行星保護任務(wù)中干熱滅菌生物指示劑應(yīng)用及篩選分析

黨 磊，鄒樂洋，袁俊霞，宋 研，楊金祿，徐侃彥，印 紅

（1.航天神舟生物科技集團有限公司；2.北京空間飛行器總體設(shè)計部：北京 100086）

0 引言

1984 年，國際空間研究委員會（Committee for Space Research, COSPAR）根據(jù)深空探測任務(wù)的目標(biāo)和類型不同，對行星保護任務(wù)進行分類，并對一些探測任務(wù)提出具體的微生物控制要求。為了使深空探測航天器滿足對各類任務(wù)的生物負載要求，需在航天器研制各階段進行微生物控制。包括我國在內(nèi)的多個國家對多種航天器的AIT（裝配、集成和測試）環(huán)境微生物狀況的分析已證明，AIT 環(huán)境中的優(yōu)勢微生物以產(chǎn)芽孢菌為主，占細菌總量的50%～60%[1]；同時，芽孢作為產(chǎn)芽孢菌在惡劣環(huán)境中的特殊存在形式——休眠體，對高溫、干燥、輻射等環(huán)境具有很強的抵抗能力。因此，芽孢是行星保護任務(wù)中須重點關(guān)注的微生物形態(tài)[2]，是航天器微生物滅菌的主要對象。

目前航天器常用的滅菌技術(shù)包括干熱滅菌（dry heat microbial reduction, DHMR）、氣相過氧化氫滅菌（vaporized hydrogen peroxide, VHP）、輻射滅菌和紅外線滅菌等[3-6]。其中干熱滅菌技術(shù)因其滅菌效果好、材料兼容性廣、滅菌后無殘留等優(yōu)點，成為NASA、ESA 在行星保護任務(wù)中批準(zhǔn)使用的滅菌技術(shù)。NASA、ESA 分別在文件NPR 8020.12D[7]和ESCC-Q-ST-70-57C[8]中對應(yīng)用于行星保護任務(wù)的干熱滅菌技術(shù)流程提出了規(guī)范性要求。

耐熱芽孢桿菌是干熱滅菌技術(shù)常用的生物指示劑，用于對滅菌程序的滅菌效率進行監(jiān)測。為滿足行星保護任務(wù)的微生物控制要求，NASA 在干熱滅菌生物指示劑方面做了大量的基礎(chǔ)研究。本文綜述NASA 行星保護任務(wù)中干熱滅菌的生物指示劑研究現(xiàn)狀，介紹NASA 根據(jù)生物指示劑選取的變化對干熱滅菌技術(shù)流程規(guī)范的修訂，并結(jié)合我國AIT環(huán)境的微生物狀況分析，對適用于我國行星保護任務(wù)的干熱滅菌生物指示劑篩選流程提出建議，為在航天器AIT 環(huán)境下實施干熱滅菌技術(shù)提供支持。

1 生物指示劑在滅菌過程中的應(yīng)用

生物指示劑是一類特殊的微生物制品，對特定的滅菌程序有明確和穩(wěn)定的耐受性[7]，可用來驗證滅菌過程和程序是否符合要求。不同滅菌方式使用不同的生物指示劑，如干熱滅菌使用B.atrophaeusATCC 9372；濕熱滅菌和過氧化氫氣相滅菌使用G.stearothermophilusATCC 7953、B.atrophaeusATCC 9372 和C.sporogenesATCC 7955；環(huán)氧乙烷滅菌使用B.atrophaeusATCC 9372；輻射滅菌使用B.pumilusATCC 27142 等[9-12]。D值是指滅菌過程中殺滅90%的作為生物指示劑的微生物所需的時間，是微生物對暴露環(huán)境損傷抵抗力強弱最直接的表征，也是生物指示劑在滅菌技術(shù)應(yīng)用時的重要參考指標(biāo)。無論使用哪種滅菌方式，都需用已知D值的生物指示劑進行滅菌工藝的驗證。任何一種生物指示劑的建立和選用均需有穩(wěn)定、可靠的 D 值作為參考。影響生物指示劑D值的因素較多，包括在制備階段的各種營養(yǎng)成分，在應(yīng)用階段所處環(huán)境的溫度等。在常規(guī)微生物實驗中，上述各種滅菌方式使用的生物指示劑及其D值如表1 所示[13-14]。針對干熱滅菌方式，在20 世紀20 年代研究人員已開始研究芽孢的致死問題，檢測耐熱菌在不同溫度下的D值，NASA 制定干熱滅菌技術(shù)流程規(guī)范也得益于幾十年前的研究結(jié)果[15-16]。

表1 不同滅菌方式的生物指示劑D 值[13-14]Table 1 D values of biological indicators of diffident sterilization methods[13-14]

2 NASA 干熱滅菌生物指示劑

用作生物指示劑的菌株的基本篩選要求包括[10,12]：1）在需滅菌產(chǎn)品中所有可能的污染菌中耐受能力最強；2）無致病性；3）穩(wěn)定，存活期長，易于保存；4）易于培養(yǎng)；5）使用芽孢的生物指示劑中芽孢含量在90%以上。NASA 在篩選干熱滅菌生物指示劑時也遵從了上述要求。由于B.atrophaeusATCC 9372 芽孢無致病性，無熱源且無毒，對干熱的耐受能力強于大多數(shù)微生物，所以早在干熱滅菌研究初期就被選作生物指示菌株。NASA 噴氣推進實驗室（JPL）使用的干熱滅菌生物指示劑為產(chǎn)芽孢菌的芽孢體，如B.atrophaeusATCC 9372 和B.canaveraliusATCC 29669[5-6]。對干熱的耐受性并非對生物指示菌株的唯一要求，NASA 曾在“海盜號”任務(wù)期間分離到1 株編號V5-8 的產(chǎn)芽孢菌株和B.xerothermoduransATCC 27380 菌株，雖然這2 株菌都具有極強的耐熱能力，但由于其芽孢本身的生物特性，如芽孢體易聚集結(jié)塊、生長特別緩慢、成芽孢率較低，不能作為干熱滅菌生物指示劑使用[17-19]。B.atrophaeusATCC 9372 和B.canaveraliusATCC 29669 菌株在NASA 關(guān)于干熱滅菌技術(shù)的研究中占據(jù)重要位置，影響了NASA 應(yīng)用于行星保護任務(wù)的干熱滅菌技術(shù)流程規(guī)范的制定和修改。

2.1 B. atrophaeus ATCC 9372

B.atrophaeusATCC 9372 是一種重要的生物指示劑菌株，美國、英國、日本、歐盟等國家和地區(qū)都將該菌株作為干熱滅菌、濕熱滅菌和環(huán)氧乙烷滅菌等滅菌方式的通用生物指示劑[20]。同時，該菌株還作為質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株被列入食品和醫(yī)療的檢測標(biāo)準(zhǔn)中。

B.atrophaeusATCC 9372 是一種革蘭氏陽性需氧菌，菌落在含有有機氮的培養(yǎng)基上呈現(xiàn)褐色或者棕紅色，在文獻中常被稱為枯草芽孢桿菌黑色變種（B.subtilis var.niger）[21]。由于B.atrophaeusATCC 9372 營養(yǎng)體菌落有顏色，容易從非產(chǎn)色素細胞中被分離出來，且是AIT 環(huán)境中常見的微生物，早在“海盜號”探測器研制時期就被NASA 用作干熱滅菌的生物指示劑[22-24]。

NASA 對B.atrophaeusATCC 9372 在104～125 ℃范圍內(nèi)的殺滅情況進行了研究，并在其規(guī)范文件NPR 8020.12D 中將B.atrophaeusATCC 9372降低2～3 個數(shù)量級作為干熱滅菌的殺滅效果驗證。目前，B.atrophaeusATCC 9372 的耐干熱機制尚不明確，可能與芽孢內(nèi)吡啶二羧酸（pyridine-2,6-decarboxylic, DPA）以及核心結(jié)構(gòu)礦物質(zhì)含量有關(guān)[25]；還有研究顯示，α/β 酸溶性小蛋白（SASPs）與DNA 結(jié)合也可以提高芽孢對干熱損傷的抵抗能力[23]。

Kempf 等 研 究B.atrophaeusATCC 9372 在115～170 ℃溫度條件下的殺滅情況，發(fā)現(xiàn)該菌株在125 ℃時的D值為19.7 min[26]。而JPL 對從Mariner-Mars 1969 項 目 的 航 天 器AIT 環(huán) 境 中 收 集 到 的103 個菌株的芽孢進行分析發(fā)現(xiàn)，這些菌株的芽孢在125 ℃時的D值在5～58 min 之間，雖然平均D值（18.8 min）與B.atrophaeusATCC 9372 的D值接近，但該研究結(jié)果同時表明，AIT 環(huán)境中存在比B.atrophaeusATCC 9372 更耐熱的菌株[27]。Haque 等對在聚四氟乙烯帶上收集的237 種耐熱菌進行高通量干熱篩選發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)受試菌株比B.atrophaeusATCC 9372 更耐干熱[22]。綜上，航天器AIT 環(huán)境中存在很多D值高于B.atrophaeusATCC 9372 的菌株，因此，出于行星保護的考慮，再以B.atrophaeusATCC 9372 為干熱滅菌生物指示劑已不能滿足任務(wù)要求。

2.2 B. canaveralius ATCC 29669

B.canaveraliusATCC 29669 是從“海盜號”探測器組裝潔凈室的空氣沉降菌中分離得到的，是目前已知最耐熱的產(chǎn)芽孢菌株之一[28-30]。Schubert 和Beaudet 將B.canaveraliusATCC 29669 芽 孢 暴 露在125～200 ℃的環(huán)境中，檢測其在該溫度范圍內(nèi)的D值，并與B.atrophaeusATCC 9372 對比。結(jié)果顯示B.canaveraliusATCC 29669 在115 ℃、125 ℃、200 ℃時的D值分別是B.atrophaeusATCC 9372的80 倍、30 倍和5 倍[31]。B.canaveraliusATCC 29669 的耐熱機制尚不確切，但Seuylemezian 等通過對“海盜號”裝配過程中分離到的12 株耐熱芽孢桿菌進行基因序列比對發(fā)現(xiàn)，B.canaveraliusATCC 29669 的基因組中包含1 個編碼來自Thermococcus kodakaraensis的糖原分支酶的基因，可能有助于菌株耐熱性的提高[32]。

將B.canaveraliusATCC 29669 的16S rRNA基因序列與JPL 收集的來自肯尼迪航天中心航天器裝配車間、約翰遜航天中心以及“鳳凰號”航天器組裝車間的近6100 個菌株的基因序列進行比對[32-37]，發(fā)現(xiàn)只有10 個相似序列（相似度大于97.5%的序列稱為相似序列）。雖然B.canaveraliusATCC 29669 在航天器裝配環(huán)境中并不多見，但由于其具有很強的耐熱性，出于深空探測行星保護的考慮，NASA 將其作為干熱滅菌的指示菌株，在≥125 ℃條件下實現(xiàn)對微生物4～6 個數(shù)量級的殺滅。NASA 比較分析了該菌株在110～200 ℃范圍內(nèi)的殺滅情況，結(jié)果顯示該菌株在各溫度條件下的D值 均 大 于B.atrophaeusATCC 9372 的[26,31]。因此，NASA 于2013 年修改了文件NPR 8020.12D 中的干熱滅菌技術(shù)流程規(guī)范，將干熱滅菌溫度從原來的104～125 ℃更改為110～200 ℃，并給出了使航天器達到無菌水平的干熱滅菌操作建議——500 ℃下保持0.5 s。

使用紅外加熱技術(shù)將B.canaveraliusATCC 29669 菌株迅速升溫至200 ℃以上，根據(jù)其存活率結(jié)果以及數(shù)據(jù)模型分析顯示，初始生物負荷為1×106CFU 的B.canaveralius ATCC 29669 芽 孢，在292 ℃下保持0.5 s 后即可達到10-6CFU 的無菌保證水平（sterility assurance level, SAL）[6]。為提高檢測敏感性，加熱處理后，直接將接種芽孢的材料放入培養(yǎng)基中進行搖瓶培養(yǎng)，在268～334.2 ℃均未檢測到芽孢生長。根據(jù)以上研究結(jié)果，NASA將干熱對芽孢的殺滅提高到了6 個數(shù)量級，并認為292 ℃即可達到無菌水平，目前的規(guī)范可能存在過度滅菌的問題。

3 我國干熱滅菌生物指示劑

3.1 AIT 環(huán)境中耐熱微生物的分離

以筆者所在航天生物公司空間微生物實驗室從海南AIT 環(huán)境獲取的某批次微生物檢測結(jié)果為例，B.amyloliquefaciens及其近緣類群B.licheniformis是最常檢出的產(chǎn)芽孢類微生物，占所有檢出產(chǎn)芽孢菌的60%。對北京AIT 環(huán)境中的嗜熱微生物分離檢測發(fā)現(xiàn)，能夠耐受65 ℃高溫的139 株產(chǎn)芽孢菌主要來自于芽孢桿菌屬（Bacillus）、地芽孢桿菌屬（Geobacillus）和好氧芽孢桿菌屬（Aeribacillus）等，如圖1 所示。

圖1 北京AIT 環(huán)境中耐熱菌組成Fig.1 Composition of heat-resistant microorganisms in Beijing AIT environment

以其中1 株B.amyloliquefaciensB30175 為例，其在115 ℃、125 ℃、135 ℃溫度下的D值均高于B.atrophaeusATCC 9372 的，說明該菌株的耐熱能力強于B.atrophaeusATCC 9372（見表2[24]）。隨著殺滅微生物數(shù)量級的增加，兩者的差距更加明顯，如在115 ℃時殺滅6 個數(shù)量級，B.atrophaeusATCC 9372 只需72.0 min，而B.amyloliquefacienB30175需447.8 min。

表2 B. amyloliquefaciens B30175 和 B. atrophaeus ATCC 9372 殺滅不同數(shù)量級微生物所需時間對比[24]Table 2 Comparison of time required for killing different logarithmic values between B. amyloliquefaciens B30175 and B. atrophaeus ATCC 9372[24]

B.amyloliquefacienB30175 只是目前篩選到的耐熱菌株之一，筆者實驗室對其他耐熱菌株的研究還在進行，不排除我國AIT 環(huán)境中也存在類似B.canaveraliusATCC 29669 的具有極強耐干熱能力菌株的可能性。針對我國AIT 環(huán)境中的耐熱菌株組成，目前正在研究它們在110～200 ℃范圍內(nèi)的殺滅時間和殺滅效率的關(guān)系，并最終以殺滅6 個數(shù)量級為目標(biāo)，建立我國AIT 環(huán)境的耐熱微生物菌株數(shù)據(jù)庫，用于航天器干熱滅菌生物指示劑的篩選。

3.2 干熱滅菌生物指示劑的篩選

目前我國在行星保護任務(wù)的滅菌研究中，還沒有單獨應(yīng)用的生物指示劑，仍使用NASA 干熱滅菌常用的B.atrophaeusATCC 9372，存在滅菌不完全的風(fēng)險，因此亟需根據(jù)我國航天器AIT 環(huán)境微生物狀況篩選合適的干熱滅菌生物指示劑。篩選可按照圖2 所示流程進行：首先對AIT 環(huán)境中已分離出的耐熱產(chǎn)芽孢菌進行菌株鑒定，確定菌株種類，確保菌株無致病性；再從中選擇易培養(yǎng)、成芽孢率高的菌株；以這些菌株為干熱滅菌研究對象，以125 ℃時的D值為檢測指標(biāo)進行普篩，再對其中的優(yōu)異耐熱菌株進行110～200 ℃范圍內(nèi)的芽孢殺滅效率檢測，明確這些菌株在各溫度下的D值，以便遴選作為航天器干熱滅菌的生物指示劑。

圖2 干熱滅菌生物指示劑篩選流程Fig.2 Screening process of biological indicators for DHMR

需要明確的是，對干熱滅菌生物指示劑的篩選是長期不間斷的動態(tài)過程，隨著耐熱能力更強菌株的不斷被發(fā)現(xiàn)，不同時期可能會使用不同的生物指示劑。

4 結(jié)束語

干熱滅菌是所有滅菌方法中最有效、最可控、綜合效果最好的穿透性滅菌方式。干熱滅菌生物指示劑的使用為干熱滅菌技術(shù)流程規(guī)范的形成提供了重要參考依據(jù)。隨著在AIT 環(huán)境中采集和分離的生物指示劑菌株的耐熱能力不同，NASA 逐步修改了其滅菌技術(shù)流程規(guī)范。

當(dāng)前，我國的干熱滅菌主要參考NASA 的標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范，對干熱滅菌生物指示劑的研究還處于初始階段。未來可以在NASA 現(xiàn)有研究的基礎(chǔ)上，繼續(xù)對深空探測航天器裝配過程的各階段進行環(huán)境微生物采樣，特別是對制造、裝配過程已經(jīng)過高溫處理的航天器進行采樣，篩選耐熱芽孢菌株，找到適合我國航天器干熱滅菌的生物指示劑，為制定適合我國的航天器干熱滅菌技術(shù)流程規(guī)范提供數(shù)據(jù)支持，最終目標(biāo)是保證航天器的微生物控制既滿足行星保護任務(wù)要求，又能避免過度滅菌對航天器儀器設(shè)備表面造成不必要的損傷。