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      口灌氟苯尼考對中華鱉組織損傷的病理學研究

      2023-07-17 05:56:12張永剛王政邢麗紅李兆新張大海李先國吳薇劉瑩
      安徽農(nóng)業(yè)科學 2023年12期
      關鍵詞:病理學毒性

      張永剛 王政 邢麗紅 李兆新 張大海 李先國 吳薇 劉瑩

      摘要 為確定氟苯尼考在中華鱉養(yǎng)殖中的使用方法,分別以 0(CK)、15、45、75 mg/kg的劑量對中華鱉連續(xù)口灌氟苯尼考5 d,每天1次,于最后一次給藥后 24 h采集試驗鱉肝臟、腎臟、脾臟、心臟、腸道、睪丸、精巢及肌肉組織。運用組織與細胞病理學方法研究氟苯尼考對中華鱉組織損傷的影響。通過組織切片觀察發(fā)現(xiàn),與對照組相比,隨著給藥劑量的增加,當氟苯尼考劑量為45 mg/kg 時,試驗鱉組織器官開始出現(xiàn)結(jié)構(gòu)損傷。75 mg/kg 氟苯尼考對中華鱉各組織器官的損傷加重,試驗鱉腸黏膜出現(xiàn)壞死脫落、溶解現(xiàn)象,肝細胞核固縮變形、肝索消失,腎臟結(jié)構(gòu)模糊、腎小管管腔界限不清,脾臟小梁動脈和小梁靜脈擴張、炎性細胞增多,肌肉與心肌纖維變性、斷裂,精小囊和曲細精管出現(xiàn)空腔現(xiàn)象。氟苯尼考在實踐生產(chǎn)中應嚴格按照推薦劑量(15 mg/kg)用藥。

      關鍵詞 中華鱉;氟苯尼考;組織損傷;病理學;毒性

      中圖分類號 S 948? 文獻標識碼 A

      文章編號 0517-6611(2023)12-0078-04

      doi:10.3969/j.issn.0517-6611.2023.12.017

      Pathological Research on the Damage of Florfenicol to the Tissues of Pelodiscus sinensis by Oral Administration

      ZHANG Yong-gang1,WANG Zheng1,XING Li-hong2 et al

      (1.College of Chemistry and Chemical Engineering,Ocean University of China,Qingdao,Shandong 266100;2.Yellow Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Qingdao,Shandong 266071)

      Abstract In order to determine the application method of florfenicol in the culture of Pelodiscus sinensis,P.sinensis was administered with florfenicol 5 d at the dosage of 0 (CK),15,45 and 75 mg/kg by oral administration,one time per day.The liver,kidney,spleen,heart,intestine,testis,spermary and muscle tissues of P.sinensis were collected 24 h after the last administration.The effects of flufenicol on the tissue injury of P.sinensis were studied by the histological and cytopathological methods.Through the histological examination,it was found that the tissue organs of P.sinensis began to appear obvious pathological changes when the dosage of florfenicol was 45 mg/kg,with the increase of the dosage.And the damage appeared to be more serious in 75 mg/kg florfenicol group.The intestinal mucosa appeared necrosis and dissolution,liver cell nuclear pyknosis and deformation,liver cable disappeared,kidney structure was fuzzy,renal tubular lumen boundary was unclear,splenic trabecular artery and trabecular vein dilated,inflammatory cells increased,muscle and cardiac muscle fiber degenerated and fractured,seminal vesicle and seminiferous tubules appeared cavity phenomenon of experimental P.sinensis.In the practice production,florfenicol should be strictly accord to the recommended dose (15 mg/kg).

      Key words Pelodiscus sinensis;Florfenicol;Tissue injury;Pathology;Toxicity

      基金項目 國家重點研發(fā)計劃資助項目(2019YFD0901701)。

      作者簡介 張永剛(1993—),男,河北滄州人,博士研究生,研究方向:水產(chǎn)動物毒理學。

      *通信作者,高級工程師,博士,從事水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測研究。

      收稿日期 2022-07-21;修回日期 2022-08-19

      中華鱉(Pelodiscus sinensis)隸屬鱉科(Trionychidae)中華鱉屬(Pelodiscus),廣泛分布于中國、日本、韓國、泰國等亞洲國家,因其具有較高的食用與藥用價值而深受養(yǎng)殖者及消費者喜愛,有“美食五味肉”之稱[1-2]。2021年我國鱉養(yǎng)殖總產(chǎn)量達到36.5萬t[3]。然而,隨著中華鱉養(yǎng)殖規(guī)模的迅速擴大,由于養(yǎng)殖密度大、水環(huán)境惡化,病害頻發(fā),進而導致嚴重的經(jīng)濟損失。目前,已報道的中華鱉細菌性疾病有40余種,主要致病菌有17余種[4-10]。

      氟苯尼考(florfenicol,F(xiàn)F)屬于第三代酰胺醇類廣譜抗菌藥物。與同類藥物相比,它具有抗菌范圍廣、抗菌活性高、毒副作用小等優(yōu)點,被廣泛用于畜禽、水產(chǎn)動物疾病預防和治療[11-12]。氟苯尼考的過度使用導致動物體內(nèi)藥物殘留,污染土壤和海洋環(huán)境,甚至威脅人類健康。近年來,氟苯尼考對動物造成的損害引起了研究人員的高度關注。Wang 等[13]在肉雞飲用水中加入不同劑量的氟苯尼考,發(fā)現(xiàn)其對肉雞腎臟具有較強的毒性作用,并呈現(xiàn)顯著的劑量依賴性。Hu等[14]研究發(fā)現(xiàn)FF可以降低雛雞的孵化率,抑制胚胎發(fā)育并誘導早期胚胎死亡。亞慢性暴露于氟苯尼考可誘發(fā)斑馬魚的腸道紊亂,導致腸道菌群失衡[15]。然而,關于氟苯尼考對中華鱉毒性的研究鮮有報道。筆者在水溫(26.0±1.0)℃條件下研究口灌不同劑量的氟苯尼考對中華鱉各組織器官損傷的病理變化,以期了解氟苯尼考對中華鱉的毒性,從而為氟苯尼考在中華鱉病害防控中的科學、合理使用提供理論依據(jù)與指導。

      1 材料與方法

      1.1 試驗動物 試驗用健康中華鱉由山東省平度市百歲泊中華鱉養(yǎng)殖基地提供,養(yǎng)殖池面積約160 m2,水深1.5~2.0 m,養(yǎng)殖密度約300只/池,平均體質(zhì)量(500±50) g/只,投喂幼鱉飼料。試驗用鱉在養(yǎng)殖池暫養(yǎng)7 d后,經(jīng)檢測體內(nèi)無氟苯尼考藥物殘留。選取體質(zhì)健壯、行動活潑、無病無傷的個體進行試驗,給藥前停飼24 h。

      1.2 藥品與試劑

      FF原料粉(純度≥99%,CAS 73231-34-2),購自德國Dr.Ehrenstorfer公司。

      無水乙醇、甲醛、冰醋酸、二甲苯等試劑均為分析純,購自國藥集團化學試劑有限公司;蘇木精、伊紅均購自北京索萊寶科技有限公司。

      1.3 藥物配制

      藥物濃度設定參考2015年版《中國獸藥典》和《新編漁藥手冊》用藥標準中氟苯尼考對魚類的推薦用藥劑量(15 mg/kg),使用0.9%氯化鈉水溶液(生理鹽水)將氟苯尼考原料粉配制成濃度分別為15、45和75 mg/mL的藥液(分別為魚類推薦劑量的1、3、5倍)。

      1.4 試驗設計 試驗設置3個試驗組(氟苯尼考濃度分別為15、45、75 mg/kg)和1個對照組,均設3個平行,每個平行試驗鱉10只。參照劉瑩等[16]的方法,試驗組均采用口灌給藥方式,用帶有橡皮軟管的注射器從中華鱉口中插入,灌喂藥液0.5 mL。對照組口灌等量的無菌生理鹽水溶液。試驗共持續(xù)5 d,口灌1次/d,試驗期間水溫(26.0±1.0)℃。

      1.5 樣品采集與組織切片處理

      停藥 24 h 后采樣,從每個試驗組隨機取3只中華鱉置于冰盤上解剖,依次采集肝臟、脾臟、心臟、腎臟、腸道、肌肉、睪丸和精巢等組織(該研究側(cè)重研究氟苯尼考對雄性中華鱉生殖功能的影響)。同樣,取對照組(CK)中華鱉組織器官作為對照。

      參照張永剛[17]的方法,將取好的組織樣品固定在Davidsons固定液中,24 h后將固定液更換為70%乙醇溶液。然后,經(jīng)乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟包埋、切片(切成5 μm),用蘇木精、伊紅染色和中性樹膠封片后,在光學顯微鏡下觀察并拍照。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 腸道組織切片觀察結(jié)果 對照組和15 mg/kg氟苯尼考組中華鱉腸黏膜層、固有層和黏膜肌層結(jié)構(gòu)完整,腸絨毛排列有序,頂端柱狀上皮細胞及中央乳糜管清晰,未見明顯病理變化(圖1腸道A~B)。隨著給藥劑量的增加,氟苯尼考對腸道的毒害作用逐步增強。45 mg/kg氟苯尼考組中華鱉紋狀緣結(jié)構(gòu)破損,腸黏膜上皮細胞H.E.染色加深(圖1腸道C);75 mg/kg氟苯尼考組腸黏膜層及腸黏膜下層組織崩解脫落,結(jié)構(gòu)模糊,胞核固縮,細胞溶解,中央乳糜管消失(圖1腸道D)。

      2.2 肝臟組織切片觀察結(jié)果

      對照組和15 mg/kg氟苯尼考組中華鱉肝組織中央靜脈、肝板、小間葉動脈、小間葉靜脈結(jié)構(gòu)完整,肝細胞呈多面體,輪廓清晰,未見明顯病理變化(圖1肝臟A~B);45 mg/kg氟苯尼考組可見明顯的肝細胞空泡化,肝血竇擴張,并有大量血鐵素沉積 (圖1肝臟C);75 mg/kg 氟苯尼考組中華鱉肝細胞受損嚴重,細胞核溶解,空隙增大,肝索結(jié)構(gòu)基本消失(圖1肝臟D)。

      2.3 脾臟組織切片觀察結(jié)果

      對照組和15 mg/kg氟苯尼考組中華鱉脾臟邊緣區(qū)、紅髓和白髓分區(qū)明顯,有零散的黑色素細胞分布,未見明顯病理變化(圖1脾臟A~B)。與對照組相比,45 mg/kg氟苯尼考組中華鱉黑色素細胞增多,小梁靜脈中充滿少量炎性細胞(圖1脾臟C);75 mg/kg氟苯尼考組中華鱉小梁動脈和小梁靜脈擴張,小梁靜脈中充滿大量炎性細胞(圖1脾臟D)。

      2.4 腎臟組織切片觀察結(jié)果

      對照組和15 mg/kg氟苯尼考組中華鱉腎臟由腎小管、腎小球以及腎小管間結(jié)締組織組成,遠端與近端小管結(jié)構(gòu)明顯,未見明顯的病理變化(圖1腎臟A~B);45 mg/kg氟苯尼考組中華鱉腎小球萎縮,結(jié)構(gòu)模糊,開始出現(xiàn)炎性細胞浸潤(圖1腎臟C);75 mg/kg氟苯尼考組腎小管管狀結(jié)構(gòu)幾乎消失,出現(xiàn)大量炎性細胞浸潤的現(xiàn)象(圖1腎臟D)。

      2.5 心臟組織切片觀察結(jié)果

      對照組和15 mg/kg氟苯尼考組中華鱉心肌纖維組織排列有序、緊密,未見有組織出現(xiàn)病理變化(圖1心臟A~B);45 mg/kg氟苯尼考組中華鱉部分區(qū)域肌纖維束出現(xiàn)斷裂現(xiàn)象(圖1心臟C);75 mg/kg氟苯尼考組中華鱉心肌纖維排列紊亂,肌纖維束斷裂嚴重,心肌間被大量血細胞及炎性細胞浸潤(圖1心臟D)。

      2.6 精巢組織切片觀察結(jié)果

      對照組和15 mg/kg氟苯尼考組中華鱉精巢結(jié)構(gòu)完整,精小囊內(nèi)充斥著大量生殖細胞,無明顯病理變化(圖1精巢A~B);45 mg/kg氟苯尼考組中華鱉精小囊內(nèi)生殖細胞逐漸減少,75 mg/kg氟苯尼考組精小囊出現(xiàn)空腔現(xiàn)象(圖1精巢C~D)。

      2.7 睪丸組織切片觀察結(jié)果

      對照組和15 mg/kg氟苯尼考組中華鱉睪丸組織漿膜與曲細精管結(jié)構(gòu)清晰,其內(nèi)部充斥著大量生精細胞,未見明顯病理變化(圖1睪丸A~B)。與對照組相比,45 mg/kg氟苯尼考組中華鱉曲細精管內(nèi)精原細胞或精子略微減少(圖1睪丸C);75 mg/kg氟苯尼考組中華鱉曲細精管出現(xiàn)空腔現(xiàn)象(圖1睪丸D)。

      2.8 肌肉組織切片觀察結(jié)果

      對照組、15 mg/kg氟苯尼考組和45 mg/kg氟苯尼考組中華鱉肌纖維平行排列,肌纖維邊緣可見明顯的細胞核,組織結(jié)構(gòu)正常,未見明顯病理變化(圖1肌肉A~C);75 mg/kg氟苯尼考組出現(xiàn)肌纖維間隙變大的現(xiàn)象(圖1肌肉D)。

      3 討論

      肝臟、腎臟、脾臟和腸道作為動物主要的吸收、排泄與造血器官,在藥物吸收、代謝和轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮重要作用。這些組織器官中含有大量的抗氧化酶,比如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH)等,可以保護機體免受外界因子的脅迫。當機體大量接觸外源性化合物后,會引起組織氧化應激,使得機體抗氧化因子含量下降,活性氧(ROS)自由基含量增加,引起生物大分子(如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和脫氧核酸等)損傷,最終引發(fā)動物的免疫抑制,導致組織損傷[18]。Wang 等[13]研究發(fā)現(xiàn)氟苯尼考對肉雞腎臟的毒性呈現(xiàn)顯著的劑量依賴性。曲悅等[19]和Han等[20]在日糧中添加不同劑量的氟苯尼考,發(fā)現(xiàn)氟苯尼考會損害肉雞肝臟、腎臟、腸道、心臟、肌肉等組織,引發(fā)器質(zhì)性病理變化,同時使組織中丙二醛(MDA)含量提高,降低GSH、SOD、CAT 活性,進而導致機體功能衰竭。Ren等[21]研究發(fā)現(xiàn)氟苯尼考會顯著抑制三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)的抗氧化酶活性,使其解毒功能降低。陳彥伶等[22]報道諾氟沙星可造成中華鱉藥源性肝損傷,肝臟、脾臟、腎臟均出現(xiàn)不同程度的病變。上述報道與該研究結(jié)果相似,高劑量氟苯尼考對中華鱉肝臟、腎臟、脾臟和腸道均造成嚴重的病理損傷,腸黏膜壞死脫落、細胞溶解,肝細胞核固縮、肝索消失,腎臟結(jié)構(gòu)模糊、腎小管管腔界限不清,脾臟小梁動脈和小梁靜脈擴張、炎性細胞增多,此外肌肉與心肌纖維變性、斷裂,均出現(xiàn)退行性病變。究其原因,可能是當機體攝入過量氟苯尼考后,引發(fā)機體氧化應激,使組織中抗氧化酶含量降低,無法及時清除組織內(nèi)過多的氧自由基,氟苯尼考不能被完全排出體外,導致組織器官脂質(zhì)損傷,代謝與排泄功能下降,進而使組織器官功能衰竭。下一步將分析氟苯尼考對中華鱉血清生化指標、抗氧化酶活性的影響,闡述氟苯尼考對機體組織器官造成不同程度氧化損傷的機理。

      心臟作為血液循環(huán)系統(tǒng)的動力器官,在動物機體血液供應中發(fā)揮重要作用,這也易于藥物在器官中積累,從而造成嚴重損傷。韓冰等[23]給松浦鏡鯉(Cyprinus specularis songpu)口灌不同劑量伊維菌素,發(fā)現(xiàn)高劑量伊維菌素可使其心肌纖維嚴重萎縮、變性。該研究結(jié)果表明口灌高劑量氟苯尼考可造成中華鱉心肌纖維紊亂、嚴重斷裂,部分心肌纖維溶解,在心肌間隙內(nèi)有炎性細胞浸潤。此外,氟苯尼考還會對動物機體產(chǎn)生生殖毒性。楊桂香等[24]在大鼠飼料中添加氟苯尼考,發(fā)現(xiàn)100 mg/kg 氟苯尼考可使大鼠睪丸曲細精管嚴重萎縮,曲細精管內(nèi)已無生精細胞和精子存在。該研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)高劑量氟苯尼考可造成中華鱉精巢和睪丸生殖細胞消失,精小囊和曲細精管出現(xiàn)空腔現(xiàn)象。該結(jié)果表明高劑量的氟苯尼考可使雄性中華鱉生殖器官及功能受到嚴重損傷。

      綜上所述,在正常給藥劑量(15 mg/kg)下氟苯尼考不會引起中華鱉各組織的變化,但在中、高給藥劑量(45和75 mg/kg)下氟苯尼考對中華鱉具有較強的毒性。從各組織的病理學切片可以看出,高劑量氟苯尼考對中華鱉的腸道、肝臟、脾臟、心臟、腎臟、肌肉、睪丸和精巢均可造成嚴重的損傷,具有一定的生殖毒性。因此,將氟苯尼考用于中華鱉病害防治和預防時,應合理規(guī)范使用,嚴格控制用藥劑量,以避免因過度使用而對中華鱉機體造成損傷。此外,應加強對中華鱉肝臟、腎臟、睪丸等組織的檢查,確定藥物對機體是否產(chǎn)生損傷,有效保證氟苯尼考在養(yǎng)殖應用中的科學性、安全性。

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