劉小麗

食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《水果和蔬菜中阿維菌素殘留量的測(cè)定液相色譜法》（GB23200.19—2016）中介紹的檢測(cè)方法，前處理復(fù)雜，分析時(shí)間長(zhǎng)，且在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中容易出現(xiàn)回收率低、檢出限低、精密度差等問(wèn)題。本文討論了用液相色譜法檢測(cè)菠菜中阿維菌素時(shí)的一些問(wèn)題，這些問(wèn)題對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的回收率、穩(wěn)定性、檢出限、精密度會(huì)產(chǎn)生影響。針對(duì)上述問(wèn)題展開方法優(yōu)化與結(jié)果研討，方法改進(jìn)后，提高了檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性和精密度。

一、材料與方法

（一）儀器

電子分析天平、振蕩器、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、氮吹儀、渦旋混合器、固相萃取柱SPE C18、安捷倫1260高效液相色譜儀配紫外檢測(cè)器。

（二）試劑

丙酮（色譜純）、甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、乙酸乙酯（色譜純）。

（三）標(biāo)準(zhǔn)溶液

標(biāo)準(zhǔn)溶液由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所提供，質(zhì)量濃度均為100 μg·mL-1。檢測(cè)時(shí)，阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)工作液用甲醇稀釋至10.0 μg·mL-1。

（四）儀器工作條件

色譜柱為4.6 mm×125 mm安捷倫ODS-C18反相柱，流動(dòng)相為甲醇：水=90：10，流速為1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為245 nm，柱溫為40℃，進(jìn)樣量為20 μL。

二、結(jié)果與分析

（一）前處理?xiàng)l件優(yōu)化

試樣稱取20 g，用丙酮提取，濃縮后殘?jiān)?；用布氏漏斗抽濾，每個(gè)樣品需要清洗布氏漏斗，增加清洗工作量且易使樣品交叉污染；蔬菜、水果含水量比較高，40 ℃溫水旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至2 mL，濃縮到最后基本都是水。

1.樣品稱取量及提取溶劑、提取方法的選擇。試樣稱取20.0 g和10.0 g，分別選擇了乙腈、乙酸乙酯和丙酮3種提取溶劑。回收率與稱樣量沒(méi)有直接關(guān)系，三種提取溶劑回收率分別為 56.9%、89.2%、93.8%。選擇稱取試樣量10.0 g，丙酮作為提取劑。

參考有關(guān)阿維菌素的提取方法相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，分別采用了離心、高速勻漿、超聲三種提取方式。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇了超聲提取 30 min后，于 4500 r·min-1條件下離心 5 min，待凈化。

濃縮方法參考相關(guān)資料，分別比較了旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和氮吹。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，兩種濃縮方法回收率分別為79.4%、95.7%，氮吹回收率相對(duì)較高。

2.樣品凈化過(guò)程中沒(méi)有具體說(shuō)明如何完全將濃縮提取液轉(zhuǎn)入SPE C18柱。如果不潤(rùn)洗，回收率很低。本方法采用6 mL丙酮分3次潤(rùn)洗轉(zhuǎn)入SPE C18柱，再用5 mL的水淋洗，去掉淋洗液。最后用5 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，用氮?dú)獯抵两伞?/p>

（二）樣品制備和標(biāo)樣的添加

菠菜先切碎，再勻漿處理。在純菠菜漿中添加阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別添加質(zhì)量濃度至 0.005 mg·kg-1、0.01 mg·kg-1、0.1 mg·kg-1，每個(gè)濃度重復(fù) 6 次，待其平衡1 h后進(jìn)行樣品提取。

（三）樣品的提取、凈化

菠菜樣品稱取 10.0 g，加入10 mL丙酮溶液超聲提取 30 min，4500 r·min-1條件下離心5 min。取4 mL上清液于45℃條件下氮吹濃縮至2 mL，用6 mL丙酮分3次潤(rùn)洗轉(zhuǎn)入SPE C18柱，再用5 mL的水淋洗，去掉淋洗液。最后用5 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，用氮?dú)獯抵两?。?zhǔn)確加入1.0 mL甲醇溶解殘?jiān)瑴u旋振蕩1 min后靜置30 min，吸取上清液過(guò)0.22μm濾膜過(guò)濾，于進(jìn)樣小瓶中保存，供液相色譜測(cè)定。

（四）標(biāo)準(zhǔn)曲線

校準(zhǔn)曲線配制選擇10.0μg·mL-1阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)工作液，用甲醇做溶劑，配制5個(gè)濃度水平分別為0.005μg·mL-1、0.01μg·mL-1、0.05μg·mL-1、0.10μg·mL-1、0.20μg·mL-1 的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，配制完成后上機(jī)測(cè)定峰面積和保留時(shí)間。以峰面積為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖1）。標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為0.999 5以上，符合《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 ?食品理化檢測(cè)》（GB/T 27404—2008）標(biāo)準(zhǔn)要求。為加標(biāo)色譜圖農(nóng)藥殘留量回收率判定提供了較好的依據(jù)。

（五）方法的準(zhǔn)確性、精密度和檢出限

根據(jù)試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果表明，阿維菌素的保留時(shí)間為 32 min時(shí)峰形對(duì)稱性良好。以外標(biāo)法定量阿維菌素峰面積（y）與質(zhì)量體積濃度（x）呈良好線性相關(guān)，線性回歸方程為 y =5 7663x-14.334 ，相關(guān)系數(shù)（R2）為 0.999 5。

檢出限指用某一方法可定性檢測(cè)到樣品中殘留物的最小濃度，該水平信噪比一般為3 ，阿維菌素檢出限為 0.002 ng·μL-1 時(shí)靈敏度高。

定量限指可以對(duì)基質(zhì)中目標(biāo)殘留物進(jìn)行準(zhǔn)確定量測(cè)定的最低水平，在該水平下得到的回收率和精密度應(yīng)滿足分析的要求，添加標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度得到的信噪比一般為10，本試驗(yàn)添加回收率條件下，顯示阿維菌素峰形及重現(xiàn)性較好且無(wú)雜質(zhì)干擾，阿維菌素在菠菜中的定量限為 0.005 mg·kg-1，低于阿維菌素在菠菜中的最大殘留限量。

阿維菌素在菠菜中的平均回收率為 93.8%～97.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 5.5%～8.0%，添加濃度包含定量限，最大殘留限量值，添加濃度能覆蓋本殘留試驗(yàn)中所有樣品最高殘留量，且不同添加濃度均符合回收率要求，用回收率試驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差衡量檢測(cè)方法的精密度，不同添加濃度對(duì)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均符合要求（見表1）。

三、影響準(zhǔn)確度與精密度的原因及解決方法

（一）色譜柱

當(dāng)色譜柱污染后，峰面積會(huì)隨著測(cè)定次數(shù)的增加而增加，影響測(cè)定結(jié)果的RSD值。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要確保色譜柱的干凈程度，特別在進(jìn)行比對(duì)時(shí)，要用干凈的色譜柱。

（二）基質(zhì)效應(yīng)

同一種農(nóng)藥在不同蔬菜中有不同程度的基質(zhì)效應(yīng)，為了準(zhǔn)確定量，理論上每種基質(zhì)都需要制作對(duì)應(yīng)的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。為減少工作方法的工作量，在不影響結(jié)果準(zhǔn)確性的前提下，選擇一種有代表性的基質(zhì)作為通用基質(zhì)。

（三）注意事項(xiàng)

為保證數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，在操作過(guò)程中還要注意以下幾方面。

1.清液移取4 mL前，用該液潤(rùn)洗3次移液管，保證吸取刻度準(zhǔn)確。

2.氮吹時(shí)氣流大了容易把液體吹出造成損失，氣流太小氮吹時(shí)間延長(zhǎng)，影響回收率。氮吹近干要求小燒杯內(nèi)壁有潮潮的一層，吹干后回收率小。氮吹過(guò)程中要用干凈濾紙擦去針頭上的水珠，防止水珠落入瓶中氮吹不準(zhǔn)確，影響結(jié)果。

3. SPE C18柱使用前用 5 mL 甲醇和 5 mL 水活化，凈化時(shí)小柱不能干，當(dāng)溶劑液面到達(dá)柱吸附層表面時(shí)，立即倒入凈化溶液。小柱干了不容易洗脫，影響回收率。

四、結(jié)論

液相色譜法稱取試樣10 g，采用超聲提取，凈化濃縮處理后，采用高效液相色譜法測(cè)定阿維菌素的檢出限為 0.002 ng·μL-1，定量限為 0.005 mg·kg-1。樣品添加質(zhì)量濃度分別為0.005 mg·kg-1、0.01 mg·kg-1、0.1 mg·kg-1，每個(gè)濃度重復(fù) 6 次，添加回收率為 92.5%～96.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于7.2%。此方法試驗(yàn)步驟操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，經(jīng)添加回收率試驗(yàn)表明得出的回收率、重復(fù)性均滿足農(nóng)藥殘留分析的要求，適用于水果、蔬菜中阿維菌素的批量檢測(cè)。

（責(zé)任編輯 ? 程麗紅）