胡鯉萍,魏 嫻,蔡芳芳,林燕蕓,劉玲英
廈門長庚醫(yī)院,福建 廈門 361028
沙門菌是影響人類生態(tài)行為活動的重要傳染病病原菌之一,是引起感染性腹瀉的常見病原菌,其普遍存在于自然界中,主要通過食物和水源引起人類感染,能引起傷寒、副傷寒或非傷寒性疾病。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計,每年沙門菌感染的病例約有9 000 萬,其中死亡人數(shù)近15萬人[1-2]。沙門菌感染呈現(xiàn)明顯的季節(jié)分布[2],由于沙門菌血清型非常復(fù)雜,根據(jù)沙門菌O相抗原和H 相抗原的不同組合,WKLM 抗原表將沙門菌分為2 500 多個血清型[3],準(zhǔn)確對沙門菌血清分型就顯得尤為重要。目前,臨床上常用于治療沙門菌病的藥物主要為三代頭孢和氟荃喹諾酮類,但隨著這些抗生素的大量使用,世界各地均出現(xiàn)了大量三代頭孢和氟荃喹諾酮類耐藥的沙門菌[4-5],給臨床治療沙門菌病和食品安全帶來巨大壓力。本研究選取2021年廈門長庚醫(yī)院分離的沙門菌株進行血清學(xué)分型、藥物敏感性試驗及對β-內(nèi)酰胺和氟荃喹諾酮相關(guān)耐藥基因進行擴增、測序和分析,了解其流行狀況、病原學(xué)特征以及初步分析β-內(nèi)酰胺和氟荃喹諾酮的耐藥機制,為沙門菌病的防控及臨床科學(xué)用藥提供科學(xué)依據(jù),現(xiàn)將結(jié)果報告如下。
選取2021年1—12月廈門長庚醫(yī)院腹瀉病例糞便培養(yǎng)的沙門菌分離株,共計50株。
沙門、志賀菌屬瓊脂培養(yǎng)基(SS)平板、麥康凱平板、沙門菌血清(寧波天潤生物藥業(yè)有限公司,丹麥SSI)、VITEK 2 COMPACT 及配套的革蘭陰性菌(Gramnegative,GN)生化鑒定卡及藥敏卡(法國梅里埃GN13)。
1.3.1 菌株的鑒定 將腹瀉患者糞便標(biāo)本接種于SS和麥康凱平板上,置于35 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18~24 h,挑取疑似菌落,分離純化,并經(jīng)VITEK 2生化鑒定,符合沙門菌屬的進行后期實驗。
1.3.2 血清鑒定 根據(jù)WHO推薦的沙門菌O&H抗原標(biāo)準(zhǔn)化鑒定流程進行菌株血清型鑒定,并送至福建省疾病預(yù)防控制中心細(xì)菌室進行復(fù)核確認(rèn)。
1.3.3 藥敏實驗 沙門菌對13種抗菌藥物(氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢吡肟、氨曲南、厄他培南、亞胺培南、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、呋喃妥因和復(fù)方磺胺甲噁唑)的耐藥性由藥敏卡(法國梅里埃GN13)測定,折點判斷依據(jù)2019年美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)[6]。多重耐藥菌(MDR)定義:至少同時耐3種和(或)以上不同類型抗菌藥物。
1.4.1 模板制備 采用熱裂解法,挑取數(shù)個純菌培養(yǎng)的新鮮菌落于100 μL 純水中,制成懸濁液。100 ℃煮沸10 min,12 000 r /min離心3 min,取上清作為反應(yīng)模板,-20 ℃保存以備用。
1.4.2 聚合酸鏈反應(yīng)(PCR)反應(yīng)體系及條件 PCR 反應(yīng)總體積為20 μL,其中2×Taq PCR MasterMix (TaKaRa 公司)10 μL,上下游引物(10 μmoL /L )各1 μL,DNA 模板4 μL,dd H2O 4 μL。PCR 反應(yīng)程序: 95 ℃預(yù)變性5 min,然后95 ℃30 s,50~57 ℃30 s,72 ℃30~60 s,進行33個循環(huán),最后72 ℃延伸5 min。PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳條帶與目標(biāo)預(yù)計大小一致的送測序驗證。
2021 年醫(yī)院共分離沙門菌共50 株,均來源于臨床病例,其中男29例,女21例。1—12月各月份均有沙門菌檢出,其中,5—10 月份檢出率較高,呈現(xiàn)夏秋季節(jié)性分布特征,見圖1。
圖1 不同月份及性別病例分布情況
經(jīng)血清凝集O&H 抗原鑒定試驗及查White-Kauffmann表,50 株沙門菌共分為B、C1、C2-3、D、E1 五個血清群,9 個不同的血清型,其中以鼠傷寒沙門菌占比最高48.00%(24/50),其次為腸炎沙門菌14.00%(7/50),其他型別的沙門菌亦有少量檢出,見表1。
表1 50株沙門菌血清群/型分布特征
50 個檢出沙門菌病例的年齡分布在2 個月~90 歲之間,3歲以下兒童檢出率最高,為64.00%(32/50);3歲以下兒童中檢出最高的血清型為鼠傷寒沙門菌,占38.00%(19/50),其他各年齡段檢出的沙門菌血清型分布,見表2。
表2 不同年齡血清型分布情況株
50株沙門菌對氨芐西林(72.00%)、氨芐西林/舒巴坦(56.00%)、復(fù)方磺胺甲噁唑(36.00%)耐藥率較高;菌株多重耐藥(MDR)率為40.00%。對頭孢他啶(12.00%)、頭孢曲松(16.00%)、氨曲南(16.00%)、頭孢吡肟(4.00%)、環(huán)丙沙星(22.00%)、左氧氟沙星(12.00%)、呋喃妥因(8.00%)較為敏感;未發(fā)現(xiàn)對哌拉西林/他唑巴坦、亞胺培南、厄他培南耐藥的菌株,見表3。
表3 50株沙門菌的藥物敏感性特征
2.5.1 超廣譜β-內(nèi)酰胺酶TEM和CTX-M基因 50株沙門共檢出TEM 基因28 株,占總數(shù)的56.00%(28/50),28 株TEM基因陽性菌株均對氨芐西林耐藥,占氨芐西林耐藥菌株的77.78%(28/36)。CTX-M基因檢出數(shù)為8,占總數(shù)的16.00%(8/50),8 株檢出CTX-M 基因的菌株均對頭孢曲松和氨曲南耐藥,耐藥表型與耐藥基因型完全一致。另外,8 株檢出CTX-M 基因的菌株中5 株同時檢出TEM 基因。8 株CTX-M 基因測序結(jié)果在NCBI 比對表明,6 株為CTX-M-55型,2株為CTX-M-14型[7-10]。
2.5.2 喹諾酮耐藥區(qū)(QRDR)基因突變與質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥基因(PMQR)50株沙門中檢出喹諾酮類藥物耐藥決定區(qū)(QRDR)存在gyrA 和gyrA 兩個基因突變類型,檢出gyrA基因突變株8株,其中2株同時發(fā)生parC基因突變。該8株菌株均為環(huán)丙沙星和左氧氟沙星不敏感株,占環(huán)丙沙星不敏感表型的61.54%(8/13)。gyrA 基因突變位點分別為第83和87位氨基酸,突變氨基酸類型分別為2株Ser83Tyr、2 株Ser83Phe、2 株Asp87Tyr、2 株Asp87Asn 和2 株Asp87Gly,其中2 株同時發(fā)生Ser83Phe-Asp87Gly 及parC:Ser80Ile 雙突變。質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥基因(PMQR)aac(6')-Ib-cr,oqxA,oqxB 在50 株沙門菌中的檢出率分別為26.00% (13/50),12.00% (6/50)和12.00%(6/50),這些陽性基因在環(huán)丙沙星和左氧氟沙星耐藥株和敏感株中均有檢出[11-13]。
沙門菌是臨床和食品公共衛(wèi)生安全中常見的一種腸道食源性致病菌,可導(dǎo)致人類感染傷寒、副傷寒和急性腸胃炎等。據(jù)統(tǒng)計,我國70%~80%細(xì)菌性食物中毒均由沙門菌引起[14]。禽肉、蛋等食品污染是沙門菌感染的主要來源,隨著抗生素的大量使用和濫用,臨床分離株中也出現(xiàn)不同程度的耐藥,尤其是臨床治療沙門菌的兩類常用藥物三代頭孢和氟荃喹諾酮類,也出現(xiàn)了大量的耐藥菌株,為此,加強臨床沙門菌菌株的血清學(xué)分型、耐藥監(jiān)測及耐藥機制的研究就具有了重要意義。
本研究中回顧性分析樣本醫(yī)院分離的50株沙門菌株,共分離出5個血清群(B、C1、C2-3、D、E1),其中以B群為最大占比52.00%(26/50),B群中以鼠傷寒沙門菌24株為最常見分離株:而D群中主要以腸炎沙門菌為主要分離株,這與國內(nèi)其他學(xué)者研究一致[15-16]。本次分離的菌株中主要來源于3 歲以下,共分離到32 株(19 株鼠傷寒沙門菌、3 株腸炎沙門菌、3 株倫敦沙門菌、2 株斯坦利沙門菌、2株里森沙門菌、1株波茨坦沙門菌、1株紐波特沙門菌、1 株明斯特沙門菌);60 歲以上有4 株(2 株腸炎沙門、1株傷寒沙門菌、1株里森沙門菌);來源于3~60歲的有14株(2株里森沙門菌、4株鼠傷寒沙門菌、2株腸炎沙門菌、1株倫敦沙門菌、1株波茨坦沙門菌、1株紐波特沙門菌、2株肯塔基沙門菌、1株明斯特沙門菌)。這可能由于小于3歲以下兒童機體免疫系統(tǒng)尚處于發(fā)育過程中,對沙門菌抵抗能力比較差,而大于60歲老年人,往往由于基礎(chǔ)性疾病以及身體機能的下降,也對沙門菌抵抗不足,成為沙門菌主要的攻擊對象[15],為此應(yīng)加強嬰幼兒及老年人沙門菌的健康監(jiān)測,尤其在一些腹瀉病例中,應(yīng)加強沙門菌的分離培養(yǎng)。
本次分離的50 株菌株中,對氨芐西林的耐藥達72.00%(36/50)、對氨芐西林/舒巴坦達56.00%(28/50),而TEM 基因檢出28 株,占總數(shù)的56.00%(28/50),占氨芐西林耐藥菌株的77.78%(28/36),提示氨芐西林的耐藥主要可能由TEM 基因介導(dǎo)。部分氨芐西林耐藥株未檢出TEM基因,可能與其他如AmpC等耐藥基因有關(guān)。50株菌對頭孢曲松耐藥和氨曲南耐藥率為16.00%(8/50),這與CTX-M 基因的檢出率一樣,且其耐藥表型與耐藥基因型完全一致。這表明三代頭孢耐藥主要由CTX-M 基因介導(dǎo),這也與菌株對頭孢他啶耐藥較頭孢曲松較低符合,因為CTX-M 酶對頭孢他啶水解能力較頭孢曲松弱。測試菌株對環(huán)丙沙星和左氧氟沙星的耐藥率分別為22.00%(11/50)和12.00%(6/50),gyrA基因突變位點均為83位和87位氨基酸突變,這與陳晶等[5]在武漢社區(qū)沙門菌中檢出的突變一致。
另外,本研究檢出2株同時發(fā)生Ser83Phe-Asp87Gly和parC:Ser80Ile 的雙突變株,通常認(rèn)為雙重突變會介導(dǎo)高水平的喹諾酮耐藥,說明本地區(qū)已出現(xiàn)對喹諾酮高水平的耐藥,應(yīng)引起足夠的重視。所有菌株對哌拉西林/他唑巴坦、亞胺培南、厄他培南,均為敏感菌株,這與李美華等[16-17]的報道基本一致。近年來,沙門菌多重耐藥率越來越高,許多菌株呈現(xiàn)出不同的耐藥程度,甚至出現(xiàn)多耐藥現(xiàn)象,本研究分離的50 株菌株中也出現(xiàn)了20 株多重耐藥性菌株,達40.00%,這也提醒研究者在臨床分離的沙門菌存在比較嚴(yán)重的多耐藥現(xiàn)狀菌株,可能與患者在出現(xiàn)腹瀉后未及時就診而自行服用各種抗菌藥物及抗菌藥物有關(guān)[18-21]。
沙門菌感染是臨床常見的腹瀉病因之一,也是臨床比較棘手的問題。為預(yù)防因抗生素的濫用而導(dǎo)致臨床關(guān)注的多重耐藥超級細(xì)菌的出現(xiàn),臨床微生物檢驗科應(yīng)加強沙門菌分離培養(yǎng)、血清分型、耐藥監(jiān)測及耐藥機制研究,為控制沙門菌臨床指導(dǎo)提供依據(jù)。