單花鳶尾不同時期的花香成分1)

蔡科羽 馮成玉 許紹懌 孫玚 婁倩 孫俊明 陳紅武

(西北農林科技大學,楊凌,712100)

植物花香是植物花朵釋放的次生代謝產物,由花朵釋放的一系列小分子量的易揮發(fā)化合物混合而成[1]。植物花香是植物重要的觀賞性狀之一,在觀賞植物中具有重要的感官意義與美學價值,也具有吸引昆蟲保障授粉、結實的作用。當植物在遭遇外來生物入侵時,花香特征可應用于吸引天敵等植物的自身防御[2]。已被發(fā)現的花香化合物中以萜烯類居多,其余還有脂肪族化合物、芳香族化合物、含氮化合物、含硫化合物等。

鳶尾屬植物(Iris)在我國主要分布于西北、西南、東北地區(qū),目前我國鳶尾屬植物約有64個種[3],占全球鳶尾種的五分之一。我國對鳶尾屬植物的研究大多數是針對于其根莖的化學成分、藥理活性研究,對于其花朵的揮發(fā)性物質成分分析的研究較少。目前,僅有土耳其鳶尾種的花、根、莖揮發(fā)性物質[4]與有髯鳶尾的花香成分[5]被研究測定,且在有髯鳶尾中,揮發(fā)性物質以醇類、醛類、萜烯、酚類居多,具有較高的利用開發(fā)價值。此外,也有學者[6]采用氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)技術與動態(tài)頂空法測定,并分析了鳶尾花對于傳粉昆蟲的吸引作用。已有學者在研究不同花色月季花香成分時,發(fā)現了植物花香與花色之間存在明顯的相關性[7],但鳶尾的花色變化與花香之間的相關性尚未有人涉足。

單花鳶尾(IrisunifloraPall.ex Link)主要產于我國東北地區(qū),目前已知其可作為地被植物或盆栽觀賞[8]。眾所周知,鳶尾屬植物可以治療炎癥、感染甚至癌癥等多種疾病[9],但單花鳶尾的具體藥物活性成分等醫(yī)用、藥用價值,以及花香物質成分、釋香規(guī)律等其他領域用途的研究尚未見報道。

為了填補國內外單花鳶尾花香研究領域的空白,本研究以單花鳶尾野生種為實驗材料,通過電子鼻、頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術測定其花蕾期、盛開期、衰敗期的揮發(fā)性物質成分,結合主成分分析法、線性判別分析方法、傳感器區(qū)分貢獻率分析、碳標法、譜庫檢索法等分析其不同花期的花香物質及變化規(guī)律,為揭示鳶尾屬植物在遺傳與進化的統一性、花香形成機理、花香與花色之間的關系成因等研究提供參考依據,也為提高鳶尾屬植物的綜合效益提供參考。

1 研究方法

試驗所用的單花鳶尾野生種采集于陜西楊凌的西北農林科技大學曹新莊試驗農場,屬于溫帶大陸性季風氣候,平均海拔為530 m,年平均氣溫為12.9 ℃,四季氣候分明,日照條件充足。

本試驗選用花蕾期、盛開期、衰敗期這3個時期的單花鳶尾花朵,作為樣本測定花香物質成分。取樣方法:于晴朗條件下,每日上午08:00—10:00進行采集。試驗員佩戴丁腈手套,用剪刀剪取花序,將其分時期裝入液氮提前預冷的50 mL無菌透明塑料離心管中,用錫紙封口,擰緊瓶蓋并做好標記,放入液氮中暫存,并盡快移入冰箱內-80 ℃冷凍保存。

試驗儀器:ISQ&TRACE ISQ氣相色譜-質譜(GC-MS)聯用儀、德國AirsensePEN3電子鼻、分析天平、手動頂空進樣器、色譜柱為Rtx-1MS(30.00 m×0.25 mm×0.25 mm)、15 mL頂空進樣瓶、錫箔紙、離心管等。

電子鼻:試驗前確保實驗室空氣干凈無異味、人員較少。進樣之前,先進行洗氣,直至10個傳感器的響應值都為1,即雷達圖近似圓形時,取出裝有各花期單花鳶尾的離心管,靜置30 min使樣品頂部空間揮發(fā)物達到平衡狀態(tài),用電子鼻進樣針和補氣針同時透過錫紙,插入到頂空瓶中進行頂空取樣檢測。每一次測試均包括洗氣歸零與進樣。電子鼻測定條件:氣體流量400 mL·min-1,洗氣時間60 s,調零時間5 s,準備時間5 s,測定時間120 s,取115～117 s的值用于數據分析。進樣時流速150 mL·min-1。清洗時以潔凈空氣作為載氣,載氣流量、進樣流量均為200 mL·min-1[10]。不同類型化合物對電子鼻傳感器的影響見表1。

表1 PEN3型電子鼻各傳感器特征

頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用:取各花期樣品1 g左右,分別置于15 mL的頂空固相微萃瓶中,瓶底部貼壁加入2-壬酮(0.008 μL·mL-1)10 μL,用錫箔紙封住瓶口蓋上瓶蓋。45 ℃平衡10 min后插入手動頂空進樣器,進樣器插入進樣瓶的頂空部分,萃取30 min。每個樣品重復試驗4次。將手動頂空進樣器插入氣相色譜-質譜聯用儀的進樣口中。250 ℃解析2.5 min,使香氣成分完全釋放于氣相色譜-質譜聯用儀中[11]。

色譜條件:色譜柱為HP-5MS(30.00 m×0.25 mm×0.25 μm)毛細管,采用不分流模式,進樣口溫度250 ℃,樣品解析時間3 min,載氣為氦氣,流速1.0 mL·min-1,柱溫設定為升降溫程序:起始溫度40 ℃,保持時間3 min,先以5 ℃·min-1的速率升溫至150 ℃,再以10 ℃·min-1的速率升溫至220 ℃,保持10 min。

質譜條件:采用全掃描模式,電離模式EI(電子電離),發(fā)射電流10 Ua,電子能70 Ev,離子源溫度220 ℃,傳輸源溫度220 ℃,質量掃描范圍為35～450 amu。

氣質聯用定性方法:根據離子峰圖從第1個穩(wěn)定峰開始查看,穩(wěn)定峰對應同一RT(保留時間)值下多種物質首選排序第1位,對比4次基礎生物學重復中,選中物質要在同一RT值下出現,且排名最前的。

定量方法:內標法,選用2-壬酮為內標物質,密度為0.82 g·mL-1,對鳶尾樣品中各種香氣組分進行定量,4次生物學重復后取平均值,公式(1)。

Mi=(C0×V0×Ai)/(A0×M)。

(1)

式中:Mi為各香氣組分質量分數(μg/g);C0為內標質量濃度(g/L);V0為內標體積(μL);Ai、A0分別為所求香氣組分峰面積及內標峰面積;M為樣品質量(g)。

2 結果與分析

2.1 單花鳶尾不同時期揮發(fā)性物質對電子鼻的影響

圖1為不同花期單花鳶尾揮發(fā)物的特征雷達圖。不同花期10個傳感器的電阻比值明顯不一致?；ɡ倨赪5S、W1S、W1W、W2W傳感器的G/G0(相對電導率)值比其他傳感器電阻比值高,說明該花期揮發(fā)物中主要含氮氧化合物、無機硫化物、甲基類化合物、有機硫化物等物質;盛開期W5C、W1W、W2S、W2W、W3S傳感器G/G0值比其他傳感器電阻比值高,說明該時期揮發(fā)物中主要含短鏈烷烴、醇類、無機硫化物、有機硫化物、長鏈烷烴等物質;衰敗期W5S、W1S、W1W、W2S、W2W、W3S傳感器G/G0值比其他傳感器電阻比值高,說明該時期揮發(fā)物中含氮氧化合物、甲基類化合物、醇類、無機硫化物、有機硫化物、長鏈烷烴等物質。

A為花蕾期電子鼻雷達圖;B為盛開期電子鼻雷達圖;C為衰敗期電子鼻雷達圖。1為W1C傳感器;2為W5S傳感器;3為W3C傳感器;4為W6S傳感器;5為W5C傳感器;6為W1S傳感器;7為W1W傳感器;8為W2S傳感器;9為W2W傳感器;10為W3S傳感器。

2.2 主成分分析區(qū)分單花鳶尾不同時期花香

單花鳶尾花蕾期、盛開期、衰敗期的主成分分析(PCA)結果見圖2,第一主成分貢獻率為98.556%,第二主成分貢獻率為1.304%,2個主成分累計貢獻率為99.86%,故這2個主成分基本代表了樣品的主要信息特征。由圖2可知,3個時期的單花鳶尾使用主成分分析法并不能被顯著區(qū)分。原因在于花蕾期與盛開期的花香氣味較為接近。

圖2 不同花期單花鳶尾的主成分分析

2.3 影響單花鳶尾不同時期花香差異的主要揮發(fā)性物質貢獻率判別

電子鼻載荷(Loadings)分析是傳感器對樣品中揮發(fā)性物質進行區(qū)分的一種研究方法,主要考察樣品中何種氣體物質起主要區(qū)分作用,并判別其貢獻率大小[12]。各花期的電子鼻載荷分析結果見圖3,傳感器W1W(對硫化物、萜烯敏感)、傳感器W2W(對有機硫化物、芳香族敏感)、傳感器W1S(對甲烷敏感)、傳感器W5S(對氮氧化合物敏感)、傳感器W2S(對醇類、部分芳香族敏感)的位點距離原點較遠,是區(qū)分各花期花香變化的主要傳感器[13]?？梢酝茰y,W1W、W2W、W1S、W5S、W2S這5個傳感器對單花鳶尾不同花期花朵的識別度最為敏感,起主要區(qū)分作用。說明單花鳶尾不同花期的花香成分差異主要與硫化物、萜烯、有機硫化物類、芳香族化合物、甲烷、氮氧化合物、醇類等揮發(fā)性物質有關。

圖3 單花鳶尾不同花期的電子鼻載荷分析

2.4 線性判別分析區(qū)分單花鳶尾不同時期花香

不同花期的單花鳶尾線性判別(LDA)分析結果見圖4,第一線性判別因子(LD1)貢獻率為98.625%,第二線性判別因子(LD2)貢獻率為1.026%,累計貢獻率達99.651%。這說明線性判別分析可以將各花期的花香物質完全區(qū)分。相較于主成分分析,線性判別分析處理的分布區(qū)域更為集中,且其區(qū)分效果顯著高于主成分分析。

圖4 不同花期的單花鳶尾線性判別分析

2.5 單花鳶尾不同時期揮發(fā)物成分和質量分數分析

使用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術,在單花鳶尾各時期共檢測出57種花香物質。其中花蕾期22種,盛開期33種,衰敗期29種。這些揮發(fā)性成分可分為9大類:萜烯類、雜環(huán)類、芳香烴、醇類、酯類、酚類、醛類、烷烴、酮類。不同花期單花鳶尾的揮發(fā)性成分類別見表2。

表2 不同花期單花鳶尾的揮發(fā)性成分及質量分數

由表2可知,單花鳶尾各花期的揮發(fā)性成分差異較大。其中,醇類、醛類物質在各花期中質量分數較大,是花香成分的主要類別。醛類物質在盛開期質量分數最高,達到77.80%,其次是衰敗期,質量分數為49.90%,花蕾期則為43.17%;萜烯類物質在盛開期質量分數最高,達到4.09%;酚類物質在花蕾期中質量分數最高,達到9.89%。在花蕾期與盛開期中,除了芳香烴之外的各類物質均被檢測到;而在衰敗期中,檢測到除了雜環(huán)類以外的各類物質。此結果與先前的電子鼻雷達圖在很大程度上相吻合。

在單花鳶尾不同花期共檢測出57種主要花香成分。從表3可以看出,不同時期的單花鳶尾檢測出的揮發(fā)性成分有明顯差別。2-己烯醛、3-己烯-1-醇這2種物質在各花期質量分數均較高。

表3 不同花期單花鳶尾的主要揮發(fā)性成分及質量分數

各花期質量分數大于1%的揮發(fā)性物質見表4。其中,2-己烯醛、3-己烯-1-醇、正己醇、壬醛為各個時期均檢測到的質量分數大于1%的物質。有些揮發(fā)性成分在某花期質量分數較大,但在另一花期中質量分數較低,甚至未能檢測到。例如,2-甲基-4-戊醛在盛開期中質量分數為52.68%,但在花蕾期、衰敗期中均未能檢測到;3-己烯醛在衰敗期中質量分數為41.10%,但在花蕾期、盛開期中未能檢測到。萜烯類是大量品種觀賞花卉的主要呈香物質,幾乎在所有的植物花香成分中都能被檢測到[14],如具有甜香味的羅勒烯、具有清新草味的α-蒎烯等[15]。但本研究并沒有在單花鳶尾花蕾期檢測到任何質量分數大于1%的萜烯類,而羅勒烯等萜烯類物質的質量分數在盛開期、衰敗期較為豐富。

表4 各花期質量分數大于1%的揮發(fā)性物質

3 討論與結論

本研究以單花鳶尾各花期樣本為實驗材料,應用電子鼻技術、頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術探究不同花期的花香成分變化。為了探究各花期揮發(fā)性物質能否被顯著區(qū)分,本研究利用主成分分析(PCA)、線性判別分析方法(LDA)、傳感器區(qū)分貢獻率分析(Loadings)進行檢測。結果表明,采用主成分分析處理之后,3個花期的主成分1、2累計貢獻率達到99.86%,但由于花蕾期與盛開期氣味較為接近,不可在此方法下被顯著區(qū)分;采用線性判別分析,其累計貢獻率達到99.651%,可以完全區(qū)分各花期花香成分。采用傳感器區(qū)分貢獻率分析,得到W1W、W2W、W1S、W5S、W2S這5個傳感器對單花鳶尾不同花期花朵的識別度最為敏感,起主要區(qū)分作用。綜上所述,其花香氣味存在顯著差異性,且不同花期的花香成分差異主要與硫化物、萜烯、有機硫化物類、芳香族化合物、甲烷、氮氧化合物、醇類等物質有關。這一結論為后續(xù)的氣相色譜-質譜聯用技術提供了理論基礎與證據。

氣相色譜-質譜聯用技術實驗證實,單花鳶尾各花期具有獨特香味的原因在于,其揮發(fā)性物質的種類、比例不同。其中,2-己烯醛、3-己烯-1-醇、正己醇、壬醛為各花期共有的主要呈香物質,而花蕾期中2-己炔-1-醇、2,4-二叔丁基苯酚的質量分數較高,可用于區(qū)別另外2個花期,盛開期的2-甲基-4-戊醛、羅勒烯、芳樟醇質量分數較高,衰敗期則富有3-己烯醛、羅勒烯、反-2-壬烯-1-醇。

本研究在單花鳶尾各花期檢測到的揮發(fā)性物質以醇類、醛類居多,萜烯、酚類次之。比較3個花期檢測到的揮發(fā)性成分可以發(fā)現,萜烯類物質在盛開期質量分數最高(4.09%)。花蕾期中含有較為豐富的酚類物質(9.89%)。芳香烴類物質僅在衰敗期檢測到,但質量分數較低(0.62%),推測其呈香效果并不顯著,對于衰敗期花香的特征性貢獻不大。

在本研究中單花鳶尾檢測到質量分數較高的2-甲基-4-戊醛,可作為藥物眠爾通與殺蟲劑的中間體[16];3-己烯-1-醇是世界流行的清香型名貴香料,是香精生產過程中不可缺少的調香物質之一[17];3-己烯醛因具有強烈的青草與蘋果香味而被允許作為食用香料;α-蒎烯不僅對白念珠菌有抑制作用,還可作為香皂、清潔劑的原材料[18]。由此可見,單花鳶尾除了已知的觀賞價值之外,還具有較高的醫(yī)用、藥用、經濟價值。

花香成分的種類與質量分數受到基因、節(jié)律、傳粉昆蟲等眾多因素的調控[19],鳶尾屬植物的釋香部位、晝夜節(jié)律等規(guī)律特點還有待進一步研究。隨著鳶尾研究乃至代謝組學研究的深入,可以在本研究得出的結論之上,對鳶尾屬植物的花香成分合成機理、基因調控、感官組學等方面展開研究。