賈斌鑫,楊世英,王 艷,楊朋朋,何偉忠,王 成,劉峰娟,范盈盈

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院,烏魯木齊 830052;2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(烏魯木齊)/新疆農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,烏魯木齊 830091;3.伊犁師范大學(xué)生物與地理科學(xué)學(xué)院,新疆伊寧 835000)

0 引 言

【研究意義】隨優(yōu)質(zhì)的甜瓜種類逐漸豐富,更多注重甜瓜核心品質(zhì)的探索[1],糖分含量是評(píng)價(jià)葫蘆科作物果實(shí)品質(zhì)一項(xiàng)重要指標(biāo)[2],甜瓜中的糖分主要是果糖、葡萄糖、蔗糖,其中果糖的甜度最高,葡萄糖的口感最好。甜瓜的甜度、風(fēng)味由這3種糖決定,并且甜瓜中的維生素、芳香物質(zhì)和色素等的基礎(chǔ)原料也都來(lái)源于該3種糖[3]。在甜瓜中的含量和所占比例有一定的差異,糖分積累是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程。【前人研究進(jìn)展】研究表明[4],在果實(shí)的糖分積累過(guò)程中最終以蔗糖的形式積累,參與該過(guò)程的關(guān)鍵酶為蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase,SPS)、轉(zhuǎn)化酶(invertase,Ivr)和蔗糖合成酶(sucrose synthase,SS[5]),其中轉(zhuǎn)化酶包括酸性轉(zhuǎn)化酶(acid invertase,AI)和中性轉(zhuǎn)化酶(neutral invertase,NI),蔗糖合成酶分為分解方向(SS-c)和合成方向(SS-s),以分解為主。SPS是蔗糖積累的關(guān)鍵限速酶[6],在果實(shí)發(fā)育期,SPS的活性隨著甜瓜的成熟而逐漸升高,SS-s活性則隨著甜瓜的成熟而減低,SS-c與蔗糖積累相關(guān)性并不顯著,而2個(gè)轉(zhuǎn)化酶在甜瓜發(fā)育前期活性很高,在成熟甜瓜中的活性極低[7-9]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】糖組分含量是決定甜瓜的風(fēng)味品質(zhì)的重要因素之一。甜瓜中的可溶性糖主要是果糖,葡萄糖和蔗糖,果糖是甜瓜甜度的直觀表示。目前有關(guān)新疆甜瓜可溶性糖與糖代謝酶的相關(guān)性分析的研究鮮有報(bào)道。需研究不同品種甜瓜糖組分及其相關(guān)代謝酶活性差異。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】選用新疆地方特色的9種不同風(fēng)味的厚皮甜瓜甘甜蜜寶、西州蜜1號(hào)、早醉仙、納斯密、黃夢(mèng)脆、白皮脆、西州蜜25號(hào)、俊秀和20-123,測(cè)定糖組分和糖代謝相關(guān)酶,比較9種甜瓜糖分的含量以及相關(guān)代謝酶的活性差異,分析糖組分與酶活性相關(guān)性,分析不同甜瓜糖組分含量以及糖代謝酶活性的差異,為新疆不同品種甜瓜育種和甜瓜產(chǎn)業(yè)推廣提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 甜 瓜

選擇9種不同品種甜瓜:甘甜蜜寶、西州蜜1號(hào)、早醉仙、納斯密、黃夢(mèng)脆、白皮脆、西州蜜25號(hào)、俊秀和20-123均采自新疆吐魯番,甜瓜為大棚種植,統(tǒng)一管理,成熟后,隨機(jī)挑選成熟度適中,無(wú)病蟲(chóng)害的各品種甜瓜,并于24 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,運(yùn)回后,立即取樣、液氮冷凍后,-80℃冰箱保存。

1.1.2 試劑與儀器

牛血清蛋白質(zhì)、曲拉通X-100(TritonX-100)、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、間苯二酚、乙二醇、還原型輔酶Ι二鈉(NADH-Na2)、脲苷二磷酸(UDP)、果糖、嗎啉乙磺酸(MES)、6-磷酸果糖、脲苷二磷酸葡萄糖(UDP-Glucose)、羥乙基哌嗪乙硫磺酸(Hepes)等試劑(北京索萊寶科技有限公司);3,5-二硝基水楊酸(DNS)(上海源葉生物科技有限公司);鹽酸、氯化鎂、氟化鈉(西安化學(xué)試劑廠);乙腈(賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司);乙二胺四乙酸(EDTA)(天津市福晨化學(xué)試劑廠);十二水合磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)(西隴化工股份有限公司);磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)。

1.1.3 儀 器

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) UV-2700(日本島津公司);電熱恒溫水浴鍋(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);Biofugerstratos全能型高性能臺(tái)式冷凍離心機(jī)(德國(guó)賀利氏公司);高效液相色譜儀(美國(guó)沃特斯);折光儀(上海光學(xué)儀器)。

1.2 方 法

1.2.1 可溶性固形物測(cè)定

采用折光儀測(cè)定可溶性固形物,先取蒸餾水滴在玻璃面上進(jìn)行調(diào)零校正,隨后擦拭干凈后,在瓜不同位置進(jìn)行取2滴果肉汁,每種瓜平行測(cè)量3個(gè),每個(gè)瓜讀取5個(gè)值。

1.2.2 不同甜瓜糖組分提取與測(cè)定

甜瓜中糖組分提取與測(cè)定參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《GB 5009.8-2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測(cè)定》,取混合瓜樣10 g于刻度離心管中,用蒸餾水定容到30 mL,勻漿后,45℃水浴1 h,過(guò)0.22 μm濾膜后得到的濾液用來(lái)測(cè)定糖組分的濾液。

高效液相色譜條件為流動(dòng)相為乙腈∶純水=78∶22,色譜柱為Nucleodur100-5 NH2-RP(250 mm×4.6 mm),流速為1 mL/min,進(jìn)樣量為2 μL。

1.2.3 糖代謝酶提取與測(cè)定

蔗糖磷酸合成酶(SPS)和蔗糖合成酶(SS)的提取測(cè)定方法參考任雷[10]、高俊鳳[11];酸性轉(zhuǎn)化酶(AI)和中性轉(zhuǎn)化酶(NI)的提取和測(cè)定方法參考趙智中等[12]。

SPS和SS提取:稱取5 g甜瓜果肉,置于預(yù)冷的研缽中,分批加入5 mL提取緩沖液冰浴研磨提取,2℃下10 000 g離心20 min,取上清液3 mL裝入透析袋,置于透析緩沖液中4℃透析過(guò)夜,其間更換透析液3次,透析后酶液定容至5 mL用于酶活性分析。

AI和NI的提取:稱取5 g甜瓜果肉,置于含液氮的研缽中研磨3～5 min,加5 mL轉(zhuǎn)化酶提取緩沖液再勻漿3～5 min,14 000 r/min離心15 min。取上清液,逐漸加(NH4)2SO4至80%飽合度。在4℃冰箱內(nèi)放置30 min后,14 000 r/min離心30 min,去除上清液,加4 mL脫鹽緩沖液溶解沉淀。沉淀溶解后,放入透析袋,置于稀釋10倍的脫鹽緩沖液中透析24 h(中間多次換透析液),透析后得的酶液用于酶活性分析。表1

表1 糖代謝相關(guān)酶提取體系

SPS活性測(cè)定:向0.4 mL的Tris-MES反應(yīng)體系中加入0.1 mL UDPG和0.05 mL透析后酶液,補(bǔ)蒸餾水至1 mL,之后放到水浴鍋中,保持30 ℃水溫,反應(yīng)10 min后,沸水浴4 min中止反應(yīng),對(duì)照將UDPG換做蒸餾水替代,其他試劑一樣。加入0.1 mL 2 mol/L NaOH溶液,沸水浴10 min后冷卻至室溫。加3.5 mL 30%的HCl和1 mL 0.1%的間苯二酚溶液,震蕩搖勻后放入80℃的水浴鍋中保溫10 min,冷卻后在480 nm處比色測(cè)定蔗糖生成量。每個(gè)樣品重復(fù)3次。用滅火的酶液作對(duì)照。酶活性單位為μmol/(h·g)。

SS合成方向測(cè)定同SPS,只將磷酸-6-果糖換成果糖。

SS分解方向:測(cè)定體系加入溶液,30℃反應(yīng)1 h,加入49.0 μL DNS試劑終止反應(yīng),沸水浴5 min,冷卻后測(cè)定A540值。每個(gè)樣品重復(fù)3次。用滅活的酶液作對(duì)照。酶活性單位為μmol/(h·g)。

轉(zhuǎn)化酶AI和NI活性測(cè)定:總反應(yīng)體系為1.6 mL,37℃溫水浴1 h,加入1.1 mL DNS試劑終止反應(yīng),沸水浴15 min,冷卻后用分光光度計(jì)測(cè)定A540值。每個(gè)樣品重復(fù)3次。用殺死的酶液作對(duì)照。酶活性單位為μmol/(h·g)。

中性轉(zhuǎn)化酶的活性測(cè)定與酸性轉(zhuǎn)化酶類似,只是緩沖液換為磷酸緩沖液(pH 7.5)。表2

表2 糖代謝相關(guān)酶測(cè)定體系

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用 Excel2019 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),指標(biāo)的均值間比較均用SPSS19.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析,P<0.05為顯著差異,P<0.01為極顯著差異。所有的指標(biāo)測(cè)定均有3次重復(fù),結(jié)果用測(cè)定指標(biāo)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示,使用Oringin軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜瓜中的可溶性固形物含量變化

研究表明,可溶性固形物在9種甜瓜中差異顯著(P<0.05),其中納斯密的可溶固形物含量最大,為16.8%,其次為早醉仙、20-123,其可溶性固形物為16.1%和15%,其余甜瓜的可溶固形物均低于15%,白皮脆和甘甜蜜寶的含量最少,分別為11.2%和12.2%。圖1

圖1 不同甜瓜品種可溶性固形物含量變化

2.2 甜瓜中糖組分含量變化

研究表明,在9種甜瓜中,果糖、葡萄糖和蔗糖含量差異顯著,果糖含量最高的黃夢(mèng)脆與含量最低的西州蜜1號(hào)差值為1.1 g/100g,葡萄糖在9種甜瓜中含量與果糖含量相比明顯較低,普遍在0.9～2.2 g/100g,其中葡萄糖含量最高的為俊秀,含量為2.2 g/100g,含量最低的是西州蜜1號(hào),含量為0.92 g/100g。在9種甜瓜中蔗糖含量差異較大,早醉仙的蔗糖含量最高為5.74 g/100g,最低的甘甜蜜寶含量?jī)H為0.76 g/100g,二者相差近8倍。早醉仙的可溶性糖含量最高,西州蜜25號(hào)次之,甘甜蜜寶的含量最少,蔗糖在其中的貢獻(xiàn)最大。圖2,表3

圖2 不同甜瓜品種可溶性糖含量變化

表3 不同甜瓜品種中可溶性糖差異

2.3 甜瓜糖代謝相關(guān)酶活性

2.3.1 甜瓜蔗糖磷酸合酶(SPS)活性差異

研究表明,甘甜蜜寶和西州蜜1號(hào)的SPS活性與其他的7種甜瓜差異顯著(P<0.05),其中甘甜蜜寶SPS的活性最高,蔗糖活性為8.7 μmol/(h·g),黃夢(mèng)脆的蔗糖活性最低為4.7 μmol/(h·g)。甘甜蜜寶的蔗糖含量為9種甜瓜中最少的,對(duì)于甘甜蜜寶SPS活性與蔗糖含量具有一定的相關(guān)性,但是對(duì)于其他不同品種甜瓜,SPS的作用存在著差異。圖3

圖3 不同甜瓜品種蔗糖磷酸合酶(SPS)活性變化

2.3.2 甜瓜轉(zhuǎn)化酶(Ivr)的活性差異

研究表明,不同甜瓜中AI和NI酶的活性差異顯著(P<0.05),其中20-123在AI和NI的活性分別為40.1和13.1 μmol/(h·g),為9種甜瓜中最高,而白皮脆的AI和NI活性最低,分別為0.3和0.2 μmol/(h·g),兩者的AI相差了近133倍,NI相差了近65倍。圖4

圖4 不同甜瓜品種轉(zhuǎn)化酶(Ivr)活性

2.3.3 甜瓜蔗糖合酶(SS)活性差異

研究表明,9種甜瓜中SS(合成)活性最高的是甘甜蜜寶,活性為7.5 μmol/(h·g),其次為白皮脆和黃夢(mèng)脆,其活性分別為6.7和6.5 μmol/(h·g),活性最低的是20-123,為5.1 μmol/(h·g);SS(分解)方向酶活性最高的西州蜜25號(hào),活性為3.9 μmol/(h·g),其次為20-123和納斯蜜,含量分別為2.6和2.3 μmol/(h·g),含量最低的為早醉仙,活性為0.7 μmol/(h·g),9種甜瓜的SS活性差異顯著(P<0.05)。圖5

圖5 不同甜瓜品種中蔗糖合酶(SS)活性

2.4 不同甜瓜品種蔗糖與糖代謝酶相關(guān)性

研究表明,9種甜瓜的蔗糖含量與糖代謝相關(guān)酶活有著一定的相關(guān)性,甘甜蜜寶的的蔗糖含量與NI、SPS和SS合成方向的酶活性呈正相關(guān),與NI呈顯著正相關(guān)(P<0.01),與AI和SS分解方向呈負(fù)相關(guān),但并不顯著;西州蜜1號(hào)的蔗糖含量與NI、SPS和SS合成方向呈正相關(guān),與AI和SS分解方向呈負(fù)相關(guān),都不顯著;早醉仙和納斯密的蔗糖含量只與AI的活性呈正相關(guān),與NI、SPS、SS合成方向和分解方向的活性都為負(fù)相關(guān);黃夢(mèng)脆與AI、SPS、SS合成方向和分解方向的活性呈正相關(guān),與NI呈負(fù)相關(guān);白皮脆與AI、NI、SS合成方向和分解方向的活性呈正相關(guān),與SPS的活性則呈負(fù)相關(guān);西州蜜25號(hào)與NI、SS合成方向和分解方向的酶活呈正相關(guān),其中與SS合成方向呈顯著相關(guān)(P<0.05);俊秀與NI和SS合成方向的酶呈正相關(guān),與SS合成方向呈顯著正相關(guān),與AI、SPS和SS分解方向呈負(fù)相關(guān),與AI和SS分解方向呈顯著負(fù)相關(guān);20-123只與SS分解方向呈正相關(guān),與其他蔗糖代謝酶均呈負(fù)相關(guān),和SS合成方向呈顯著負(fù)相關(guān)。表4

表4 蔗糖與糖代謝酶相關(guān)性

2.5 不同甜瓜果糖與糖代謝酶相關(guān)性

研究表明,甘甜蜜寶與5種糖代謝酶均呈正相關(guān),與SPS顯著正相關(guān)(P<0.05);西州蜜1號(hào)與AI、NI、SPS和SS分解反向呈正相關(guān),與SS分解方向呈顯著正相關(guān)(P<0.05),與SS合成方向酶呈負(fù)相關(guān);早醉仙與SS分解方向呈正相關(guān),與AI、NI、SPS和SS合成方向均呈負(fù)相關(guān);納斯密與AI、SPS、SS分解方向和SS合成方向酶活性呈正相關(guān),其中與SPS呈顯著正相關(guān),與NI呈負(fù)相關(guān);黃夢(mèng)脆與2個(gè)轉(zhuǎn)化酶均呈正相關(guān),與SPS、SS分解方向和SS合成方向呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,均不顯著;白皮脆和西州蜜25號(hào)2個(gè)甜瓜與AI、NI、SS分解方向SS合成方向呈正相關(guān)關(guān)系,與SPS活性呈負(fù)相關(guān);俊秀與NI、SPS和SS分解方向活性呈正相關(guān),與AI和SS合成方向呈負(fù)相關(guān);20-123只與SS分解方向活性呈正相關(guān),與AI、NI、SPS和SS合成方向活性呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,其中與SS合成方向呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。表5

表5 果糖與糖代謝酶相關(guān)性

2.6 不同甜瓜葡萄糖與糖代謝相關(guān)酶相關(guān)性

研究表明,甘甜蜜寶和AI、SPS和SS分解方向呈正相關(guān),與NI和SS合成方向呈負(fù)向相關(guān);西州蜜1號(hào)與AI、NI、SPS和SS分解方向呈正相關(guān),與SS合成方向呈顯著負(fù)相關(guān);早醉仙只與SS分解方向呈正相關(guān),與其余四種酶活性均呈負(fù)相關(guān);納斯密與AI、SPS、SS分解方向和SS合成方向均呈正相關(guān),只與NI呈負(fù)相關(guān)關(guān)系;黃夢(mèng)脆只與NI呈顯著正相關(guān),與AI、SPS、SS分解方向和SS合成方向的酶活性呈負(fù)相關(guān);白皮脆和西州密25號(hào)與兩種轉(zhuǎn)化酶、SPS和SS分解方向酶活性均呈正相關(guān),只與SS合成方向呈負(fù)相關(guān);俊秀與NI、SPS和SS呈正相關(guān),與AI和SS合成呈負(fù)相關(guān)關(guān)系;20-123與AI、NI和SS合成方向呈正相關(guān),其中與AI呈顯著正相關(guān),與SPS、SS分解呈負(fù)相關(guān)。表6

表6 葡萄糖與糖代謝酶相關(guān)性

3 討 論

可溶性固形物是一種綜合參數(shù),主要包括糖、酸、纖維素、礦物質(zhì)等成分[13]。邵旭鵬等[14]在對(duì)8種甜瓜的營(yíng)養(yǎng)測(cè)定中,納斯密中的可溶性固形物含量為18.2%與研究結(jié)果相差無(wú)異。在可溶性糖含量測(cè)定中,9種甜瓜的果糖、葡萄糖和蔗糖的含量差異顯著,特別是蔗糖的含量,含量最高的早醉仙與含量最低的甘甜蜜寶相差了近8倍。

糖代謝相關(guān)酶中,SPS和SS-s的活性與甜瓜的蔗糖積累密切相關(guān)[7,8,15,16],SPS和SS-s的活性會(huì)隨著甜瓜的成熟而升高,在甜瓜成熟時(shí)活性達(dá)到最高,呈正相關(guān)關(guān)系,是引起蔗糖積累水平的主要原因;研究的9種甜瓜中甘甜蜜寶SPS和SS-s的活性都很高,而在可溶性糖測(cè)定中,甘甜蜜寶的蔗糖含量并不高,可見(jiàn)SPS和SS-s在成熟的甘甜蜜寶中的作用并不顯著。早醉仙的SPS的活性較低,而且在成熟的早醉仙中,其蔗糖含量只與AI呈正相關(guān),其余均為負(fù)相關(guān),但其蔗糖的含量是最高的,與之前的研究結(jié)果也有不同。SPS以尿苷二磷酸葡萄糖為供體[17,18],以 6-磷酸果糖為受體,催化合成6-磷酸蔗糖,6-磷酸蔗糖在蔗糖磷酸化酶(sucrose phosphate phosphatase, SPP)的作用下脫磷酸并水解形成蔗糖和磷酸根離子,甘甜蜜寶蔗糖含量低而SPS活性高的原因可能有兩種:(1)在甜瓜發(fā)育成熟過(guò)程中,供體和受體逐漸減少,高活性的SPS無(wú)法催化有限的供體和受體合成大量的6-磷酸蔗糖,以至于在成熟的甜瓜中蔗糖的積累達(dá)到了飽和,導(dǎo)致了蔗糖含量少但SPS活性高;(2)在甜瓜成熟過(guò)程中,催化6-磷酸蔗糖水解的SPP活性不斷降低,只產(chǎn)生較少的蔗糖。劉凌霄等[19]表明,蔗糖積累能力不同的甜瓜(基因型不同)SPS的活性各不相同,不同積累型的甜瓜無(wú)論在春季還是秋季,在花后5～25 d內(nèi),SPS活性一直處在低水平,沒(méi)有或幾乎沒(méi)有蔗糖積累,只有到了花后30 d,SPS的活性升高,甜瓜才有了蔗糖積累[20],而早醉仙在發(fā)育前期已經(jīng)積累了大量的供體與受體,在花后30 d后,SPS活性逐漸升高,迅速催化合成了大量的6-磷酸蔗糖,在SPP的催化下蔗糖大量積累,造成了早醉仙蔗糖含量高,但SPS活性不突出的結(jié)果。Ivr和SS-c在甜瓜發(fā)育初期活性很高[21-23],會(huì)隨著果實(shí)的發(fā)育而逐漸降低活性,在成熟的甜瓜果實(shí)中幾乎檢測(cè)不到其活性,而研究中西州蜜25號(hào)、俊秀和20-123轉(zhuǎn)化酶的活性仍然處于較高的活性,其他甜瓜的轉(zhuǎn)化酶的活性與其他研究文獻(xiàn)[4,8,10,23]的結(jié)果接近。

4 結(jié) 論

不同品種的成熟甜瓜果糖、葡萄糖和蔗糖含量存在顯著差異,特別是蔗糖的含量,黃夢(mèng)脆的果糖含量最高,俊秀的葡萄糖含量最高,早醉仙的蔗糖含量最高;在糖代謝酶中,俊秀的AI和NI活性最高,甘甜蜜寶的SS-s活性最高,西州蜜25號(hào)的SS-c活性最高,甘甜蜜寶的蔗糖含量最低但SPS活性最高,早醉仙的蔗糖含量最高、但SPS的活性不突出。