趙群 趙慧琴 王改萍 周偉偉 章雷

(南京林業(yè)大學,南京,210037)

銀杏(Ginkgobiloba)是我國特有的珍貴孑遺植物,具有很好的觀賞價值和藥用價值[1]。銀杏葉提取物中黃酮類化合物是主要的藥用成分,包括槲皮素、山奈酚、異鼠李素[2],具有清除自由基、抗氧化、降血脂、降血糖等作用,在治療冠心病、糖尿病、心腦血管疾病等方面有較好的效果[3]。我國在銀杏藥源方面擁有著得天獨厚的優(yōu)勢,但是我國銀杏葉提取物的質量標準還與歐美國家存在一定的差距[4],因此培育出黃酮質量分數高的銀杏品種和改進銀杏培育技術尤為重要。

類黃酮是植物體內最重要的次生代謝物之一,在植物的生長、發(fā)育、抗逆性等方面發(fā)揮著重要的作用[5]。苯丙氨酸代謝途徑是植物類黃酮生物合成的起始途徑,苯丙氨酸酶(PAL)、肉桂酸-4-羥基化酶(C4H)是苯丙氨酸代謝途徑的關鍵酶,對黃酮前體物質的合成起著關鍵作用[6]。光照[7]、溫度[8]、水分[9]等環(huán)境條件的變化,都會刺激植體內的防御機制,從而引起黃酮質量分數的改變。光照是植物進行光合作用獲得生長所需能量的來源,對植物的生長發(fā)育、形態(tài)建成、物質代謝至關重要[10]。植物通過光合作用產生營養(yǎng)物質,而這些營養(yǎng)物質是黃酮類次生代謝物合成的基礎[11]。王華田等[12]研究表明,樹冠上層受到光照較強的銀杏葉片的黃酮質量分數,明顯高于下層光照不足的葉片;也有不少研究發(fā)現,適度的遮陰也可以促進黃酮質量分數的積累[13]。所以探究光照強度對銀杏黃酮積累的影響具有重要意義。

為此,本研究在河北省唐山市灤南縣林場,以3年生銀杏實生苗為砧木,以優(yōu)株枝條為接穗(6個品系)進行嫁接;在植株上方、距地面高2 m,搭建2種不同透光度的遮陰網(遮光率為25%、45%的遮陰),以不遮陰作為對照;以6個品系的3年生銀杏嫁接苗為試驗材料,測定凈光合速率、酶活性、次生代謝物、總黃酮醇苷,分析不同遮陰處理對6個銀杏品系葉凈光合速率、酶活性、總黃酮質量分數的影響,遴選有利于銀杏黃酮積累的最適光照強度、最優(yōu)銀杏品系。旨在為葉用銀杏的經營管理提供參考。

1 試驗地概況

試驗地為河北省唐山市灤南縣林場(地理坐標:東經118°8′～118°53′、北緯39°～39°38′),屬暖溫帶半濕潤大陸性季風性氣候。年平均氣溫10.6 ℃,常年降水量658 mm,年均日照時間2 853 h,無霜期186 d。主要土壤類型為草甸褐土、水稻土、潮土、風沙土等;土壤pH為6.2～7.5,有機質質量分數約13.3 g·kg-1,土壤墑情好、肥力較高、保水保肥能力強。

2 研究方法

以高0.5～0.8 m、地徑(1.5±0.2)cm的銀杏3年生實生苗(邳州的梅核品種)為砧木,以直徑(1.0±0.1)cm的優(yōu)株枝條為接穗進行嫁接,接穗包括6個品系:13#(產地為江蘇農學院)、16#(產地為江蘇農學院)、27#(產地為鐵富南馮場)、葉豐(產地為山東日照)、大花穗(產地為江蘇邳州)、泰興大佛指(產地為江蘇泰興),每個無性系各嫁接60～90株,每根砧木嫁接1根接穗。

試驗在2021年6月下旬開始,9月下旬結束。采用隨機區(qū)組試驗設計,共設3個區(qū)組,作為試驗的3個重復,每個區(qū)組包括6個小區(qū),6個銀杏品系隨機分配在各小區(qū)。在每個小區(qū)的植株上方搭建兩種不同透光度的遮陰網,遮陰網距地面2 m;用手持式光量子計3415F測得遮光率分別為遮光率為25%遮陰、遮光率為45%遮陰,以不遮陰作為對照。試驗設3個重復,每個重復包括20株苗木。

葉片光合作用指數的測定:于上午9時到11時,在每個區(qū)組隨機選取18植株銀杏嫁接苗,采用Li-6400便攜式光合測定儀(LI-COR公司,美國)測定光合參數,重復3次。

苯丙氨酸酶(PAL)活性測定:參考劉家堯等[14]的方法,并適當改進。取新鮮葉片0.2 g,加入濃度為0.05 mol/L、pH為8.8的硼酸緩沖液(含巰基乙醇5 mmol/L)6 mL,少量聚乙烯吡烷酮(PVP),在冰浴中研磨勻漿,于4 ℃、10 000 r/min離心15 min,取上清液測定酶活力。反應液包括上清液0.2 mL、濃度為0.02 mol/L的苯丙氨酸1 mL、濃度為0.05 mol/L的硼酸緩沖液3.8 mL,總體積5 mL。對照不加酶液,以硼酸緩沖液代替?；靹蚝?恒溫水浴(30 ℃)反應30 min,加入濃度為6 mol/L的鹽酸溶液0.5 mL終止反應。在波長290 nm處測定吸光度值,以每小時吸光度值變化0.1為1個酶活單位(U)。

肉桂酸-4-羥基化酶(C4H)活性測定:參考陳雷等[15]方法,并適當改進。取新鮮葉片0.2 g,加入5 mL預冷(4 ℃)的濃度為0.1 mol/L、pH為7.6的磷酸緩沖液(含蔗糖0.25 mol/L、乙二胺四乙酸0.5 mmol/L、巰基乙醇2 mmol/L),冰浴迅速研磨成勻漿,于4 ℃、12 000 r/min離心30 min,上清液用于酶活性的檢測。測定系統(tǒng)含有酶液0.2 mL、濃度為50 mmol/L的肉桂酸0.2 mL、質量濃度為0.4 g/L的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸3 mL、濃度為0.1 mol/L的磷酸緩沖液3 mL。對照不加酶液,以磷酸緩沖液代替。反應液水浴(30 ℃)30 min,加入0.2 mL濃度為6 mol/L的鹽酸終止反應,取上清液用NaOH調至pH為11;在波長340 nm處測定吸光度,以每分鐘吸光度值變化0.01為1個酶活單位(U)。

葉片黃酮質量分數測定:參照《中國藥典》[16]方法,利用waters1525分析型高效液相色譜儀測定。

總黃酮醇苷的質量分數=(槲皮素質量分數+山柰酚質量分數+異鼠李素質量分數)×2.51。式中的2.51,為總黃酮醇苷與其水解后的三種苷元槲皮素、山柰酚、異鼠李素的換算系數。

數據處理:使用Excel對數據進行統(tǒng)計,并用SPSS 24.0軟件中的鄧肯(Duncan)法進行方差分析、相關性分析。

3 結果與分析

3.1 光照強度對銀杏光合作用的影響

由表1可見:凈光合速率在不同光照強度時存在一定的差異,而不同品種(系)間差異不顯著。16#品系在不同光照強度處理間凈光合速率差異顯著(P<0.05);其他品系的凈光合速率,在不同光照強度處理間差異不顯著。27#在對照(不遮陰)時凈光合速率最高(7.23 μmol·m-2·s-1),大花穗在遮光率為45%時凈光合速率最低(3.8 μmol·m-2·s-1)。不同銀杏品系凈光合速率,由大到小均呈現對照(不遮陰)、遮光率為25%、遮光率為45%的趨勢,表明隨著光照強度的降低,銀杏凈光合速率下降。

表1 不同光照強度時各品種(系)銀杏凈光合速率

3.2 光照強度對銀杏苯丙烷代謝酶活性的影響

光照強度、品種(系)以及兩者的協(xié)同效應,對銀杏苯丙氨酸酶活性都存在顯著影響;隨著光照強度的降低,苯丙氨酸酶活性呈現先升高后降低的趨勢(見表2)。同一光照強度時,不同品種(系)間銀杏苯丙氨酸酶活性差異極顯著(P<0.01);在對照(不遮陰)、遮光率為45%遮陰處理時,葉豐的苯丙氨酸酶活性明顯大于其他5個品種(系);在遮光率為25%遮陰處理時,泰興大佛指苯丙氨酸酶活性最大(15.79 U·g-1);而在遮光率為45%遮陰處理時,13#苯丙氨酸酶活性最低(3.29 U·g-1)。在不同光照強度間,除了葉豐外的其他品種(系)苯丙氨酸酶活性都存在顯著差異(P<0.05);其他品種(系)在遮光率為25%遮陰處理時的苯丙氨酸酶活性,顯著高于對照(不遮陰)、遮光率為45%遮陰處理時的苯丙氨酸酶活性,說明遮光率為25%遮陰處理可以顯著提高葉片苯丙氨酸酶活性。

表2 不同光照強度時各品種(系)銀杏苯丙氨酸酶活性

光照強度、品種(系)及兩者的協(xié)同效應,對銀杏肉桂酸-4-羥基化酶的活性都存在顯著影響。由表3可見:同一光照強度時,不同品種(系)間銀杏肉桂酸-4-羥基化酶活性差異顯著(P<0.05);在遮光率為25%遮陰處理時,泰興大佛指肉桂酸-4-羥基化酶活性最大(43.80 U·g-1);在對照(不遮陰)時,13#肉桂酸-4-羥基化酶活性最低(16.77 U·g-1)。13#和葉豐在不同光照強度間肉桂酸-4-羥基化酶活性差異顯著(P<0.05);13#和葉豐在遮光率為25%、45%遮陰處理時的肉桂酸-4-羥基化酶酶活性,明顯大于對照(不遮陰)時的肉桂酸-4-羥基化酶活性。說明在銀杏生長過程中,通過遮光率為25%、45%的遮陰處理,可以顯著提高銀杏葉片肉桂酸-4-羥基化酶活性。

表3 不同光照強度時各品種(系)銀杏肉桂酸-4-羥基化酶活性

3.3 光照強度對銀杏次生代謝物質量分數的影響

由表4可見:隨著光照強度降低,銀杏黃酮醇質量分數總體都呈現先上升后下降的趨勢。①不同光照強度時,除了27#以外的其他品種(系)銀杏槲皮素質量分數都存在顯著差異(P<0.05);遮光率為25%遮陰處理時,葉豐槲皮素質量分數最高(2.54 mg·g-1);13#、16#在遮陰處理時的槲皮素質量分數,顯著高于對照(不遮陰)時的槲皮素質量分數;大花穗、泰興大佛指、葉豐在遮光率為25%遮陰處理時的槲皮素質量分數,顯著高于對照(不遮陰)、遮光率為45%遮陰處理時的槲皮素質量分數;只有27#槲皮素質量分數差異不顯著。②不同光照強度時,13#和泰興大佛指山奈酚質量分數存在極顯著差異(P<0.01),在遮光率為25%遮陰處理時的山奈酚質量分數,顯著高于對照(不遮陰)、遮光率為45%遮陰處理時的山奈酚質量分數。大花穗和葉豐質量分數差異顯著(P<0.05);遮光率為25%遮陰處理時,葉豐的山奈酚質量分數最高(1.49 mg·g-1);大花穗在遮陰處理時的山奈酚質量分數,顯著高于對照(不遮陰)時的山奈酚質量分數;只有16#、27#品系山奈酚質量分數差異不顯著。③不同光照強度時,13#和泰興大佛指銀杏異鼠李素質量分數都存在顯著差異(P<0.05);遮光率為25%遮陰處理時,泰興大佛指異鼠李素質量分數最高(0.76 mg·g-1);13#在遮陰處理時的異鼠李素質量分數,明顯大于對照(不遮陰)的異鼠李素質量分數;泰興大佛指在遮光率為25%遮陰處理時的異鼠李素質量分數,明顯大于對照(不遮陰)、遮光率為45%遮陰處理時的異鼠李素質量分數;只有27#異鼠李素質量分數差異不顯著。④綜合試驗結果,適度地遮陰可以顯著提高葉片黃酮醇質量分數,總體看遮光率為25%遮陰處理效果最佳。

表4 不同光照強度時各品種(系)銀杏嫁接苗的黃酮醇積累量

光照強度、品種(系)及兩者的協(xié)同效應,對銀杏總黃酮醇苷質量分數都存在顯著影響。由表5可見:同一光照強度時,不同品種(系)間銀杏總黃酮醇苷質量分數差異極顯著(P<0.01);遮光率為25%遮陰處理時,泰興大佛指總黃酮醇苷質量分數最高(11.28 mg·g-1);對照(不遮陰)時,16#總黃酮醇苷質量分數最低(3.49 mg·g-1)。在不同光照強度時,除了27#以外的其他品種(系)銀杏總黃酮醇苷質量分數都存在顯著差異(P<0.05);13#、泰興大佛指、葉豐在遮光率為25%遮陰處理時總黃酮醇苷質量分數,明顯高于對照(不遮陰)、遮光率為45%遮陰處理時總黃酮醇苷質量分數;16#、大花穗在遮陰處理時總黃酮醇苷質量分數,明顯高于對照(不遮陰)時總黃酮醇苷質量分數;只有27#總黃酮醇苷質量分數差異不顯著;綜合試驗結果,遮光率為25%遮陰處理可顯著提高銀杏葉總黃酮醇苷質量分數。

表5 不同光照強度時各品種(系)銀杏總黃酮醇苷質量分數

3.4 不同光照強度時銀杏生理指標相關性

由表6可見:銀杏凈光合速率與其他指標無明顯相關性;而苯丙氨酸酶、肉桂酸-4-羥基化酶活性,與總黃酮醇苷質量分數呈顯著正相關,說明隨著苯丙氨酸酶、肉桂酸-4-羥基化酶活性的增加,總黃酮醇苷質量分數也逐漸增加。苯丙氨酸酶與肉桂酸-4-羥基化酶之間,也呈現顯著正相關。

表6 銀杏各生理指標間的相關性

4 討論與結論

光合作用對植物的生長發(fā)育起著重要作用,光照強度的變化對銀杏葉的光合指標有一定的影響[17]。隨著光照強度的降低,銀杏葉片光合能力顯著下降,不能夠進行有效的光合作用,從而導致銀杏的生長受到抑制[18]。苑景淇等[19]研究表明,隨著遮陰度增加,朝鮮崖柏(Thujakoraiensis)的凈光合速率降低。張往祥等[20]研究表明,遮陰可以降低銀杏的光合午休程度,從而導致凈光合速率的降低。本研究中,銀杏凈光合速率隨著遮陰強度的增加而呈下降趨勢,除了16#外,其他品系在不同光照強度時凈光合速率差異都不顯著,是因為這些品系在一定的光照條件時光合作用已達到飽和,從而導致凈光合速率與苯丙氨酸酶活性、肉桂酸-4-羥基化酶活性、黃酮質量分數間沒有顯著相關性。

苯丙氨酸酶、肉桂酸-4-羥基化酶是次生代謝途徑中的關鍵酶,對黃酮的合成有重要的促進作用[21]。不同的光照強度對苯丙氨酸酶活性、肉桂酸-4-羥基化酶活性都存在顯著影響。本研究表明,遮光率為25%遮陰處理時苯丙氨酸酶活性最高,肉桂酸-4-羥基化酶活性在遮陰處理時顯著高于不遮陰處理時。Pacheco et al.[22]研究表明,遮陰處理時,樹胡椒(PiperaduncumL.))葉片中苯丙氨酸酶活性是全光照下的2.5倍,說明適度的遮陰能有效提高酶活性。而朱燦燦[23]研究表明,不同光強條件時苯丙氨酸酶、肉桂酸-4-羥基化酶的變化趨勢一致,且隨著光照強度的減弱,兩種酶活性呈現逐漸減小的狀態(tài);這是因為品種不同導致的,不同品種間生物學特性不同,處理時間和試驗地自然條件也不同,從而會影響試驗結果。本研究中,泰興大佛指在遮光率為25%遮陰處理時苯丙氨酸酶、肉桂酸-4-羥基化酶活性都達到最高,說明遮光率為25%遮陰處理對泰興大佛指酶活性的效果最好。

光照強度對銀杏次生代謝途徑有重要的影響,光合作用能使銀杏葉片中黃酮類化合物得到有效的積累[24]。遮陰能夠有效降低葉片的溫度,有利于黃酮類化合物的積累[25]。錢龍梁等[26]研究表明,銀杏葉的總黃酮質量分數在30%遮陰處理時最高。文獻[26]和本研究試驗結果出現差異的原因,主要是由于遮陰方式不同,文獻[26]是通過玉米植株形成的陰影對1年生銀杏幼苗進行生物遮陰,而本研究試驗使用的不同透光度的遮陰網,文獻[26]遮陰方式比較粗放;而且銀杏苗齡不同,黃酮質量分數也會有很大的差異。王華田等[27]研究表明,存在1個最適宜的光照強度42%使得銀杏葉片的黃酮質量分數最高;與本研究試驗結果存在差異的主要原因是測定黃酮的方法不同以及品種的差異;文獻[27]是采用分光光度法直接測定3年生銀杏實生苗總黃酮質量分數,而本研究試驗采用高效液相色譜法(HPLC)測定3年生銀杏嫁接苗每一個黃酮醇苷質量分數再計算總黃酮醇苷質量分數。冷平生等[28]研究表明,自然光下黃酮質量分數最高,是遮陰時間以及苗齡與本試驗不同造成的。

本研究相關性分析表明,肉桂酸-4-羥基化酶、苯丙氨酸酶活性呈顯著正相關;苯丙氨酸酶、肉桂酸-4-羥基化酶活性,與總黃酮質量分數呈顯著正相關。苯丙氨酸酶能夠催化苯丙氨酸生成銀杏次生代謝產物的前體物質肉桂酸[29];肉桂酸-4-羥基化酶作用于苯丙烷代謝途徑中的第二步,能催化反式肉桂酸轉化為對香豆酸[30];苯丙氨酸酶、肉桂酸-4-羥基化酶是銀杏苯丙烷代謝途徑中的關鍵酶,而苯丙烷代謝途徑是合成黃酮類化合物的起始途徑[31];因此,苯丙氨酸酶活性的變化會引起肉桂酸-4-羥基化酶活性的變化,進而引起黃酮質量分數的變化。

本研究綜合分析表明,輕度遮陰對銀杏黃酮積累有利,以遮光率為25%遮陰處理效果最佳。在這個遮陰強度時,雖然凈光合速率有一定程度的降低,但是銀杏苯丙氨酸酶活性、肉桂酸-4-羥基化酶活性、總黃酮醇苷質量分數較高;不同品系在遮陰處理時也存在較大差異,以泰興大佛指表現最好,27#表現最差。泰興大佛指在遮光率為25%遮陰處理時,苯丙氨酸酶活性、肉桂酸-4-羥基化酶活性、總黃酮醇苷質量分數最高。因此,泰興大佛指適合作為葉用品種(系)在唐山地區(qū)栽培,在高溫強光的夏季可以通過遮光率為25%遮陰處理進一步提高黃酮質量分數,以更好地發(fā)揮銀杏的藥用價值。