付 強(qiáng),王 琴,徐彩芹,牛俊麗,牛建新,王建友

(1.石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院,新疆石河子 832003;2.新疆林業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)林研究所,烏魯木齊 830063;3.新疆林業(yè)科學(xué)院,烏魯木齊 830063)

0 引 言

【研究意義】美國黑核桃(Juglansnigra)屬核桃科(Juglandaceae)核桃屬(JuglansL.)黑核桃種,原產(chǎn)北美洲。目前已栽培的樹種包括北加州黑核桃、魁核桃、小果黑核桃及奇異核桃等,在我國新疆、河南、山東、吉林、陜西等地均有種植[1],黑核桃果實(shí)營養(yǎng)豐富、風(fēng)味濃厚,木材結(jié)構(gòu)細(xì)膩、加工性能優(yōu)良,抗逆能力強(qiáng)[2]。核桃的繁殖方式主要為實(shí)生、嫁接以及扦插,黑核桃主要采用實(shí)生繁殖,秋播萌發(fā)率可達(dá)90%,但常規(guī)方法繁殖黑核桃,繁殖速度慢,種苗昂貴,用種量大,且易發(fā)生遺傳變異,不能保持品種優(yōu)良性狀,影響黑核桃的推廣進(jìn)程[3]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】Ricardo等[4]為改進(jìn)核桃微繁殖現(xiàn)有方法,基因型是影響核桃微繁殖整體成功的主要因素,FeEDDHA和PG組合使用可顯著提高馴化過程中試管苗生根率和植株存活率;Stevens[5]記錄了meta-topolin (MT)對所有核桃品種(尤其是黑核桃)的培養(yǎng)和苗伸長的益處;Tuan等[6]從胚軸開始誘導(dǎo),成功進(jìn)行離體生根,固體培養(yǎng)基的芽增值效果優(yōu)于液體培養(yǎng)基;Kourosh等[7]以山核桃莖段為外植體,經(jīng)過低溫處理,成功誘導(dǎo)生根并獲得完整植株。劉淑蘭等[8]最早開始核桃組培的研究,以葉柄、莖尖等作為外植體誘導(dǎo)出了愈傷組織;袁巧平等[9]以成年樹的嫩梢為外植體,誘導(dǎo)形成不定芽,經(jīng)過生根處理獲得了完整植株;湯浩茹等[10]以幼胚和子葉成功誘導(dǎo)了體細(xì)胞胚并萌發(fā)成苗;王清民等[11]以成年樹幼嫩莖段為外植體,用兩步誘導(dǎo)生根法分析核桃試管苗扦插生根。Tarinejad等[12]以黑核桃為材料,在培養(yǎng)基中添加抗生素,混合添加12.5 mg/L慶大霉素和100 mg/L萬古霉素可以有效控制污染。宋鋒惠等[13]以黑核桃的莖段為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)莖段內(nèi)含菌較多,污染率高、易發(fā)生氧化褐變,縮短轉(zhuǎn)瓶周期可減輕褐變現(xiàn)象,獲得無菌外植體是黑核桃組培成敗的關(guān)鍵?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前,對于黑核桃種的組織培養(yǎng)研究較少,需研究黑核桃組培中,不同消毒時長和抗褐化劑配比對污染和褐化的影響?！緮M解決的關(guān)鍵問題】篩選出消毒的最佳時長和最適抗褐化劑濃度,研究外植體褐化過程中細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化,為建立穩(wěn)定高效的黑核桃植株再生體系和核桃快速繁殖及工廠化育苗提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

材料于2021年4～5月采集自新疆林業(yè)科學(xué)院珍稀樹木園,以10～15 a黑核桃當(dāng)年萌發(fā)的葉片和帶腋芽或頂芽的幼嫩莖段為外植體。

基本培養(yǎng)基為DKW培養(yǎng)基,培養(yǎng)室內(nèi)溫度為(25±2)℃,光照強(qiáng)度1 800 lx,光照時間∶暗時間=14 h∶10 h,pH值5.8～6.2。

1.2 方 法

1.2.1 外植體消毒

葉片在流水中反復(fù)沖洗,在超凈工作臺上用70%酒精消毒10s后,無菌蒸餾水沖洗2次。用0.1%HgCl2分別消毒4、5、6、7 min(A1、A2、A3、A4),將葉片切成1 cm×1 cm的大小,葉面向上接種在DKW+30 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂培養(yǎng)基中。

莖段在流水中沖洗4～6 h,軟毛刷輕刷整個枝條,刷洗掉表面灰塵。將其剪成1.5～2 cm的帶1～2個腋芽的莖段,在超凈工作臺上用70%酒精消毒30 s后,無菌蒸餾水沖洗2次,以0.1%HgCl2加少量吐溫80為消毒劑,共設(shè)置6個處理,其中單次消毒時間分別8、10、12 min(B1、B2、B3),二次消毒時間分別4、5、6 min(B4、B5、B6)。接種在DKW+30 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂培養(yǎng)基中。每個處理設(shè)3個重復(fù),3周后統(tǒng)計(jì)污染率、褐化率。

污染率(%)=(污染的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù))×100%;

褐化率(%)=(褐化的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù))×100%;

萌發(fā)率(%)=( 萌發(fā)的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)) ×100 %。

1.2.2 抗褐化劑不同濃度配比對褐化率影響

以AC、PVP、VC 3種抗褐化劑,按照L9(34)正交表進(jìn)行3因素3水平試驗(yàn)處理(C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9)。每個處理設(shè)3個重復(fù),3周后統(tǒng)計(jì)褐化率、萌發(fā)率。表1

1.2.3 褐化外植體細(xì)胞切片觀察

分別取新鮮外植體和接種后5、10、15、25、30、40 d的外植體,制作徒手切片,顯微鏡下觀察其在組織培養(yǎng)過程中細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 統(tǒng)計(jì)處理數(shù)據(jù),利用SPSS 21.0 對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒時間對污染的影響

研究表明,隨著消毒時間的增加,污染率下降,褐化率上升。0.1%HgCl2消毒4 min時,污染率最高,與7 min時相較污染率高14.11%;消毒7 min褐化率最高,比4 min時高23.95%。消毒5 min和6 min的污染率無顯著差異,由于在HgCl2中消毒時間較長,6 min時的褐化率比5 min高11%。葉片表面消毒處理2效果最好,即0.1%HgCl2中消毒5 min。表2

表2 不同消毒時間下葉片污染率和褐化率變化

不同消毒時長對莖段的污染率及褐化率影響顯著。隨著消毒時間的增加,污染率下降,褐化率急劇上升,消毒12 min時污染率最低為14.29%,褐化率最高可達(dá)57.14%。HgCl2對植物有一定的毒害作用,長時間浸泡在HgCl2中消毒會引起外植體褐化死亡,不同的消毒方式對消毒結(jié)果差異顯著,處理3和處理6相比,二次消毒可使褐化率下降30.47%。莖段表面消毒以處理5效果最好,即用二次消毒法0.1%HgCl2+吐溫80消毒5 min。圖1,表3

注：A.接種5 d后的外植體;B.腋芽萌動的外植體;C.腋芽萌發(fā)的外植體;D.褐化死亡的外植體

表3 不同消毒時間下莖段污染率和褐化率變化

2.2 不同抗褐化劑對褐化率和萌發(fā)率的影響

研究表明,不同抗褐化劑配比對外植體的褐化率和萌發(fā)率影響顯著。9個處理中褐化率最高的為處理4,56.67%的外植體發(fā)生了褐化。萌發(fā)率最高的抗褐化劑為AC 1 g/L、PVP 70 mg/L、VC 50 mg/L。添加AC 2 g/L、PVP 110 mg/L、VC 100 mg/L的褐化率和萌發(fā)率都最低,褐化率比處理4降低了35%,萌發(fā)率比處理1降低了18.33%。添加了高濃度AC的處理,腋芽的萌發(fā)率較低,最低僅有26.67%,且萌發(fā)時間較晚,生長較慢。表4

表4 抗褐化劑不同濃度配比下褐化率和萌發(fā)率變化

褐化率KAC1RVC>RPVP,3種抗褐化劑對褐化率的影響主次順序是AC>VC>PVP,即AC對褐化率影響最大,其次VC,PVP影響較小,AC 1 g/L、PVP 110 mg/L、VC 100 mg/L為抑制褐化的最優(yōu)水平組合,黑核桃莖段抑制褐化的最佳抗褐化劑濃度為AC 1 g/L、PVP 110 mg/L、VC 100 mg/L。

萌發(fā)率KAC1RPVP>RVC,3種抗褐化劑對萌發(fā)率的影響主次順序是AC>PVP>VC,即AC對萌發(fā)率的影響最大,其次是PVP,VC影響較小,AC 1 g/L、PVP90 mg/L、VC 50 mg/L為萌發(fā)的最優(yōu)水平組合,黑核桃莖段萌發(fā)率最佳的抗褐化劑配比為AC 1 g/L、PVP 90 mg/L、VC 50 mg/L。

抗褐化劑最優(yōu)的水平組合為AC 1 g/L、PVP 110 mg/L、VC 100 mg/L。表5

表5 極差分析

2.3 外植體細(xì)胞切片的觀察

研究表明,不同褐化時期的帶芽莖段細(xì)胞結(jié)構(gòu)差異較大。0 d為未出現(xiàn)褐化的健康外植體,細(xì)胞顏色淡綠,質(zhì)地通透,邊緣較為圓潤。5 d時的外植體開始出現(xiàn)褐化,變?yōu)辄S綠色,細(xì)胞比健康外植體較小,細(xì)胞中開始有褐色物質(zhì)出現(xiàn)。10 d時的外植體切片與5 d時的切片無明顯差異,細(xì)胞變?yōu)榈S色,細(xì)胞中的褐色物質(zhì)出現(xiàn)更多。15 d時褐化現(xiàn)象明顯,細(xì)胞切片中的褐色物質(zhì)出現(xiàn)更多,褐色物質(zhì)集中地方的細(xì)胞破裂,胞液外流,細(xì)胞邊界模糊。25 d時褐化現(xiàn)象嚴(yán)重,細(xì)胞中的褐色物質(zhì)增多,開始向其他細(xì)胞間隙擴(kuò)散,細(xì)胞逐漸失去活性。30 d時切片完全變?yōu)楹稚?褐色物質(zhì)已經(jīng)充滿細(xì)胞間。40 d時切片顏色變?yōu)楹谏?外植體已完全褐化死亡。圖2

圖2 褐化外植體細(xì)胞切片

3 討 論

組織培養(yǎng)中通常會以幼嫩組織作為外植體[14],獲得無菌外植體是建立離體快繁體系的基礎(chǔ)。李穎等[15]在培養(yǎng)基中添加多菌靈和青霉素來控制污染,發(fā)現(xiàn)多菌靈能夠有效消滅真菌,青霉素在初代培養(yǎng)時能抑制細(xì)菌作用。鄭小琴等[16]研究發(fā)現(xiàn)隨著滅菌時間延長,污染率遞減,但褐化率上升。試驗(yàn)中以0.1%HgCl2為消毒劑,設(shè)計(jì)了不同時間梯度,葉片0.1%HgCl2消毒5 min效果最好,莖段采用二步消毒法,0.1%HgCl2加吐溫80消毒5 min效果最好。當(dāng)葉片消毒6 min時,污染率無顯著變化,褐化率卻顯著增加,隨著消毒時間的增加,污染率下降,與鄭小琴等[16]研究結(jié)果相同。外植體傷口處長時間接觸HgCl2,細(xì)胞被破壞,酚類物質(zhì)增多,褐化率增加。不同外植體采用的消毒劑種類及消毒時長受外植體的類型、大小等因素影響[17]。消毒時間過短會,消毒不徹底;消毒時間過長,又損傷外植體,增加褐化率,造成植體死亡。

褐化是核桃屬的植物較難進(jìn)行組織培養(yǎng)的重要原因,核桃屬植物的酚類物質(zhì)含量較多,外植體易發(fā)生褐化[18-19]。組織培養(yǎng)中褐化主要受外植體的類型、生理狀況、植物種類、基因型等因素的影響[20]。多酚氧化酶與酚類物質(zhì)作用產(chǎn)生褐化現(xiàn)象[21],在梨[22]、葡萄[23]等多種植物中都已得到證明。王娟等[24]發(fā)現(xiàn)酚類物質(zhì)氧化過程中,許多酶的活性是受光誘導(dǎo)的,前期暗培養(yǎng)對防止褐化有較好的效果;章鐵等[25]發(fā)現(xiàn)縮短轉(zhuǎn)瓶周期可減少莖段傷口附近的酚類物質(zhì)。J.I.Mir等[26]研究多個核桃品種,發(fā)現(xiàn)VC濃度為350 mg/L時的抗褐化效果最好,CA為350 mg/L的條件下不定芽數(shù)量最多。生產(chǎn)中多在培養(yǎng)基添加吸附劑和抗氧化劑來減少褐化,常用的抗褐化劑包括AC、PVP、VC、Na2S2O3、AgNO3等[27]。試驗(yàn)結(jié)果顯示,抗褐化劑的最適濃度為AC 1 g/L、PVP 110 mg/L、VC 100 mg/L,由于試驗(yàn)樹種不同,VC的最適濃度比J.I. Mir等[26]的試驗(yàn)結(jié)果較低。觀察褐化外植體的切片,發(fā)現(xiàn)隨著褐化程度的加深,細(xì)胞中出現(xiàn)大量褐色物質(zhì)。關(guān)于控制污染及褐化,獲得無菌外植體的試驗(yàn),有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

以黑核桃葉片為外植體時,70%酒精消毒10s后,0.1%HgCl2消毒5 min效果最好。以莖段為外植體時,70%酒精消毒30s后,以二次消毒法,0.1%HgCl2加吐溫80消毒5 min,效果最好。當(dāng)AC、PVP、VC組合使用時,AC 1 g/L、PVP 110 mg/L、VC 100 mg/L的抑制褐化效果最好。隨著褐化程度加深,細(xì)胞中有大量褐色物質(zhì)積累并逐漸破裂、失活、死亡。