基于生物信息學(xué)分析艾葉治療慢性蕁麻疹的分子機(jī)制

種凱艷 蘭祝飚

[摘要]?目的?運(yùn)用基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene?Expression?Omnibus，GEO）基因芯片挖掘、生物信息學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)，分析艾葉治療慢性蕁麻疹（chronic?urticaria，CU）的分子機(jī)制。方法?從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載CU的基因芯片數(shù)據(jù)集，利用R軟件篩選出差異表達(dá)靶點(diǎn)，從中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（Traditional?Chinese?Medicine?Systems?Pharmacology?Database，TCMSP）、藥物靶標(biāo)識(shí)別平臺(tái)（Pharm?Mapper）等數(shù)據(jù)庫(kù)獲取艾葉的化學(xué)成分、藥物靶點(diǎn)，運(yùn)用GENEMANIA平臺(tái)及R軟件，對(duì)藥物–疾病交集靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein?interaction?networks，PPI）分析、京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto?Encyclopedia?of?Genes?and?Genome，KEGG）富集分析，使用AutoDock?Vina等軟件進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。結(jié)果?得到CU靶點(diǎn)320個(gè)、藥物靶點(diǎn)382個(gè)，篩選出藥物–疾病交集靶點(diǎn)20個(gè)；PPI拓?fù)浞治龅贸龅暮诵陌悬c(diǎn)有ADAMTS4、FABP7、SRM、PDE5A、SOD2等；相關(guān)的化學(xué)成分有（2R）-5，7-二羥基-2-（4-羥苯基）、亞油酸乙酯、豆甾醇、槲皮素等；富集出涉及脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、長(zhǎng)壽調(diào)節(jié)信號(hào)通路、過(guò)氧化物酶體增殖活化因子受體（peroxisome?proliferator-activated?receptor，PPAR）信號(hào)通路、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-17信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路等；9種化學(xué)成分與5個(gè)核心靶點(diǎn)間的分子對(duì)接顯示，有40組對(duì)接具有結(jié)合活性（結(jié)合能<–4.25kcal/mol）。結(jié)論?艾葉對(duì)CU具有多靶點(diǎn)、多成分、多途徑的作用機(jī)制，通過(guò)文獻(xiàn)檢索及分子對(duì)接驗(yàn)證本次分析結(jié)果具有可信性，可為后期的實(shí)驗(yàn)研究提供參考依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]?生物信息學(xué)；分子對(duì)接；慢性蕁麻疹；作用機(jī)制

[中圖分類號(hào)]?R285??????[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2023.15.006

Analyze?the?molecular?mechanism?of?Artemisia?argyi?in?the?treatment?of?chronic?urticaria?based?on?bioinformatics

CHONG?Kaiyan，?LAN?Zhubiao

Department?of?Dermatology，?Lishui?Hospital?of?Traditional?Chinese?Medicine，?Lishui?323000，?Zhejiang，?China

[Abstract]?Objective?To?analyze?the?molecular?mechanism?of?Artemisia?argyi?in?the?treatment?of?chronic?urticaria?（CU）?by?Gene?Expression?Omnibus?（GEO）?gene?chip?mining，?bioinformatics?and?molecular?docking?techniques.?Methods?The?gene?chip?dataset?of?CU?was?downloaded?from?GEO?database，?the?differentially?expressed?targets?were?selected?using?R?software，?and?the?chemical?composition?and?drug?targets?of?Artemisia?argyi?were?obtained?from?Traditional?Chinese?Medicine?Systems?Pharmacology?Database?（TCMSP），?PharmMapper?and?other?databases.?Used?GENEMANIA?platform?and?R?software，?protein-?protein?interaction?networks?（PPI）?topology?analysis?and?Kyoto?Encyclopedia?of?Genes?and?Genome?（KEGG）?enrichment?analysis?were?performed?for?drug-disease?intersection?targets，?and?molecular?docking?validation?was?performed?using?AutoDock?Vina?and?other?software.?Results?320?CU?targets?and?382?drug?targets?were?obtained，?and?20?drug-disease?intersection?targets?were?selected;?The?protein-protein?interaction?networks?core?targets?obtained?by?PPI?topology?analysis?were?ADAMTS4，?FABP7，?SRM，?PDE5A，?SOD2，?etc.;?The?related?chemical?components?were?（2R）?-5，?7-dihydroxy-2-?（4-hydroxyphenyl），?ethyl?linoleate，?stigmasterol，?quercetin，?etc.;?Enriched?involving?lipids?and?atherosclerosis，?longevity?regulatory?signaling?pathway，?peroxisome?proliferator-activated?receptor?（PPAR）?signaling?pathway，?interleukin-17（IL-17）?signaling?pathway，?chemokine?signaling?pathway，?etc.;?Molecular?docking?between?9?chemical?components?and?5?core?targets?showed?that?40?groups?of?docking?had?binding?activity?（binding?energy<–4.25kcal/mol）.?Conclusion?Artemisia?argyi?has?a?mechanism?of?action?of?multiple?targets，?multiple?components，?and?multiple?pathways?on?CU，?and?the?credibility?of?the?results?of?this?analysis?is?verified?by?literature?search?and?molecular?docking，?which?can?provide?a?reference?basis?for?later?experimental?studies.

[Key?words]?Bioinformatics;?Molecular?docking;?Chronic?urticaria;?Mechanism?of?action

慢性蕁麻疹（chronic?urticaria，CU）是一種常見(jiàn)的皮膚過(guò)敏性疾病，臨床特征為反復(fù)發(fā)作的風(fēng)團(tuán)伴紅斑瘙癢[1]；其反復(fù)發(fā)作的劇烈瘙癢嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，有時(shí)還可出現(xiàn)全身癥狀，包括關(guān)節(jié)痛、頭痛、疲勞、潮紅和胃腸道不適等[2]。CU的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，約3/4的患者找不到病因，目前認(rèn)為可能是肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞等被活化后所產(chǎn)生的一系列反應(yīng)[3]。CU治療上以緩解癥狀為主，國(guó)內(nèi)外指南均推薦使用二代H1抗組胺藥物作為一線藥物，但部分患者對(duì)該類藥物反應(yīng)差且病情易反復(fù)[4]。越來(lái)越多的研究表明，中醫(yī)藥治療CU具有一定的優(yōu)勢(shì)，中西醫(yī)協(xié)同治療可增強(qiáng)臨床療效、減少不良反應(yīng)、降低復(fù)發(fā)率[5-7]。艾葉為我國(guó)傳統(tǒng)中藥材，富含多種生物活性成分，包括揮發(fā)油、甾萜類、有機(jī)酸、黃酮類和多糖等?，F(xiàn)代藥理研究表明，艾葉具有抗菌、抗炎、抗過(guò)敏、止血、鎮(zhèn)痛等藥理作用[8]。本研究運(yùn)用生物信息學(xué)、分子對(duì)接等技術(shù)，分析艾葉治療CU的核心靶點(diǎn)、化學(xué)成分及作用通路。

1??資料與方法

1.1??挖掘GEO芯片獲取CU靶點(diǎn)

從基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene?Expression?Omnibus，GEO）獲取GSE57178、GSE72540基因芯片數(shù)據(jù)集，選取其中12例健康人的皮膚組織樣本和16例CU患者的病變皮膚組織樣本，下載2個(gè)芯片的表達(dá)數(shù)據(jù)及GPL6244、GPL16699注釋文件。運(yùn)用R軟件“sva”程序包消除2個(gè)數(shù)據(jù)集之間的批次效應(yīng)，然后使用“l(fā)imma”程序包進(jìn)行差異分析，差異表達(dá)基因的篩選條件為|logFC|≥1、FDR<0.05。

1.2??收集艾葉的化學(xué)成分及作用靶點(diǎn)

檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（Traditional?Chinese?Medicine?Systems?Pharmacology?Database，TCMSP）獲取艾葉的化學(xué)成分，并根據(jù)口服生物利用度（oral?bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18進(jìn)行篩選。通過(guò)PharmMapper數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)各化學(xué)成分的潛在作用靶點(diǎn)，運(yùn)用UniProt平臺(tái)匹配各靶點(diǎn)的GeneSymbol。

1.3??篩選共同靶點(diǎn)并構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)核心網(wǎng)絡(luò)

運(yùn)用R軟件的“venn”程序包繪制藥物–疾病靶點(diǎn)韋恩圖，并映射篩選出藥物–疾病交集靶點(diǎn)。將交集靶點(diǎn)提交至GENEMANIA平臺(tái)獲取蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein?interaction?networks，PPI），通過(guò)Score值篩選出艾葉治療CU的核心靶點(diǎn)。

1.4??生物信息富集分析

將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入R軟件，應(yīng)用“ClusterProfiler”等程序包進(jìn)行基因本體學(xué)（gene?ontology，GO）、京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto?Encyclopedia?of?Genes?and?Genome，KEGG）富集分析，包括生物學(xué)進(jìn)程（biological?process，BP）、細(xì)胞組分和分子功能（molecular?funtion，MF），對(duì)主要條目進(jìn)行可視化。

1.5??分子對(duì)接驗(yàn)證

選取核心靶點(diǎn)分別與化學(xué)成分進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，共45組。將化學(xué)成分作為小分子配體、核心靶點(diǎn)作為蛋白受體，從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)下載化學(xué)成分的MOL2文件，從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)（Protein?Date?Bank，PDB）下載核心靶點(diǎn)的PDB文件，使用PyMOL軟件刪除水分子及配體，通過(guò)AutoDock?Vina軟件進(jìn)行分子對(duì)接。

2??結(jié)果

2.1??收集藥物靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索、篩選，最終收集艾葉的9個(gè)化學(xué)成分并上傳至PharmMapper平臺(tái)獲得382個(gè)藥物靶點(diǎn)。對(duì)GSE57178、GSE72540兩個(gè)數(shù)據(jù)集進(jìn)行差異分析，共鑒定出320個(gè)差異表達(dá)基因，其中在CU樣本中上調(diào)的基因256個(gè)、下調(diào)的基因64個(gè)。選取差異最顯著的40個(gè)基因繪制熱圖，構(gòu)建藥物–疾病靶點(diǎn)韋恩圖，共篩選出20個(gè)交集靶點(diǎn)。

2.2??構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)

將20個(gè)交集靶點(diǎn)上傳至GENEMANIA平臺(tái)構(gòu)建PPI，該P(yáng)PI包括20個(gè)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，下載該網(wǎng)絡(luò)的連接數(shù)據(jù)，通過(guò)Score值篩選出前5個(gè)靶點(diǎn)，分別為ADAMTS4、FABP7、SRM、PDE5A、SOD2，提示這些靶點(diǎn)可能在艾葉治療CU中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

2.3??交集靶點(diǎn)富集分析

對(duì)20個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG富集分析，結(jié)果顯示，富集出脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、長(zhǎng)壽調(diào)節(jié)信號(hào)通路、過(guò)氧化物酶體增殖活化因子受體（peroxisome?proliferator-activated?receptor，PPAR）信號(hào)通路、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-17信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路等，對(duì)主要條目進(jìn)行繪圖，見(jiàn)圖1。

2.4??分子對(duì)接驗(yàn)證

對(duì)45組主要化學(xué)成分–核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，一般認(rèn)為結(jié)合能<–4.25kcal/mol則配體與靶點(diǎn)受體之間有結(jié)合活性，結(jié)合能<–5.0kcal/mol表明匹配活性較佳，結(jié)合能<–7.0kcal/mol提示具有強(qiáng)烈的對(duì)接活性[9]。分子對(duì)接結(jié)果見(jiàn)表1，45組分子對(duì)接平均結(jié)合能為–6.56kcal/mol，最低結(jié)合能為–3.1kcal/mol?[油酸乙酯（NF）-FABP7]，最高結(jié)合能為–9.7kcal/mol（槲皮素-ADAMTS4），45組中僅有5組無(wú)對(duì)接活性，其余均存在結(jié)合性，表明篩選出的靶點(diǎn)與化學(xué)成分間具有較好的匹配度。

3??討論

CU是常見(jiàn)的皮膚病之一，終身患病率較高。CU作為一種慢性疾病因反復(fù)發(fā)作導(dǎo)致治療較困難[10]。中醫(yī)藥治療CU療效確切，在常規(guī)使用脫敏藥的同時(shí)，配合中醫(yī)藥的特色療法，患者復(fù)發(fā)率低，病程縮短，作用迅速，成效顯著[11]。艾葉化學(xué)成分復(fù)雜，揮發(fā)油類是其主要活性成分。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，艾葉具有抗過(guò)敏、抗炎、抗氧化等多種作用。研究發(fā)現(xiàn)艾葉可抑制部分炎癥介質(zhì)，如一氧化氮、前列腺素、活性氧、IL-6等，且抑制效果與劑量有關(guān)[12]。在抗過(guò)敏方面，艾葉能抑制由T細(xì)胞介導(dǎo)的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，同時(shí)艾葉能促進(jìn)小鼠脾臟細(xì)胞增殖，提高巨噬細(xì)胞吞噬功能，增加B細(xì)胞產(chǎn)生抗體能力及增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞的增殖能力[13]。艾葉在抗氧化方面對(duì)羥基自由基、超氧陰離子自由基、黃嘌呤氧化酶等具有較好的抑制或清除效果[14]。侯其剛等[15]使用包含艾葉的中草藥治療蕁麻疹患者，其療效明顯優(yōu)于單用西醫(yī)治療，表明艾葉對(duì)CU具有一定的治療效果，故本研究運(yùn)用生物信息學(xué)等技術(shù)初步探索艾葉治療CU的作用機(jī)制。

研究發(fā)現(xiàn)艾葉可通過(guò)20個(gè)靶點(diǎn)干預(yù)CU，包括ADAMTS4、FABP7、SRM、PDE5A、SOD2、MMP1、MMP12、HCK、CA2、PIM1、PNP、HSPA8、DPP4、PLA2G2A、SELE、UAP1、RND3、S100A9、CD1A、FAP，部分靶點(diǎn)在CU病程或炎癥中起調(diào)節(jié)作用。如選擇蛋白E（selectin?E，SELE）是細(xì)胞黏附分子家族的相關(guān)基因，其編碼的蛋白E-選擇素是一種促炎因子，E-選擇素通過(guò)炎癥因子IL-1、脂多糖或腫瘤壞死因子-α（turmor?necrosis?factor-α，TNF-α）等介導(dǎo)中性粒細(xì)胞黏附血管上皮細(xì)胞，從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)[16]。SELE的表達(dá)水平與蕁麻疹具有相關(guān)性，上調(diào)SELE可潛在促進(jìn)肥大細(xì)胞釋放大量TNF-α、同源限制因子、IL-6和組胺，參與蕁麻疹的疾病發(fā)生和進(jìn)程[17]。當(dāng)SELE被沉默時(shí)，可通過(guò)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞黏附能力抑制免疫接觸性蕁麻疹的發(fā)展[18]。

KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，艾葉對(duì)CU具有多方面的作用機(jī)制，涉及脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、長(zhǎng)壽調(diào)節(jié)信號(hào)通路、PPAR信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路等。PPAR是PPAR信號(hào)通路中一類依賴轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的配體，PPAR-γ作為PPAR主要亞型之一，與多種炎癥細(xì)胞的活性和表達(dá)關(guān)系密切，具有改變巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)、增加巨噬細(xì)胞吞噬功能等作用，可促進(jìn)免疫反應(yīng)的發(fā)生，同時(shí)可通過(guò)不同炎癥途徑的干擾控制所涉及的基因表達(dá)，影響炎癥因子的產(chǎn)生和細(xì)胞募集，發(fā)揮抗炎作用[19-20]。研究發(fā)現(xiàn)，PPAR-γ可抑制多種皮膚病中的炎癥反應(yīng)，如PPAR-γ在特應(yīng)性皮炎中起負(fù)性調(diào)節(jié)作用，抑制T細(xì)胞增殖，減少促炎因子的產(chǎn)生，參與Th1、Th2細(xì)胞分化，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，而Th1、Th2的功能失衡與CU的發(fā)病關(guān)系密切，因此推測(cè)PPAR信號(hào)通路可能在CU復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮調(diào)控作用[21-22]。研究表明，細(xì)胞免疫失衡也在CU發(fā)病中發(fā)揮重要作用，Th17細(xì)胞可增強(qiáng)抗原對(duì)Th2細(xì)胞的誘導(dǎo)作用，進(jìn)而促進(jìn)Th2細(xì)胞介導(dǎo)的嗜酸性粒細(xì)胞的炎癥反應(yīng)而參與過(guò)敏性疾病的發(fā)生。IL-17作為T(mén)h17細(xì)胞的核心因子，與部分炎癥和自身免疫疾病密切相關(guān)，可通過(guò)增強(qiáng)Th2反應(yīng)在CU的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮一定作用[23]。秦凱煒等[24]發(fā)現(xiàn)IL-17在CU患者中的表達(dá)水平明顯上調(diào)，且與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。研究證實(shí)IL-17是重度CU的潛在參與者和治療靶點(diǎn)[25]。趨化因子異常分泌、表達(dá)及分布可引起T、B淋巴細(xì)胞的異?；罨?，產(chǎn)生多種自身抗體，可能導(dǎo)致CU的發(fā)病。研究表明，趨化因子可參與包括過(guò)敏性哮喘等超敏反應(yīng)，在超敏反應(yīng)的各個(gè)環(huán)節(jié)均發(fā)揮重要作用，通過(guò)趨化和聚集嗜酸性粒細(xì)胞，調(diào)節(jié)以Th2細(xì)胞為主的免疫應(yīng)答[26-27]。

篩選發(fā)現(xiàn)，艾葉中具有9種活性成分能發(fā)揮抗炎、免疫調(diào)節(jié)等多成分協(xié)同作用，如β-谷甾醇、豆甾醇、槲皮素[28-30]等。通過(guò)分子對(duì)接預(yù)測(cè)化學(xué)成分與核心靶點(diǎn)之間的結(jié)合力，也能從側(cè)面證實(shí)艾葉治療CU的可靠性，45組分子對(duì)接中有40組具有結(jié)合活性，有38組結(jié)合力較佳，有19組具有強(qiáng)烈的結(jié)合活性，其中（2R）-5，7-二羥基-2-（4-羥苯基）、槲皮素與核心靶點(diǎn)間的對(duì)接得分最高，具有重要的研究參考價(jià)值。

綜上所述，艾葉對(duì)CU具有多靶點(diǎn)、多成分、多途徑的作用機(jī)制，通過(guò)文獻(xiàn)檢索及分子對(duì)接驗(yàn)證本次分析結(jié)果具有可信性，希望為后期進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究提供參考依據(jù)。

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