HPLC法檢查丙胺卡因原料藥有關(guān)物質(zhì)方法研究

王 坤,陳慧芳,楊 瑩,馬 允

(安慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校,安徽 安慶 246052)

丙胺卡因(procaine)是一種酰胺類局部麻醉藥物,其針劑臨床上用于硬膜外、阻滯和潤等各種手術(shù)麻醉[1-3]。此外常和利多卡因聯(lián)合制成復(fù)方利多卡因乳膏,用于針穿刺,淺層外科手術(shù)等皮層局部麻醉[4]。丙胺卡因的作用機制是阻滯神經(jīng)沖動產(chǎn)生和傳導(dǎo)所需的離子流而穩(wěn)定神經(jīng)細胞膜,從而產(chǎn)生局部麻醉效應(yīng)[5]。丙胺卡因原料用于各種局麻制劑的原料藥,臨床應(yīng)用廣泛,其原料藥有關(guān)物質(zhì)各國藥典收載均有欠缺,2020年版《中國藥典》暫未見收載其有關(guān)物質(zhì)[6-7]。本研究參考歐洲藥典10.0,并對藥典收載方法進行優(yōu)化,結(jié)合合成工藝得知丙胺卡因原料藥共7個已知雜質(zhì)(A～G,結(jié)構(gòu)見下圖1),其中雜質(zhì)B既為工藝雜質(zhì)也為降解雜質(zhì),其他均為合成工藝雜質(zhì)。同時丙氨卡因是一種水溶性藥物[8],因此在其雜質(zhì)檢查中,使用高效液相色譜法可以實現(xiàn)對水溶性雜質(zhì)的準(zhǔn)確檢測和分離,有較高的靈敏度和可靠性。相比之下,氣相色譜法主要適用于描繪揮發(fā)性化合物,對于水溶性雜質(zhì)的分析能力較弱,對保障藥物質(zhì)量的檢測準(zhǔn)確性有一定影響[9]。因此,高效液相色譜法(HPLC)在丙氨卡因雜質(zhì)檢查中具有明顯的優(yōu)勢,是首選的檢測方法?；诖?本研究建立了專屬性強、靈敏度高、準(zhǔn)確度高、精密度好有關(guān)物質(zhì)檢測方法,適合對丙胺卡因原料藥有關(guān)物質(zhì)進行質(zhì)控。

圖1 7種已知雜質(zhì)

1 儀器與試劑

1.1 儀器設(shè)備XS204DR型電子分析天平(瑞士梅特勒公司);ME205E千分之一電子天平(瑞士梅特勒公司);FE20 pH計(瑞士梅特勒公司);Wates e2678高效液相色譜儀(美國Wates公司);HAS超聲儀(上海一恒公司)。EMPOWER分析工作站。

1.2 試劑或試藥磷酸氫二鈉二水合物為分析純(國藥集團公司);磷酸二氫鈉一水合物為分析純(國藥集團公司)。丙胺卡因?qū)φ掌?中檢院);雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F、雜質(zhì)G對照品,LGC。丙胺卡因原料(印度)。純化水;乙腈為HPLC級(阿拉丁公司);磷酸、氫氧化鈉均為分析純(國藥集團公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 EP10.0方法復(fù)核色譜條件,采用封端色譜柱 Waters Xbridge C18(150 mm×4.6 mm,5 μm),以磷酸鹽緩沖液(0.18 g磷酸二氫鈉和2.89 g磷酸二氫鈉二水合物加100 mL水溶解)-乙腈(74∶26)為流動相,柱溫25 ℃,流速每分鐘1.0 mL,檢測波長:240 nm,進樣量20 μL。空白溶劑即流動相。系統(tǒng)適用性溶液:取丙胺卡因、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F、雜質(zhì)G對照品適量,精密稱定,用流動相稀釋溶解成每毫升約含丙胺卡因2.5 mg、雜質(zhì)A 2.5 μg、雜質(zhì)B 0.25 μg、雜質(zhì)C 2.5 μg、雜質(zhì)E 2.5 μg、雜質(zhì)F 2.5 μg與雜質(zhì)G 2.5 μg的溶液。取空白、系統(tǒng)適用性溶液照色譜條件,注入色譜儀,記錄色譜圖。見下圖2系統(tǒng)適用性溶液圖譜。由圖譜2數(shù)據(jù)顯示雜質(zhì)F與雜質(zhì)A分離度為1.10,

圖2 系統(tǒng)適用性色譜圖

雜質(zhì)E與雜質(zhì)D分離度為1.38,分離度均小于1.5,EP10.0方法不適合丙胺卡因有關(guān)物質(zhì)檢測,嘗試調(diào)整流動相比例等措施對色譜條件進行優(yōu)化。

2.2 方法優(yōu)化

2.2.1 流動相比例調(diào)整 通過調(diào)整相與有機相的比例對EP10.0色譜條件進行優(yōu)化。(1)增加有機相比例:以磷酸鹽緩沖液-乙腈(70∶30)為條件,其他色譜條件不變。取系統(tǒng)適用性溶液注入色譜儀,記錄圖譜。如下圖3所示,系統(tǒng)適用性中雜質(zhì)A與雜質(zhì)G可達到完全分離,分離度為2.84,但雜質(zhì)E與雜質(zhì)D分離度無明顯改善,未達到基線分離,分離度為1.41。(2)降低有機相比例:以磷酸鹽緩沖液-乙腈(75∶25)為條件,其他色譜條件不變。此時系統(tǒng)適用性,雜質(zhì)A與雜質(zhì)G可達到完全分離,分離度為5.01,但丙胺卡因出峰時間可達到101.116 min,運行時間過長,此色譜條件不合適,如下圖4所

圖3 增加有機相比例系統(tǒng)適用性

圖4 降低有機相比例系統(tǒng)適用性

示。綜上所述雜質(zhì)A與雜質(zhì)G的分離很好實現(xiàn),可通過增加有機相比例。但雜質(zhì)E與雜質(zhì)D分離通過調(diào)整流動相比例對其影響不大?？紤]調(diào)整水相pH優(yōu)化色譜條件。

2.2.2 水相pH調(diào)整 在增加有機相比例的基礎(chǔ)上,分別調(diào)整水相的pH至7.0和9.0。水相比例調(diào)整至7.0和9.0時雜質(zhì)E與雜質(zhì)D的分離度均不改善,此外雜質(zhì)A與雜質(zhì)G無法分離。如下圖5和下圖6所示。通過調(diào)整pH發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)A與雜質(zhì)G在降低pH和升高pH情況下,均無法分離,且雜質(zhì)E與雜質(zhì)D分離狀況未得到改善,綜上所述,調(diào)整水相pH條件不合適?？紤]更換固定相,即更換色譜柱進行實驗。

圖5 水相7.0系統(tǒng)適用性

圖6 降低水相9.0系統(tǒng)適用性

2.2.3 更換色譜柱 通過更換不同品牌色譜柱,最終篩選到兩根色譜柱可實現(xiàn)系統(tǒng)適用性中主峰與各雜質(zhì)之間,及雜質(zhì)與雜質(zhì)間的分離。(1)色譜柱1:YMC-Pack ODS-AM C18(150×4.6 mm,5 μm);(2)色譜柱2:Waters Xbridge BEH C18(150×4.6 mm,5 μm)。色譜柱1 雜質(zhì)E與雜質(zhì)D分離度為2.19,但主峰出峰時間較晚。色譜柱2雜質(zhì)E與雜質(zhì)D分離度為2.17,主峰出峰時間較早。綜合考慮色譜柱2較適合丙胺卡因原料有關(guān)物質(zhì)的分析。詳見下圖7和圖8。

圖7 色譜柱1下系統(tǒng)適用性

圖8 色譜柱2下系統(tǒng)適用性

2.3 分析方法驗證根據(jù)方法開發(fā)結(jié)果最終確定丙胺卡因原料藥有關(guān)物質(zhì)分析檢測方法。具體方法如下。色譜條件:色譜柱,Waters Xbridge BEH C18(150×4.6 mm,5 μm);流動相,磷酸鹽緩沖液(0.18 g磷酸二氫鈉和2.89 g磷酸二氫鈉二水合物加100 mL水溶解)-乙腈(70∶30)為流動相;柱溫25 ℃;流速1.0 mL/min;檢測波長240 nm;進樣體積20 μL。

供試品溶液配制:取丙胺卡因原料適量,精密稱定,用流動相稀釋溶解成每1 mL約2.5 mg的溶液。系統(tǒng)適用性溶液:取丙胺卡因、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F、雜質(zhì)G對照品適量,精密稱定,用流動相稀釋溶解成每毫升約含丙胺卡因2.5 mg、雜質(zhì)A 2.5 μg、雜質(zhì)B 0.25 μg、雜質(zhì)C 2.5 μg、雜質(zhì)E 2.5 μg、雜質(zhì)F 2.5 μg與雜質(zhì)G 2.5 μg的溶液。對照品溶液:取雜質(zhì)B對照品適量,用流動相稀釋成每1 mL約0.25 μg的溶液。自身對照溶液:精密量取供試品溶液適量,用流動相稀釋成每1 mL約丙胺卡因2.5 μg的溶液?？山邮軜?biāo)準(zhǔn):系統(tǒng)適用性各成分分離度均大于1.5,主峰與雜質(zhì)E的分離度不得小于3.0。分析方法的專屬性、靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度均應(yīng)符合《中國藥典2020版四部通則》相關(guān)規(guī)定。

2.3.1 專屬性 取空白溶劑(流動相)、系統(tǒng)適用性溶液、供試品溶液照色譜條件注入色譜儀,記錄圖譜。結(jié)果顯示溶劑對供試品溶液有關(guān)物質(zhì)測定無干擾。系統(tǒng)適用性符合要求。

2.3.2 檢出限、定量限 取雜質(zhì)A～G對照品、丙胺卡因?qū)φ掌愤m量,精密稱定,置不同量瓶中,用流動相稀釋成每1 mL約上述對照品約1 mg的溶液,作為對照品儲備液。取對照品儲備液用流動相逐級稀釋,并注入色譜儀,取S/N約為10的濃度溶液,作為定量限,取S/N約為3的濃度溶液,作為檢出限。詳見下表1。結(jié)果顯示各雜質(zhì)及主成分分離度均在限度濃度的10%以下,方法靈敏度好。

表1 丙胺卡因有關(guān)物質(zhì)定量限、檢出限結(jié)果

2.3.3 線性與范圍 分別取雜質(zhì)A～G對照品、丙胺卡因?qū)φ掌愤m量,精密稱定,配制混合對照品儲備液,精密量取混合對照品儲備液適量,配制約相當(dāng)于定量限溶液的線性1、50%限度濃度溶液、80%限度濃度溶液、100%限度濃度溶液、120%限度濃度溶液、150%限度濃度溶液與200%限度濃度溶液,以濃度C(μg/mL)為橫坐標(biāo),以峰面積A為縱坐標(biāo),作線性回歸方程,查看各雜質(zhì)與丙胺卡因線性情況。詳見下表2。由表2可知雜質(zhì)A～G與丙胺卡因從定量限～200%限度范圍內(nèi)線性良好,線性相關(guān)系數(shù)r均大于0.998,雜質(zhì)B相對校正因子為0.48,其他成分相對校正因子均在0.9～1.1范圍內(nèi),所有成分截距占比均在25%以內(nèi)。雜質(zhì)B為基因毒性雜質(zhì)且相對校正因子小于0.8,按外標(biāo)法計算,其他雜質(zhì)及未知單雜按自身對照法計算。

表2 雜質(zhì)A～G和丙胺卡因的線性關(guān)系及相對校正因子情況

2.3.4 精密度 照驗證方法,配置對照品溶液、供試品溶液、對照溶液,其中供試品溶液與自身對照溶液平行配置6份,其中對照品溶液連續(xù)進樣5針,供試品溶液、自身對照各進1針,雜質(zhì)B按外標(biāo)法計算,其他單雜按自身對照計算。6份供試品溶液均只有雜質(zhì)B、雜質(zhì)G,其雜質(zhì)B結(jié)果平均分別為0.002 1,雜質(zhì)G的平均值為0.040,RSD分別為1.96%、1.89%。檢出結(jié)果的RSD均小于2.0%,方法精密度良好。

2.3.5 準(zhǔn)確度 照驗證方法,配置對照品溶液,配制對照溶液。取雜質(zhì)A、C～G對照品約10 mg,精密稱定,置10 mL量瓶中,用流動相稀釋溶解至刻度,搖勻得混合儲備液1。取雜質(zhì)B約10mg,精密稱定,置10 mL量瓶中,用流動相稀釋溶解至刻度,搖勻得雜質(zhì)B儲備液。精密量取1.0 mL混合儲備液1和0.1 mL雜質(zhì)B儲備液置100 mL量瓶中,用流動相稀釋至刻度,搖勻,得混合儲備液。80%回收率溶液(n=3):取丙胺卡因原料25 mg,精密稱定,置10 mL量瓶中,加2.0 mL混合儲備液1,用流動相吸收至刻度,搖勻即得。100%回收率溶液(n=3):取丙胺卡因原料25 mg,精密稱定,置10 mL量瓶中,加2.5 mL混合儲備液1,用流動相吸收至刻度,搖勻即得。120%回收率溶液(n=3):取丙胺卡因原料25 mg,精密稱定,置10 mL量瓶中,加3.0 mL混合儲備液1,用流動相吸收至刻度,搖勻即得。取空白、對照品溶液、自身對照、回收率溶液進樣測定。測得回收率,均符合《中國藥典2020版四部通則》規(guī)定。詳見下表3。

2.3.6 樣品結(jié)果測定 取本品以“2.1”項下供試品溶液配制方法配制溶液及采用“2.3”項下的色譜條件檢測,再以自身對照加校正因子檢測有關(guān)物質(zhì),檢測結(jié)果見“2.3.4”,檢出結(jié)果的RSD均小于2.0%。

表3 回收率測定結(jié)果匯總(%)

3 討論

3.1 流動相比例及pH的考察在分析方法開發(fā)階段,通過復(fù)核EP10.0標(biāo)準(zhǔn)條件發(fā)現(xiàn),雜質(zhì)F與雜質(zhì)A,雜質(zhì)E與雜質(zhì)D均無法基線分離。在原條件基礎(chǔ)上通過調(diào)整流動相比例和改變流動相pH發(fā)現(xiàn),調(diào)整流動相比例及pH對雜質(zhì)F與雜質(zhì)A的分離趨勢有明顯影響,對雜質(zhì)E與雜質(zhì)D無影響,通過比例和pH最終選擇水相-有機相(70∶30)對雜質(zhì)雜質(zhì)F與雜質(zhì)A的效果最好,故確定流動相中水相與有機相的比例為70∶30。

3.2 固定相的考察由于調(diào)整水相pH條件下雜質(zhì)A與雜質(zhì)G在降低pH和升高pH情況下,均無法分離,通過更換不同品牌的色譜柱進行實驗,最終通過查閱相關(guān)參考文獻,最終發(fā)現(xiàn)YMC-Pack ODS-AM C18(150×4.6 mm,5 μm)和Waters Xbridge BEH C18(150×4.6 mm,5 μm)對雜質(zhì)E與雜質(zhì)D這兩種同分異構(gòu)體化合物分離效果明顯。綜合分析效率考慮,最終選擇Waters Xbridge BEH C18(150×4.6 mm,5 μm)此根色譜柱。

3.3 分析方法驗證參考《中國藥典2020版四部通則》及《ICH指導(dǎo)原則Q2(R1)》對現(xiàn)有方法進行驗證。研究對分析方法關(guān)鍵項進行驗證,主要包括專屬性、靈敏度、線性范圍、重復(fù)性、回收率進行驗證。經(jīng)驗證后,相關(guān)指標(biāo)均符合方法學(xué)驗證中規(guī)定。與王慶等[10]研究結(jié)果類似,表明本方法具有專屬性強、靈敏度高、精密度好等優(yōu)點,可將該方法逐步用于實際工作中。

3.4 研究不足之處研究未對雜質(zhì)來源未進行更深一步研究,未通過酸、堿、氧化及光照破壞實驗,進一步證實雜質(zhì)是否為降解產(chǎn)生。未進行破壞實驗考察分析方法的專屬性。未對中間精密度、重現(xiàn)性進行驗證。未對供試品溶液及對照品溶液穩(wěn)定性考察。后續(xù)實驗將對專屬性、精密度、溶液穩(wěn)定性進一步驗證。此外,方法優(yōu)化中對水相pH調(diào)整、流動相比例調(diào)整只選擇兩個水平,后續(xù)會繼續(xù)再增加3個水平進行研究。

綜上所述,由于丙胺卡因原料藥的檢測方法在中國藥典中并未收錄,本次硏究參考歐洲藥典中的方法重新開發(fā)并驗證了HPLC法檢測丙胺卡因有關(guān)物質(zhì)的分析方法,目的在于尋找一種更加科學(xué)且準(zhǔn)確的檢測方法,便于日常的檢驗或科研工作順利進行。方法學(xué)驗證表明,方法的專屬性強、靈敏度高、準(zhǔn)確度高、精密度好,可滿足丙胺卡因原料藥有關(guān)物質(zhì)檢測需求。相對于藥典及文獻收集的方法,本次研究的分析方法具有分析時間短,通用性高,可用于丙胺卡因原料的合成工藝中已知單雜的控制。