及影響因素.全基因組研究證實(shí)了反芻動(dòng)物牛不含纖維素降解酶的編碼基因,理論上只能依賴其瘤胃(后腸)中的微生物進(jìn)行草料分解,這類瘤胃微生物中編碼纖維素降解功能的基因組水平較高,是高效纖維素降解菌篩選的理想目標(biāo)[6].毛婷等[7]利用剛果紅平板染色法結(jié)合纖維素酶活性測定從甘肅省牦牛糞便中篩選出了一株Bacilluspumilus菌,該菌能有效降解玉米秸.

本研究擬從高海拔的青藏高原牦牛主產(chǎn)區(qū)西藏境內(nèi)采集牦牛糞便樣品,篩選樣品中降解纖維素能力較強(qiáng)的菌株,并初步分析其產(chǎn)纖維素降解酶的能力,以期為后續(xù)產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 糞便采集及預(yù)處理

本試驗(yàn)的牦牛生活在西藏納木錯(cuò),糞便樣品來源為5歲齡健康無腹瀉公牦牛的新鮮糞便.用小鏟取樣直接裝入樣品袋,帶回實(shí)驗(yàn)室,置于4 ℃冰箱中保存.

1.2 培養(yǎng)基的制備

富集培養(yǎng)基的制備參考文獻(xiàn)[7]的方法,并在其基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化：CMC-Na 10 g,酵母粉10 g,KH2PO41 g,NaCl 10 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,牦牛糞浸汁5 mL,加蒸餾水至1 000 mL,自然pH,121 ℃條件下滅菌20 min.

分離培養(yǎng)基為羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)培養(yǎng)基：CMC-Na l0 g,酵母膏1 g,瓊脂20 g,加蒸餾水至1 000 mL,在pH值7,121 ℃條件下滅菌20 min后制成分離培養(yǎng)皿,冷卻備用.

濾紙條崩解培養(yǎng)基：KH2PO41 g,MgSO4·7H2O 0.4 g,(NH4)2SO43 g,酵母粉0.1 g,加蒸餾水至1000 mL,121 ℃條件下滅菌20 min.

產(chǎn)酶培養(yǎng)基：(NH4)2SO42.0 g,KH2PO43.0 g,CaCl20.5 g,FeSO4·7H2O 7.5 mg,MgSO40.5 g,CoCl23.0 mg,ZnSO4·7H2O 2.0 mg,MnSO4·H2O 2.5 mg,加蒸餾水至1 000 mL,在pH值7,121 ℃條件下滅菌20 min.

1.3 纖維素降解菌的篩選

從樣品袋中取出牦牛糞便,用滅菌的手術(shù)刀剖開并取糞便的中心位置1.0 g樣品裝入有玻璃珠的90 mL無菌水中,連續(xù)振蕩30 min混勻.取10 mL菌懸液接入90 mL富集培養(yǎng)基中,在35 ℃,170 r/min恒溫條件下振蕩培養(yǎng),每隔72 h取10%(體積比)菌懸液轉(zhuǎn)接至新的富集培養(yǎng)基中培養(yǎng),連續(xù)富集馴化5次.

各處理富集培養(yǎng)液過濾后涂布至CMC-Na培養(yǎng)基,55 ℃下倒置培養(yǎng)2 d.剛果紅染色后,挑選透明抑菌圈大的菌落進(jìn)行四分法畫線,直至獲得純培養(yǎng)物.

1.4 纖維素酶活的測定

將初篩得到的菌株接種到產(chǎn)酶培養(yǎng)基中,在55 ℃,200 r/min條件下培養(yǎng)2 d后,于4 ℃,8 000 r/min條件下離心10 min,取其上清液(粗酶液)進(jìn)行羧甲基纖維素酶(CMCase)活性測定.采用DNS比色法[8]測定濾紙酶(FPase)活性與纖維素內(nèi)切酶(CMCase)活性,參考Parry等[9]的方法測定外切葡聚糖酶(EGLase)活性與β-葡萄糖苷酶(BGLase)活性.

1.5 不同條件下纖維素降解菌株的產(chǎn)酶特征

考察溫度(5,10,15,20,25,30 ℃),發(fā)酵時(shí)間(1,3,5,7,9,11 d)和初始pH值(2,3,4,5,6,7)3個(gè)因素對目標(biāo)菌株產(chǎn)纖維素降解酶能力的影響.

1.6 纖維素降解菌株的鑒定

采用OMEGA細(xì)菌基因組提取試劑盒提取菌株總DNA,以細(xì)菌通用引物27F/1492R進(jìn)行16S rRNA基因擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物送往上海生物工程有限公司測序.測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對分析,選擇同源性高的序列,利用MEGA 7.0軟件進(jìn)行序列比對、剪輯,進(jìn)而基于Neighbor Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.

2 結(jié)果分析

2.1 高效纖維素降解菌的篩選

連續(xù)5次富集培養(yǎng)后,通過平板分離純化獲得8株具有纖維素分解能力的菌株(X1～X8),其在CMC-剛果紅培養(yǎng)基上水解圈直徑(D)與菌落直徑(d)如表1所示.8株纖維素降解菌的D/d范圍為2.01～6.22.

表1 分離菌株的水解圈及濾紙條崩解情況Table 1 Hydrolytic Zone and Disintegration of Filter Paper Strips of Bacterial Isolates

濾紙條崩解試驗(yàn)結(jié)果表明,菌株X1,X2在15 d內(nèi)崩解效果最好,其余菌株崩解效果不佳,因此將菌株X1和X2確定為本研究的高效纖維素降解菌.

2.2 高效纖維素降解菌的產(chǎn)酶特征

本研究分別測定了菌株X1和X2在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下分泌的FPase,CMCase,EGLase和BGLase在不同溫度(T)、發(fā)酵時(shí)間(t)和初始pH值范圍內(nèi)的產(chǎn)酶特征(圖1),以此來考察菌株在降解纖維素過程中的酶穩(wěn)定性.

培養(yǎng)溫度對兩株纖維素降解菌產(chǎn)酶活性的影響見圖1.兩株高效纖維素降解菌X1和X2在實(shí)驗(yàn)室條件下產(chǎn)生4種纖維素酶的相對活性隨著溫度、培養(yǎng)時(shí)間和初始pH值的增加整體呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。隨著培養(yǎng)溫度升高,X1和X2菌株產(chǎn)生的FPase,CMCase,EGLase和BGLase的相對活性均在9 ℃左右達(dá)到最大,之后開始急劇降低.CMCase和EGLase的相對活性在20 ℃后趨于緩慢下降過程,說明這兩株降解菌在低溫條件下具有較高的酶活.

發(fā)酵時(shí)間對兩株纖維素降解菌產(chǎn)酶活性的影響見圖1.在1 ～ 6 d期間,兩菌株的4種纖維素酶的酶活快速上升,在5.5 d左右出現(xiàn)最高值,之后酶活開始呈緩慢下降趨勢.4種纖維素酶中,CMCase和BGLase的相對活性下降幅度高于其他兩種酶.

初始pH值對菌株X1和X2產(chǎn)酶活性的影響見圖1.初始pH值為3.9時(shí),FPase的相對活性最高,初始pH值為3.2時(shí),其余3種纖維素酶活性出現(xiàn)最高值.

在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下,對菌株X1和X2進(jìn)行了濾紙條崩解測試(圖2).測試條件為上述產(chǎn)酶特征試驗(yàn)的最適溫度、最適培養(yǎng)時(shí)間和最適初始pH值.結(jié)果發(fā)現(xiàn),兩株纖維素降解菌在初始pH值為4的發(fā)酵培養(yǎng)基中,9 ℃恒溫條件下培養(yǎng)6 d后實(shí)現(xiàn)了濾紙條的完全降解,而對照組X0僅出現(xiàn)紙片泡脹,未出現(xiàn)降解效果.

2.3 降解菌的分子鑒定

纖維素降解菌X1和X2的系統(tǒng)發(fā)育分析樹如圖3所示.基于16S rRNA基因序列的同源性比對和系統(tǒng)發(fā)育分析,發(fā)現(xiàn)X1,X2與Cronobacter屬的C.sakazakii菌和C.muytjensii菌聚類在一起,相似性大于96%.本研究中兩株降解菌之間有遺傳距離上的差異,可能代表了Cronobacter屬的兩個(gè)菌株,命名為Cronobactersp. X1和Cronobactersp. X2.

圖3 基于16S rRNA序列菌株X1和X2的系統(tǒng)發(fā)育分析樹Fig. 3 Phylogeny Tree of 16S rRNA Sequences for Identification of Strain X1 and X2

3 討論

高原地區(qū)低溫脅迫時(shí)間較長,牦牛是長期生長在青藏高原的大型食草動(dòng)物,從其瘤胃、腸道和糞便中尋找低溫纖維素降解菌是一個(gè)有前途的方向.本研究的牦牛糞便樣品采集于西藏納木錯(cuò)湖邊的草場,在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下,本研究分離篩選獲得兩株Cronobacter屬菌株,兩菌株均具有良好的纖維素降解性能,兩株降解菌在初始pH值為4的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中,于9 ℃條件下發(fā)酵6 d即可實(shí)現(xiàn)濾紙條的完全降解.本研究結(jié)果顯示,分離得到的兩株菌株在低溫產(chǎn)纖維素降解酶方面有一定的應(yīng)用前景.

目前大部分研究分離得到的高效纖維素降解菌以真菌為主[10].本研究從牦牛糞便中篩選得到的兩株菌株為細(xì)菌,其在液態(tài)環(huán)境中能通過適宜的參數(shù)調(diào)控發(fā)酵過程中纖維素酶的產(chǎn)生,這有利于提高纖維素降解菌的工業(yè)化應(yīng)用,以及工業(yè)化應(yīng)用中發(fā)酵環(huán)境的設(shè)備標(biāo)準(zhǔn)化、過程自動(dòng)化和產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性.