丁香油對黃姑魚幼魚麻醉效果的研究

王曉龍,李 莉,菅玉霞,高鳳祥,王 雪,郭 文,胡發(fā)文,4*

(1.山東省海洋科學(xué)研究院,山東 青島 266104;2.山東省海水健康養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心,山東 青島 266104;3.山東省海水養(yǎng)殖病害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266104;4.青島市淺海底棲漁業(yè)增殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266104)

引 言

黃姑魚(Nibeaalbiflora)隸屬鱸形目(Perciformes),石首魚科(Sciaenidae),黃姑魚屬(Nibea),為淺海中下層魚類,自然分布于中國、朝鮮半島及日本南部等溫帶和亞熱帶近海海域[1]。黃姑魚肉質(zhì)細(xì)嫩,味道鮮美,深受廣大消費(fèi)者喜愛,是我國海洋捕撈的重要經(jīng)濟(jì)魚類。其人工養(yǎng)殖也已在浙江、福建等地相繼展開,養(yǎng)殖模式涵蓋池塘養(yǎng)殖、網(wǎng)箱養(yǎng)殖、陸地循環(huán)水養(yǎng)殖等,養(yǎng)殖前景廣闊[2-3]。由于黃姑魚游泳迅速,易受驚嚇,應(yīng)激反應(yīng)強(qiáng)烈,在出池、運(yùn)輸、催產(chǎn)和手術(shù)操作等環(huán)節(jié)極易造成魚體受傷,導(dǎo)致死亡率增加。合理使用麻醉劑不僅可以降低人工操作難度,還能降低因黃姑魚過度掙扎造成的自身傷害,保障魚體健康。

目前用于魚類的麻醉劑種類較多,包括MS-222(俗稱魚安定)、硫酸喹哪啶、2-苯氧乙醇、丁香酚等近30種,目前以MS-222和丁香酚在國內(nèi)外應(yīng)用較為廣泛。丁香油的有效成分為丁香酚,是一種從植物中提取的天然物質(zhì),具有廉價易得,容易被機(jī)體代謝排出,不會誘發(fā)突變,不會對人類或環(huán)境造成危害等優(yōu)點(diǎn),可以作為食品添加劑直接食用[4]。1972年,日本的Endo等[5]首先發(fā)現(xiàn)這種特殊香料對魚具有強(qiáng)烈的麻醉作用,隨后開展了作為麻醉劑的系列研究。經(jīng)近半個世紀(jì)的發(fā)展,丁香油已在魚卵采集、活魚運(yùn)輸和手術(shù)操作中廣泛應(yīng)用。作為水產(chǎn)麻醉劑,丁香油的安全性已被美國FDA認(rèn)可,且在澳大利亞、智利、芬蘭、日本等國均可合法使用[6]。目前丁香油麻醉已經(jīng)在眾多魚類中展開了研究,諸如大黃魚(Pseudosciaenacrocea)[7]、大西洋鮭(Salmosalar)[8]、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[9]、紅大馬哈魚(Oncorhynchusnerka)[10]等,而在黃姑魚中未見相關(guān)報道。本研究探討了丁香油對黃姑魚幼魚的麻醉效果,篩選出適宜的丁香油濃度,以期對黃姑魚的安全生產(chǎn)、增殖放流等提供科學(xué)依據(jù)。

只要，當(dāng)離子運(yùn)動方向與磁力線的夾角(錐角)很小時，粒子就會逸出腔外。最后，粒子的約束時間，基本由粒子碰撞時間來確定。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用黃姑魚幼魚取自山東省海洋生物研究院鰲山衛(wèi)中試基地,全長(10.31±0.95) cm,體質(zhì)量(13.91±3.36) g,均健壯活潑,體色正常,體表無任何損傷。實(shí)驗(yàn)開始前在室內(nèi)水泥池中暫養(yǎng)7 d,暫養(yǎng)用水為經(jīng)砂濾處理的自然海水,水溫(16±0.5) ℃,鹽度31,pH 7.8～8.0,每日換水2次,日換水量50%,連續(xù)充氣,保證溶解氧≥6 mg/L,每日投喂適量海水魚專用配合飼料。

在影集里，我看到了大丫幾位前夫的照片。知道她離過五次婚。第一任丈夫老K就不說了，第二個丈夫是個長她十歲的工人，人長得挺粗俗。我心想，這個男人與當(dāng)時的大丫還是般配的。大丫后來的幾個丈夫都是一些買賣人。在大丫分別與這幾個男人比肩而立之中，明顯地看出她成熟起來了。

麻醉劑丁香油購自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所,含量(以丁香酚計)為85%,為橘黃色油狀液體,不易溶于水。使用前將其與無水乙醇以1∶9的比例混勻,配制成0.085 g/L的母液,現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 方法

1.2.1 丁香油對黃姑魚幼魚的麻醉效果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示,用Excel 2010與SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,用單因素方差分析(One-way ANOVA)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn),用Duncan檢驗(yàn)法和LSD法進(jìn)行組間多重比較,顯著性水平設(shè)為0.05。

將黃姑魚幼魚放入120 mg/L麻醉水體中,當(dāng)魚體進(jìn)入深度麻醉后,迅速將其取出置于濕毛巾上進(jìn)行空氣暴露處理,空氣暴露時間設(shè)置3、4、5、6、7、8、9、10 min共8個梯度,每個實(shí)驗(yàn)組放5尾魚,每組設(shè)3個平行?？諝獗┞锻戤吅?將每尾魚放入自然海水中進(jìn)行復(fù)蘇,觀察復(fù)蘇過程的活動狀態(tài),測定復(fù)蘇時間和復(fù)蘇率。

1.2.2 丁香油對黃姑魚幼魚的呼吸頻率影響

1.2.3 空氣暴露對黃姑魚幼魚復(fù)蘇時間的影響

根據(jù)黃姑魚幼魚在不同濃度丁香油麻醉劑作用下麻醉過程和復(fù)蘇過程呈現(xiàn)的行為特征,將麻醉過程分為6個時期,復(fù)蘇過程分為4個時期,各時期分期及幼魚行為特征見表1。水溫(16±0.5) ℃時,隨丁香油濃度增加,黃姑魚幼魚進(jìn)入各時期的時間縮短,最終所達(dá)到的麻醉程度也越高。

實(shí)驗(yàn)方法及濃度設(shè)置同1.2.1。待魚體麻醉并穩(wěn)定1 min后,測定每尾魚的呼吸頻率(1 min內(nèi)鰓蓋張合次數(shù))。對于對照組以及無法使幼魚麻醉的低濃度處理組,待幼魚在水體中穩(wěn)定10 min后開始測定呼吸頻率。

開分手公司的原因也很無稽，那時兩個人都是單身，看見情侶就各種羨慕嫉妒恨，琢磨著怎么能合情合理又合法地拆散人家，最好的方法當(dāng)然就是代替別人提出分手。后來發(fā)現(xiàn)市場上還真有不少此類需求，于是索性就做成了產(chǎn)業(yè)，口號也變成了“和平解散、無痛分手”。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)在規(guī)格為40 cm(長)×30 cm(寬)×20 cm(高)的塑料整理箱中進(jìn)行,盛入10 L新鮮海水(水溫16±0.5 ℃,鹽度31,pH 7.8～8.0),混入固定體積的丁香油母液并充分?jǐn)嚢杈鶆颉Ｍㄟ^預(yù)實(shí)驗(yàn)確定麻醉水體的濃度梯度,分別為10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120 mg/L,以自然海水作為對照組。每個實(shí)驗(yàn)組放5尾魚,每組設(shè)3個平行。觀察并記錄各組黃姑魚幼魚在麻醉水體中的活動狀態(tài),隨后轉(zhuǎn)入自然海水中進(jìn)行復(fù)蘇,觀察并記錄復(fù)蘇過程的活動狀態(tài)。根據(jù)幼魚行為特征變化將麻醉過程和復(fù)蘇過程分期,分期標(biāo)準(zhǔn)參考劉長琳等[11]。測定入麻時間和復(fù)蘇時間,其中入麻時間為放入麻醉水體中至進(jìn)入麻醉期(魚體側(cè)傾,不掙扎)所需時間,復(fù)蘇時間為處于麻醉期狀態(tài)幼魚放入自然海水中至完全復(fù)蘇所需時間。

從圖2中可以看出，1527，1348 cm-1處為苯環(huán)上—NO2的吸收峰，2 234 cm-1處為—CN的吸收峰。從圖3中可以看出：3198 cm-1處的吸收峰為N—H的伸縮振動特征吸收峰；在2997 cm-1處有一吸收峰，為—NH3+，Ar─H的伸縮振動特征吸收峰；1595及1 513 cm-1處的2個吸收峰分別為—NO2、Ar—H和C═N的伸縮振動特征吸收峰；在1 419及1383 cm-1處有2個吸收峰[6]，為—NO2的伸縮振動特征吸收峰；在779，705 cm-1處有2個吸收峰，為—NH2的伸縮振動特征吸收峰[7]。

中南大學(xué)在2016級、2017級冶金、工管、能器、機(jī)械、臨床等非計算機(jī)專業(yè)約840名學(xué)生的“數(shù)據(jù)庫技術(shù)與應(yīng)用”課程進(jìn)行了連續(xù)兩年交叉融合的教學(xué)模式的實(shí)踐，課程共48課時，為期12周，獲得了比對效果較好的應(yīng)用數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 丁香油對黃姑魚幼魚的麻醉效果

在設(shè)計過程中，采用PLC和觸摸屏分別作為系統(tǒng)的控制器和顯示屏，簡化了系統(tǒng)的硬件設(shè)計，有效增強(qiáng)了人機(jī)交互能力和系統(tǒng)的可操作性，提升了系統(tǒng)的穩(wěn)定性.同時，引入的固定參數(shù)值和主元分析法(PCA)的參數(shù)控制限估計方法，有效提高了系統(tǒng)可靠性和故障監(jiān)測能力.

表1 麻醉過程分期及行為特征

當(dāng)丁香油濃度為10、20 mg/L時,黃姑魚幼魚在15 min內(nèi)僅能達(dá)到2期或3期的麻醉程度,無法進(jìn)入4期(麻醉期)。當(dāng)丁香油濃度≥30 mg/L時,黃姑魚幼魚均可在6 min以內(nèi)進(jìn)入4期(麻醉期),入麻時間和復(fù)蘇時間隨丁香油濃度的變化如圖1所示。隨丁香油濃度升高,黃姑魚幼魚的入麻時間縮短。其中,濃度為30、40 mg/L時,入麻時間>5 min;濃度范圍在50～80 mg/L時,入麻時間為3～4 min;濃度為110、120 mg/L時,入麻時間<2 min。隨丁香油濃度升高,黃姑魚幼魚在自然海水中的復(fù)蘇時間延長。其中,濃度為30、40 mg/L時,復(fù)蘇時間<2 min;濃度范圍在50～80 mg/L時,復(fù)蘇時間為2～3 min;濃度為110、120 mg/L時,復(fù)蘇時間在4 min左右。

圖1 不同濃度的丁香油對黃姑魚入麻和復(fù)蘇時間的影響

2.2 丁香油濃度對黃姑魚幼魚呼吸頻率的影響

不同丁香油濃度對黃姑魚幼魚呼吸頻率的影響如圖2所示。隨丁香油濃度升高,黃姑魚幼魚呼吸頻率呈下降趨勢。正常狀態(tài)下,黃姑魚幼魚呼吸頻率為(77.0±3.2) 次/min;當(dāng)丁香油濃度為10、20 mg/L時,幼魚長時間處于2期(深度鎮(zhèn)定期)和3期(輕度麻醉期),其呼吸頻率分別下降至(67.8±3.9) 次/min和(60.0±2.8) 次/min;當(dāng)丁香油濃度為30～60 mg/L時,測量期間幼魚均處于麻醉4期(麻醉期),呼吸頻率在(39.8～49.4)次/min之間,其中以50 mg/L時呼吸頻率最低,而30、40、60 mg/L時的呼吸頻率差異不顯著(P>0.05);當(dāng)丁香油濃度為70、80 mg/L時,幼魚在4期僅停留1 min左右,隨后進(jìn)入5期(深度麻醉期),呼吸頻率降低至(18.4±4.1)和(21.4±5.1) 次/min;當(dāng)丁香油濃度≥90 mg/L時,呼吸頻率繼續(xù)降低至15 次/min以下,并維持較短時間后出現(xiàn)休克,呼吸停止。

圖2 不同丁香油濃度對黃姑魚幼魚呼吸頻率的影響

2.3 空氣暴露時間對黃姑魚復(fù)蘇效果的影響

空氣暴露時間對黃姑魚幼魚復(fù)蘇時間和復(fù)蘇率的影響如圖3所示。黃姑魚幼魚的復(fù)蘇時間隨空氣暴露時間增加呈先下降后升高的趨勢。空氣暴露時間由3 min升高至6 min,復(fù)蘇時間由(3.97±0.44) min緩慢降低至(2.80±0.52) min;而當(dāng)空氣暴露時間≥7 min時,復(fù)蘇時間呈現(xiàn)顯著性增加(P<0.05),且同處理組內(nèi)個體復(fù)蘇時間差異增大,部分無法復(fù)蘇,出現(xiàn)死亡個體?？諝獗┞稌r間為3～6 min時,復(fù)蘇率保持在100%,當(dāng)≥7 min時,隨空氣暴露時間增加,復(fù)蘇率持續(xù)下降,在10 min時復(fù)蘇率降低至53.33%。

3 討論

3.1 丁香油的麻醉作用機(jī)制及其有效濃度

丁香油作為魚用麻醉劑,其作用機(jī)制為丁香酚由鰓絲或體表進(jìn)入體內(nèi)后,首先抑制大腦皮層的活動,導(dǎo)致視覺、觸覺減弱直至喪失;隨后作用于基底神經(jīng)節(jié)和小腦,呈現(xiàn)無意識運(yùn)動增多和身體平衡能力下降;再作用于脊髓,魚類呈現(xiàn)全身麻醉狀態(tài),失去反應(yīng)能力;如果劑量過大或者作用時間過長,則會麻痹呼吸和循環(huán)中樞神經(jīng),魚類呼吸停止,無法恢復(fù),死亡[12-13]。本研究表明,隨麻醉程度加深,黃姑魚幼魚先后呈現(xiàn)出視覺、觸覺、平衡能力和肌肉張力的缺失,呼吸頻率逐漸降低直至停止,這符合麻醉劑對神經(jīng)系統(tǒng)作用的先后順序。

Marking等[14]認(rèn)為,理想的麻醉濃度應(yīng)當(dāng)是在滿足合理暴露時間前提下,能夠使魚類在3 min內(nèi)進(jìn)入麻醉4期(麻醉期),并在5 min內(nèi)復(fù)蘇。許多國內(nèi)外學(xué)者[7-11, 15-18]在定義最佳麻醉濃度時均參考此標(biāo)準(zhǔn)。本研究結(jié)果顯示,50～120 mg/L的濃度范圍內(nèi)的丁香油處理組黃姑魚幼魚均可在3 min內(nèi)入麻,并5 min內(nèi)復(fù)蘇。但是實(shí)際生產(chǎn)中不建議使用較高濃度的丁香油進(jìn)行麻醉,因?yàn)閷?shí)驗(yàn)條件下幼魚入麻后能夠被及時轉(zhuǎn)至自然海水中復(fù)蘇,即使是高濃度的處理組丁香酚仍未在體內(nèi)充分富集,轉(zhuǎn)入自然海水后亦能很快排出體外,而實(shí)際生產(chǎn)中麻醉群體數(shù)量通常較大,個體間的差異使入麻時間不同步,高濃度麻醉劑很難控制麻醉時間,稍有不慎會使部分個體麻醉時間過長,從而健康受損甚至死亡,因此持續(xù)麻醉時間需要足夠的安全邊界[19]。本研究結(jié)果顯示,當(dāng)丁香油濃度≥70 mg/L時,黃姑魚幼魚在麻醉4期停留時間較短,很快發(fā)展至麻醉5期甚至麻醉6期,持續(xù)麻醉時間的安全邊界收縮。綜上,從安全和有效兩方面考慮,認(rèn)為本研究中黃姑魚幼魚丁香油麻醉的適宜濃度為50～60 mg/L。丁香油對不同魚類種類的麻醉效果存在較大的差異,本研究得出的黃姑魚幼魚適宜麻醉濃度處于中等水平,與大西洋鮭(Salmosalar)[20]接近,高于斑馬魚(Daniorerio)[21]、黃斑籃子魚(Siganusoramin)[22],低于暗紋東方鲀(Takifuguobscurus)[18]和俄羅斯鱘(Acipensergueldenstaedti)[23]。另外,丁香油的麻醉效果受環(huán)境和魚類自身因素影響[4],上述濃度范圍是在(16±0.5) ℃條件下,對體質(zhì)量(13.91±3.36) g黃姑魚幼魚的實(shí)驗(yàn)得出的,不同溫度、魚體規(guī)格下丁香油的麻醉效果需要在以后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步深入研究。

3.2 丁香油對黃姑魚幼魚呼吸頻率的影響

魚類在經(jīng)麻醉處理時呼吸頻率的大小能夠反映其麻醉程度的高低。一般情況下麻醉程度越高,呼吸頻率越低。許多學(xué)者認(rèn)為魚類的呼吸頻率在整個麻醉期間是持續(xù)下降的,例如丁香油麻醉許氏平鲉(Sebastesschlegeli)[15]、大瀧六線魚(Hexagrammosotakii)[17]、黑鱸(Micropterussalmoides)[24]、黃臘鲹(Trachinotusblochii)[25]、MS-222麻醉美洲鰣(Alosasapidissima)[26]等。本研究表明,隨丁香油濃度的升高,黃姑魚幼魚的呼吸頻率總體呈下降的趨勢。低濃度(10～20 mg/L)時,黃姑魚幼魚緩慢麻醉至2期(深度鎮(zhèn)定期)和3期(輕度麻醉期)后麻醉程度不再加深,呼吸頻率較正常狀態(tài)略有下降后保持相對穩(wěn)定,原因可能是魚體對丁香酚的攝入速率與其代謝、排出的速率達(dá)到了相對平衡的狀態(tài),這與曹曉聰?shù)萚22]對黃斑籃子魚的研究結(jié)果一致。隨濃度升高,魚體自身的代謝能力不足以將血液中麻醉劑維持在低濃度水平,導(dǎo)致麻醉程度加深,呼吸頻率下降,最終呈現(xiàn)4～6期的麻醉狀態(tài)。當(dāng)濃度為30～60 mg/L時,幼魚均能夠保持1 min以上4期麻醉狀態(tài),由于處于相同麻醉時期,呼吸頻率隨麻醉劑濃度升高而下降的趨勢不明顯。本研究結(jié)果顯示60 mg/L的幼魚呼吸頻率出現(xiàn)小幅上升,原因可能是在中等濃度的麻醉劑作用下幼魚呼吸頻率存在較大的個體差異[15],也可能是測定時間段后期幼魚開始向5期麻醉過渡,出現(xiàn)了不規(guī)律呼吸,從而造成短時間內(nèi)統(tǒng)計的呼吸次數(shù)偏高。當(dāng)濃度≥70 mg/L時,幼魚血液中丁香酚含量迅速上升,入麻后呼吸很快變得斷斷續(xù)續(xù)且更加緩慢,持續(xù)一段時間后發(fā)生休克,呼吸停止。

3.3 空氣中暴露時間對黃姑魚幼魚復(fù)蘇的影響

為方便測量、活體取樣、人工催產(chǎn)、標(biāo)記放流等人工操作,生產(chǎn)實(shí)踐中需要將魚麻醉后取出短時間暴露在空氣中,因此研究空氣暴露時間對魚類復(fù)蘇的影響很有必要[27]。本研究表明120 mg/L丁香油深度麻醉劑后,當(dāng)空氣暴露時間≤6 min時,黃姑魚幼魚的復(fù)蘇時間隨空氣暴露時間的增加而逐漸減小,而且復(fù)蘇率全部保持100%;當(dāng)空氣暴露時間≥7 min時,幼魚復(fù)蘇時間顯著增加,而且同處理組內(nèi)個體復(fù)蘇時間差異增大,出現(xiàn)部分個體死亡,無法復(fù)蘇,其復(fù)蘇率隨空氣暴露時間增加逐漸降低。原因可能是:黃姑魚幼魚離水后,環(huán)境中的麻醉劑不再向體內(nèi)富集,而已作用于神經(jīng)系統(tǒng)的麻醉劑則隨血液循環(huán)逐漸擴(kuò)散至全身,一部分被代謝分解,另一部分經(jīng)皮膚排出體外,實(shí)際上的復(fù)蘇過程在空氣暴露期間時已經(jīng)開始了[22],因此一定范圍內(nèi),空氣暴露時間越長,在清潔海水中復(fù)蘇時間越短;隨著空氣中暴露時間的繼續(xù)延長,魚體的呼吸作用逐漸恢復(fù),耗氧率增加,長時間干露脅迫使其無法攝入充足氧氣,從而產(chǎn)生窒息或者昏迷[28],導(dǎo)致復(fù)蘇時間延長,甚至部分個體死亡。魚的種類不同,丁香油麻醉后能夠忍受的空氣暴露時長也存在差異。本研究表明,為保證復(fù)蘇效果,黃姑魚幼魚空氣暴露時間不宜超過6 min,這與黃斑籃子魚[22]上的研究結(jié)果一致,而相比之下,大瀧六線魚能夠忍受的空氣暴露時間更長[17],刀鱭(Coilianasus)忍受的空氣暴露時間則更短[29]。

4 結(jié)論

本研究表明,丁香油對黃姑魚幼魚具有良好的麻醉效果,具有入麻時間短,復(fù)蘇快,復(fù)蘇率高等優(yōu)點(diǎn);在對相似規(guī)格黃姑魚幼魚人工操作時建議丁香油麻醉濃度為50～60 mg/L,且建議麻醉后離水人工操作時間不宜超過6 min。