付濱 余學英 劉星 邱德亮 肖天科 張科

肺癌主要受吸煙、遺傳、大氣污染和電離輻射等因素的影響,在早期臨床的表現(xiàn)癥狀不明顯,常因為患者不重視或誤診等,導致出現(xiàn)較高的死亡率[1,2]。雖然近年來肺癌在治療上取得了較大的進展,但是肺癌患者的預后效果不甚理想。麻醉藥在腫瘤治療方面被廣泛應用,麻醉藥物咪達唑侖、阿片類藥物和利多卡因等在一定程度能夠抑制肺癌細胞的生長、復發(fā)和轉(zhuǎn)移[3]。普魯卡因是一種脂溶性的局部麻醉藥物,具有毒性低、價格便宜等優(yōu)點,在抗腫瘤方面具有一定的作用[4],如普魯卡因調(diào)控SOX9的表達抑制乳腺癌細胞的增殖和誘導細胞的凋亡[5]。普魯卡因還可以抑制非小細胞肺癌的增殖,降低PCNA蛋白、EGFR mRNA的表達[6],但是對凋亡的研究尚不明確。蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5(PRMT5)在多種癌癥中高表達,如卵巢癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌和肺癌等,與腫瘤的預后密切相關(guān)[7]。Li等[8]研究結(jié)果顯示,PRMT5在肺癌組織和細胞中表達上調(diào),敲低PRMT5可以明顯抑制肺癌細胞的增殖和誘導其細胞凋亡;白藜蘆醇通過調(diào)控PRMT5/Akt/Gsk3β信號通路促進肺癌細胞的發(fā)展。本研究通過體外培養(yǎng)肺癌細胞A549,探討普魯卡因是否可以調(diào)控PRMT5的表達影響肺癌細胞的增殖和凋亡的影響,為肺癌的研究提供合理的數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要試劑 肺癌細胞A549購自中國科學院上海細胞庫;胎牛血清、EMDM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司;鹽酸普魯卡因注射液購自常州蘭陵制藥公司,規(guī)格：10 ml/0.1 g;si-NC、si-PRMT5、pcDNA和PRMT5購自上海生工公司;MTT試劑盒、凋亡試劑盒購自北京索萊寶公司;PCNA抗體、p21抗體、Bcl-2抗體、Bax抗體、PRMT5抗體和GAPDH抗體購自美國Cell Signaling公司;LipofectamineTM2000試劑盒購自美國購自Sigma公司;Trizol試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、AceQ qPCR SYBR?Green Mix試劑盒購自日本TaKaRa公司;引物購自上海吉瑪公司。

1.2 細胞培養(yǎng)與分組 將肺癌細胞A549復蘇后在含有10%胎牛血清的EMDM培養(yǎng)基內(nèi),并設置培養(yǎng)箱溫度為37℃、5% CO2,觀察肺癌細胞A549的生長狀態(tài),加入胰酶進行消化傳代培養(yǎng)。收集生長狀態(tài)良好的肺癌細胞A549接種在96孔板內(nèi),采用濃度為0、1.0、2.5、5.0 mmol/L的普魯卡因處理肺癌細胞A549,記為0 mmol/L組、1.0 mmol/L組、2.5 mmol/L組、5.0 mmol/L組,其中0 mmol/L、5.0 mmol/L的普魯卡因記為對照組和普魯卡因組。將si-NC和si-PRMT5轉(zhuǎn)染至未處理的肺癌細胞A549內(nèi),記為si-NC組和si-PRMT5組;pcDNA和PRMT5轉(zhuǎn)染肺癌細胞A549后經(jīng)過5.0 mmol/L的普魯卡因處理,記為普魯卡因+pcDNA組和普魯卡因+PRMT5組。

1.3 MTT檢測細胞的活力 取出各組的肺癌細胞A549,PBS沖洗3遍,1 000 r min離心5 min,除去上清液,制成1×105個/ml濃度的細胞懸液接種在96孔板內(nèi)。在培養(yǎng)箱中固定培養(yǎng)48、72 h,每孔加入20 μl的MTT溶液,繼續(xù)孵育4 h,除去孔內(nèi)液體加入150 μl DMSO溶液。酶標儀490 nm檢測細胞的吸光度值。

1.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 取出各組的肺癌細胞A549,室溫下1 000 r/min離心5 min,采用預冷的磷酸鹽緩沖液重懸細胞,1 000 r/min離心5 min后加入300 μl磷酸鹽緩沖液,與5 μl的Annexin V-FITC和PI溶液,避光反應15 min。流式細胞儀檢測細胞的凋亡。

1.5 Western blot檢測PCNA、p21、Bcl-2、Bax和PRMT5蛋白表達 取出各組的肺癌細胞A549,預冷后加入蛋白裂解液,離心后去細胞上清液,按照BCA法定量蛋白濃度,將蛋白樣品加入到10% SDS-PAGE凝膠處理,轉(zhuǎn)膜,加入5%脫脂奶粉封閉培養(yǎng),加入PCNA、p21、Bcl-2、Bax和PRMT5一抗,稀釋比例為1∶1 000,過夜孵育,加入二抗(1∶5 000),室溫下孵育1 h。在PVDF膜上加入發(fā)光液和增強液,采用Image J分析蛋白條帶的灰度值,選擇β-actin為內(nèi)參計算相對表達量。

1.6 qRT-PCR檢測PRMT5 mRNA的表達 取出各組的肺癌細胞A549按照Trizol法提取細胞的總RNA,在紫外分光光度計260 nm和280 nm處檢測吸光度比值。取2 μg的RNA加入在反應體系中,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,將合成的模板按照AceQ qPCR SYBR?Green Mix試劑盒進行PCR擴增。GAPDH作為內(nèi)參,通過2-ΔΔCt法計算PRMT5 mRNA的表達。PRMT5正向引物為：5’-CCTGTGGAGGTGAACACAGT-3’,反向引物為：5’-AGAGGATGGGAAACCATGAG-3’;GAPDH正向引物為：5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3’,反向引物為：5’-TGCCATGGGTGGAATCATATTGG-3’。選擇GAPOH為內(nèi)參計算相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 普魯卡因?qū)Ψ伟┘毎鲋车挠绊?隨著普魯卡因濃度的增加,肺癌細胞的OD值、PCNA蛋白表達逐漸降低(P<0.05),p21蛋白表達逐漸升高(P<0.05)。見表1,圖1。

圖1 普魯卡因?qū)Ψ伟┘毎蠵CNA、p21蛋白的影響

表1 普魯卡因?qū)Ψ伟┘毎鲋车挠绊?/p>

2.2 普魯卡因?qū)Ψ伟┘毎蛲龅挠绊?隨著普魯卡因濃度的增加,肺癌細胞的凋亡率、Bax蛋白表達逐漸升高(P<0.05),Bcl-2蛋白表達逐漸降低(P<0.05)。見圖2,表2。

圖2 普魯卡因?qū)Ψ伟┘毎蛲龅挠绊?A Bax、Bcl-2蛋白表達;B 細胞凋亡率

表2 普魯卡因?qū)Ψ伟┘毎蛲龅挠绊?/p>

2.3 抑制PRMT5對肺癌細胞增殖的影響 與si-NC組比較,si-PRMT5組的PRMT5 mRNA和蛋白表達、OD值、PCNA蛋白表達顯著降低(P<0.05),p21蛋白表達顯著增加(P<0.05)。見表3,圖3。

圖3 抑制PRMT5對肺癌細胞中PRMT5、PCNA、p21蛋白的影響

表3 抑制PRMT5對肺癌細胞增殖的影響

2.4 普魯卡因處理肺癌細胞后PRMT5的表達 隨著普魯卡因濃度的增加,肺癌細胞中PRMT5 mRNA和蛋白表達逐漸降低(P<0.05)。見表4,圖4。

圖4 普魯卡因處理肺癌細胞后PRMT5蛋白的表達

表4 普魯卡因處理肺癌細胞后PRMT5的表達

2.5 抑制PRMT5對肺癌細胞增凋亡的影響 與si-NC組比較,si-PRMT5組細胞凋亡率、Bax和Bcl-2蛋白表達差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖5,表5。

表5 抑制PRMT5對肺癌細胞增凋亡的影響

2.6 普魯卡因通過調(diào)控PRMT5對肺癌細胞的增殖和凋亡的影響 與對照組比較,普魯卡因組的PRMT5 mRNA及蛋白表達、OD值、PCNA蛋白表達、Bcl-2蛋白表達明顯降低(P<0.05),細胞凋亡率、p21蛋白表達、Bax蛋白表達明顯增加(P<0.05);與普魯卡因+pcDNA組比較,普魯卡因+PRMT5組的PRMT5 mRNA及蛋白表達、OD值、PCNA蛋白表達、Bcl-2蛋白表達明顯增加(P<0.05),細胞凋亡率、p21蛋白表達、Bax蛋白表達明顯降低(P<0.05)。見圖6,表6。

圖6 普魯卡因通過調(diào)控PRMT5對肺癌細胞的增殖和凋亡的影響;A PRMT5、PCNA、p21、Bax、Bcl-2蛋白表達;B 細胞凋亡率

表6 普魯卡因通過調(diào)控PRMT5對肺癌細胞的增殖和凋亡的影響

3 討論

普魯卡因是一種具有毒副作用小、較為安全的局部麻醉藥物,能夠激活抑癌或促癌因子,發(fā)揮抗腫瘤的藥理活性,在肝癌、胃癌和乳腺癌等癌癥治療中取得了效果,可以抑制腫瘤細胞的生長,為腫瘤治療提供新的藥物研究方向[9,10]。金翠紅等[11]研究結(jié)果顯示,普魯卡因能夠通過調(diào)控TRAIL抑制宮頸癌細胞的增殖和誘導細胞的凋亡。曾凱輝等[12]研究結(jié)果顯示,普魯卡因能夠抑制CXCR7/AKT/STAT3通路進而抑制膀胱癌細胞的增殖、遷移和侵襲。方潔等[13]研究結(jié)果顯示,普魯卡因能夠調(diào)控FSCN1抑制膀胱癌細胞的增殖和阻滯細胞周期,并誘導細胞的凋亡。Li等[14]研究結(jié)果顯示,普魯卡因能夠抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖、遷移,促進細胞的凋亡,阻滯細胞周期,普魯卡因通過抑制RhoA/ERK/MAPK/FAK通路發(fā)揮在結(jié)直腸癌細胞中的作用。有研究發(fā)現(xiàn),普魯卡因能夠上調(diào)miR-133b的表達抑制骨肉瘤細胞的增殖、遷移,促進細胞的凋亡[15]。本研究結(jié)果顯示,普魯卡因可以抑制肺癌細胞的增殖、增加肺癌細胞的凋亡,上調(diào)p21、Bax蛋白表達,下調(diào)PCNA、Bcl-2蛋白表達,說明普魯卡因能夠抑制肺癌細胞的增殖和誘導細胞的凋亡。

PRMT5是PRMT家族的主要成員之一,可以參與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、細胞增殖、分化、凋亡等過程[16]。PRMT5是一種表觀的遺傳酶,在蛋白白質(zhì)甲基化中具有重要的作用,可以多種癌癥的促癌基因,參與腫瘤的發(fā)發(fā)展[17],如PRMT5在肝癌細胞中表達上調(diào),抑制PRMT5能夠抑制肝癌細胞的增殖和促進細胞的凋亡[18]。燕飛虎等[19]研究結(jié)果顯示,PRMT5在胃癌組織中表達上調(diào),高表達PRMT5與胃癌細胞的腫瘤分級、分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),抑制PRMT5能夠明顯降低胃癌細胞的增殖、遷移能力,并促進其細胞的凋亡。Zhang等[20]研究結(jié)果顯示,PRMT5在肺癌組織中表達上調(diào),敲低PRMT5能夠下調(diào)cyclin E1和cyclin D1蛋白表達抑制肝癌細胞的增殖。侯從嶺等[21]研究結(jié)果顯示,槐角黃銅通過調(diào)控miR-188-5p/PRMT5軸促進肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。本研究結(jié)果顯示,采用不同濃度的普魯卡因處理肺癌細胞A549后,PRMT5 mRNA和蛋白表達下調(diào),利用siRNA干擾技術(shù),發(fā)現(xiàn)抑制PRMT5可以降低肺癌細胞的增殖能力,促進肺癌細胞的凋亡,上調(diào)p21、Bax蛋白表達,下調(diào)PCNA、Bcl-2蛋白表達,說明PRMT5在肺癌細胞中起到促癌的作用。進一步實驗結(jié)果顯示,過表達PRMT5可以部分回復普魯卡因?qū)Ψ伟┘毎脑鲋澈偷蛲龅挠绊?說明普魯卡因通過調(diào)控PRMT5發(fā)揮在肺癌細胞中作用。

綜上所述,普魯卡因通過下調(diào)PRMT5表達抑制肺癌細胞的增殖,促進細胞的凋亡,為肺癌細胞的治療提供新的思路。