郭美玲 龐月 劉芯睿 劉玉茹 薛淑霞 孫金生

摘要 為闡明哈維氏弧菌對青石斑幼魚的致病特性，開展了人工感染試驗，注射感染健康青石斑幼魚14 d，其半致死劑量（LD50）為6×105 CFU/mL。毒力基因分析表明，該菌株攜帶鞭毛結(jié)構(gòu)基因flaB、flaC，溶血素基因vhhA、vhhB，群體效應(yīng)調(diào)節(jié)基因luxR和幾丁質(zhì)酶基因chiA 6個毒力基因。耐藥性分析表明，菌株TJYG-42對甲硝唑（MTZ）、鏈霉素（S）、阿莫西林（AMX）和氨芐西林（AM） 4種藥物具有抗性。組織病理學分析表明，菌株TJYG-420感染引起了魚體組織明顯的病理變化，包括皮膚組織中囊狀細胞數(shù)量明顯增加，鰓細胞增生、腫脹、毛細血管擴張，腸黏膜斷裂破損，部分絨毛脫落，肝臟細胞空泡化等。這些研究結(jié)果將為養(yǎng)殖青石斑魚細菌性疾病的防治提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 青石斑魚；哈維氏弧菌；耐藥性；毒力基因；組織病理學評估

中圖分類號 S 941? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2023）12-0089-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.12.020

Identification and Pathogenicity Analysis of Vibrio harveyi from Juvenile Yellow Grouper （Epinephelus awoara）

GUO Mei-ling，PANG Yue，LIU Xin-rui et al

（College of Life Science，Tianjin Normal University，Tianjin 300387）

Abstract In order to elucidate the pathogenic characteristics of the V.harveyi isolate on juvenile yellow grouper，we conducted artificial infection experiments using intraperitoneal injection and the LD50 was determined as 6×105 CFU/mL in 14 days.The virulence gene analysis showed that the V.harveyi isolate carried 6 virulence genes，including flagellin （flaB、flaC），protease （chiA），hemolysin （vhhA、vhhB），population sensing system （luxR）.Antibiotic susceptibility analysis showed that the V.harveyi isolate was susceptible to most antibiotics and resistant to only four drugs，including metronidazole（MTZ），streptomycin（S），amoxicillin（AMX） and ampicillin（AM）.Histopathological analysis showed that the infection of the V.harveyi isolate caused obvious pathological changes in fish tissues，including more sacciform cells which cytoplasmic content formed an eosinophilic clump in the centre presented in skin tissues; cellular swelling vacuolation inflammatory infiltrating and angiotelectasis in gill lamellae; blunted，fused or shed intestinal villi and loosened mucous layer and connective tissues in intestine; cellular vacuolation in liver.The results suggest that the V.harveyi isolate is the causative pathogen causing massive mortalities in juvenile yellow grouper，carries a high number of virulence genes，is susceptible to most antibiotics，and its infection caused severe histopathological changes in the fish.These results of these studies will provide technical supports for the control of bacterial diseases in cultured yellow grouper.

Key words Vibrio harveyi;Epinephelus awoara;Drug resistance;Virulence genes;Histopathological analysis

基金項目 天津市海水養(yǎng)殖現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團隊項目（ITTMR-S2022006）；天津市勞模創(chuàng)新團隊項目。

作者簡介 郭美玲（1996—），女，山東濰坊人，碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)病害學。*通信作者，研究員，從事水產(chǎn)病害學研究。

收稿日期 2023-01-05

青石斑（Epinephelus awoara）是我國重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟魚類，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大及養(yǎng)殖環(huán)境的惡化，養(yǎng)殖青石斑疾病頻發(fā)，給養(yǎng)殖企業(yè)造成了較大的經(jīng)濟損失?；【呛ＫB(yǎng)殖魚類的主要致病病原，隸屬于弧菌科弧菌屬，常見于海水中。近年來，弧菌引起的魚類疾病越來越多。據(jù)報道，多種弧菌可以感染海水養(yǎng)殖魚類，如副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）［1］、擬態(tài)弧菌（V.mimicus）［2］、哈維氏弧菌（V.harveyi）［3］、溶藻弧菌（V.anguillarum）［4］等。近年來，關(guān)于哈維氏弧菌感染海水養(yǎng)殖魚類的研究報道較多。哈維氏弧菌（vibrio harveyi）是一種海洋革蘭氏陰性發(fā)光微生物，生活在河口和海洋棲息地，需要氯化鈉［5］。該細菌是養(yǎng)殖水生魚類的一種重要病原體，可以感染多種水生魚類?；疾◆~體的常見臨床癥狀包括皮膚潰瘍、鱗片脫落、肌肉壞死和鰓蓋上的結(jié)節(jié)等。研究表明，不同分離株的哈維氏弧菌，其致病特性存在差異。筆者對哈維氏弧菌的新分離株進行了致病性研究，將為闡釋哈維氏弧菌的流行及為養(yǎng)殖青石斑細菌性疾病的預防和控制提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 青石斑幼魚購自天津某海水工廠化養(yǎng)殖場，體長8～12 cm，養(yǎng)殖水溫（22±1）℃，鹽度（25‰～26‰）。

1.2 人工感染試驗

健康青石斑幼魚在實驗室暫養(yǎng)5 d后，隨機分為7組，6組為試驗組，1組為對照組，每組10尾魚。采用腹腔注射的方式，試驗組注射不同濃度梯度（4.7×107、4.7×106、4.7×105、4.7×104、4.7×103、4.7×102 CFU/mL）的TJYG-420菌懸液，注射劑量0.1 mL/尾。對照組注射同劑量0.7 % NaCl溶液。觀察并記錄魚體發(fā)病癥狀及死亡情況。取瀕死青石斑幼魚的體表、肝臟、脾臟、腎臟等器官組織，再次分離純化細菌，并進行鑒定。按照寇氏法計算病原菌對青石斑幼魚的半致死劑量（LD50）。

1.3 菌株TJYG-420的鑒定

1.3.1 生理生化特性。

采用弧菌科和腸桿菌科生化鑒定管（購自杭州微生物試劑有限公司）測定細菌的生理生化特征。參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》［6］和《伯杰氏細菌鑒定手冊》［7］生化指標分析菌株特征。

1.3.2 分子生物學鑒定。

按照細菌基因組DNA提取試劑盒（購自天根生化科技有限公司）的方法提取DNA作為模板。引物（表1）由生物工程（北京）股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系（50 μL）：20 mmol/L正反向引物4 μL，2×Taq MasterMix酶（購自北京博邁德基因技術(shù)有限公司）25 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 19 μL。擴增程序：94 ℃，3 min，94 ℃，30 s、55 ℃，30 s、72 ℃，1 min，35個循環(huán)，72 ℃延伸7 min。測序結(jié)果利用MEGA11軟件采用鄰接法進行系統(tǒng)進化分析。

1.4 毒力基因檢測 試驗選取了11種毒力基因，包括鞭毛蛋白（flaA、flaB、flaC）、溶血素（vhhA、vhhB、hlyA）、毒力調(diào)控基因（toxS、toxR）、鋅金屬蛋白酶（pap6）、群體效應(yīng)調(diào)節(jié)基因（luxR）、幾丁質(zhì)酶基因（chiA）。PCR擴增采用25 μL反應(yīng)體系，擴增程序：94 ℃，3 min，94 ℃，30 s、58 ℃，30 s、72 ℃，1 min，35個循環(huán)，72 ℃延伸7 min。根據(jù)Primer Premier 5.0軟件自行設(shè)計引物，其序列見表1。

1.5 耐藥性分析

試驗選取29種藥敏紙片（杭州微生物試劑有限公司）測定細菌對各種抗菌藥物的敏感性［10］。

1.6 組織病理分析

分別取健康和注射感染菌株TJYG-420 12 h青石斑幼魚的皮膚、鰓絲、腸道和肝臟組織，用4%多聚甲醛溶液固定液固定，組織切片制備等參照文獻［11］。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工感染 在整個試驗過程中，對照組魚活動及進食正常，無發(fā)病或死亡情況出現(xiàn)。注射高濃度菌液組的魚體死亡率為100%，而其他組的死亡率分別為30%、10%和0，經(jīng)計算LD50為6×105 CFU/mL。從發(fā)病魚體內(nèi)臟中分離獲得優(yōu)勢菌，經(jīng)鑒定為哈維氏弧菌。

2.2 生理生化鑒定

菌株TJYG-420的生理生化鑒定結(jié)果見表2。菌株TJYG-420能利用葡萄糖、蔗糖和甘露糖，發(fā)酵產(chǎn)氣，分解尿素，能在3%～6% NaCl中生長，而在8%～10% NaCl不生長。經(jīng)比對，發(fā)現(xiàn)其生理生化特征與哈維氏弧菌基本保持一致，初步判定為哈維氏弧菌。

2.3 分子生物學鑒定

經(jīng)16S rRNA基因和hsp60基因分別擴增得到大小約1 500 bp和532 bp的片段。將菌株TJYG-420的16S rRNA和hsp60基因序列在NCBI上進行同源性檢索并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示（圖1），菌株TJYG-420與哈維氏弧菌聚為一支，進一步確定TJYG-420菌株為哈維氏弧菌。

2.4 毒力基因分析

11種毒力基因檢測結(jié)果顯示（圖2），菌株TJYG-420攜帶flaB、flaC、vhhA、vhhB、chiA和luxR 6個毒力基因。

2.5 耐藥性分析

耐藥性檢測結(jié)果見表3，在抗菌藥物中，菌株TJYG-420對阿奇霉素（AZM）、氯霉素（C）、奈替米星（NET）、哌拉西林（PIP）、慶大霉素（GM）、四環(huán)素類、喹諾酮類、硝基呋喃類以及頭孢類等藥物表現(xiàn)敏感，對甲硝唑（MTZ）、鏈霉素（S）、阿莫西林（AMX）和氨芐西林（AM） 4種藥物呈耐藥性。

2.6 組織病理分析

從圖3可以看出，與健康魚相比，感染魚表現(xiàn)出明顯的病理損傷?；疾∮佐~皮膚囊狀細胞增多，其細胞質(zhì)成分在中心形成一個嗜酸性團塊，與細胞膜分離，而杯狀細胞在健康魚體較多；病魚鰓小片上皮細胞增生、腫脹、肥大，部分鰓細胞空泡變性，毛細血管擴張；腸黏膜固有層零星，黏膜斷裂破損，部分絨毛脫落，黏膜層和結(jié)締組織松動；肝細胞空泡變性，局部壞死。

3 討論

生理生化特性分析是細菌鑒定的經(jīng)典方法，但是該方法很難區(qū)分同一科屬的不同種細菌，且試驗流程煩瑣，結(jié)果判定有一定的主觀性。近年來，分子鑒定在細菌的分類鑒定中發(fā)揮了重要作用。16S rRNA基因是細菌鑒定中最常用的分子靶標［12］，但是16S rRNA基因高度保守，對于同一屬內(nèi)的不同種難以很好地區(qū)分。研究表明，hsp60基因是一個編碼60 kDa熱休克蛋白的保守基因，其在同一屬的不同種之間表現(xiàn)出高度的序列多樣性［13］。因此，hsp60基因可用于快速、直接地從臨床標本中鑒定致病性弧菌物種。筆者擴增了菌株TJYG-420的16S rRNA和hsp60基因序列，Blast比對分析發(fā)現(xiàn)，菌株TJYG-420的16S rRNA和hsp60基因序列與V.harveyi菌株的相似性最高。

哈維氏弧菌作為水產(chǎn)養(yǎng)殖中主要病原，其自身攜帶的毒力基因與其致病性密切相關(guān)。該研究對青石斑魚致病過程起重要作用的毒力因子進行了研究。Yang等［14］從患病大黃魚中分離出的哈維氏弧菌中攜帶 chiA、vhh毒力基因；吳立婷等［15］研究表明，寧德地區(qū)54株哈維氏弧菌均攜帶toxR、vhhA、vhhB、luxR 4個毒力基因；Peeralil等［16］研究表明，哈維氏弧菌毒力基因主要分為6種基因型，以vhpA、flaB、ser、vhh、luxR、vopD、vcrD、vscN為主；有文獻數(shù)據(jù)顯示［3，17］，分離的哈維氏弧菌中vhh、luxR、chiA和toxR含量高于70%。分析結(jié)果顯示，菌株TJYG-420攜帶包括鞭毛結(jié)構(gòu)基因flaB、flaC，溶血素基因vhhA、vhhB，群體效應(yīng)基因luxR和幾丁質(zhì)酶基因chiA 6個毒力基因。以上研究表明，哈維氏弧菌不同分離株之間攜帶的毒力基因存在差異，這也解釋了哈維氏弧菌的不同分離株，其致病性存在較大的差異。

抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖中用于治療、控制和預防細菌性疾病，被視為水產(chǎn)養(yǎng)殖實踐中疾病管理的工具之一。不同來源地區(qū)、不同宿主的哈維氏弧菌株耐藥譜型存在差異。Shen等［18］研究發(fā)現(xiàn)，哈維氏弧菌對17種抗生素耐藥，僅對頭孢曲松、強力霉素和米諾環(huán)素3種抗生素敏感。Deng等［19］從中國患病龍膽石斑魚中分離的哈維氏弧菌對氨芐西林、利福平、四環(huán)素等13種抗生素表現(xiàn)出耐藥性。該研究結(jié)果顯示，菌株TJYG-420僅對氨芐西林、阿莫西林、鏈霉素、甲硝唑4種抗生素表現(xiàn)出耐藥性，與上述研究結(jié)果存在較大差異。這可能是由于菌株宿主、來源以及養(yǎng)殖過程中抗菌藥使用情況存在差異所致。目前，施用化學藥物仍是控制養(yǎng)殖魚類細菌性疾病的重要手段之一。鑒于不同分離株的哈維氏弧菌的耐藥性存在較大差異，對哈維氏弧菌的新分離株進行耐藥特性分析，可為精準防控由哈維氏弧菌引起的疾病提供直接的用藥參考。同時，為明確海水養(yǎng)殖魚類弧菌病原耐藥現(xiàn)狀分析提供可靠的參考依據(jù)。

魚類的第一道防線是由皮膚、鰓和腸道［20］等黏膜相關(guān)淋巴組織（MALT）組成。該研究中，感染菌株TJYG-420的石斑魚皮膚中囊狀細胞明顯增加，這種變化與Mohamad等［21］研究研究結(jié)果一致。囊狀細胞位于表皮的表層，在表皮損傷時釋放其內(nèi)容物導致酸性物質(zhì)增多，顏色加深。這些細胞產(chǎn)生的信號以信息素、毒素形式存在，并被認為是由血清素介導的。研究發(fā)現(xiàn)囊狀細胞還產(chǎn)生和分泌凝集素，凝集素可作為模式識別受體［22］。因此，囊狀細胞被認為與魚類免疫有關(guān)，有文獻報道，在活躍的寄生蟲感染期間，它們在魚類皮膚中的數(shù)量顯著增加了40倍［23-24］。哈維氏弧菌感染后，鰓小片上皮細胞表現(xiàn)為增生、腫脹、肥大，部分鰓細胞空泡變性，毛細血管擴張，這與許悅［25］的部分研究結(jié)果一致。腸道組織形態(tài)與其功能相適應(yīng)，其差異主要表現(xiàn)在黏膜層，其中黏膜褶皺的高低和疏密、上皮細胞的完整性和數(shù)量等方面影響了腸道性能［26］。哈維氏弧菌感染后，腸道黏膜褶皺形態(tài)發(fā)生皺縮或損傷直至脫落，這與Zhang等［2］研究發(fā)現(xiàn)擬態(tài)弧菌感染黃顙魚造成腸絨毛嚴重的變性和壞死脫落是一致的。而陳成等［27］病理結(jié)果顯示，腸絨毛黏膜層僅表現(xiàn)為水腫變性。由于肝臟的造血功能，貧血引起的代償性水腫可能會增加肝血管的通透性，增加肝組織中紅細胞的浸潤量［28］，這些病理損傷上的差異都暗示了不同菌株有著不同的致病機制。綜上所述，筆者推斷病原體的復雜病理過程導致了一系列感染水平的發(fā)生，并推測是這些病變導致了患病魚體多個組織器官的功能受損，進而使魚體逐漸喪失了正常的生理代謝功能，最終導致了其發(fā)病和死亡。

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