張新慧 陳鴻真

摘 ?要：本試驗(yàn)采用細(xì)菌分離培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)觀察、生化試驗(yàn)和PCR方法對(duì)采集的患呼吸道病死亡的仔豬鼻拭子、肺臟、胸腔積液等病料進(jìn)行副豬嗜血桿菌分離鑒定；采用人工感染小鼠試驗(yàn)和紙片擴(kuò)散法（Kirby-Bauer，簡(jiǎn)稱K-B法）分別檢測(cè)分離株的致病性和耐藥性。結(jié)果分離到1株副豬嗜血桿菌，并命名為HS-1株；分離株HS-1能引起小鼠發(fā)病與死亡，且死亡率為100％為致病性副豬嗜血桿菌；分離株HS-1對(duì)頭孢噻呋、頭孢噻肟、頭孢曲松等6種藥物敏感，對(duì)阿莫西林、氨芐西林、磺胺間甲氧嘧啶等8種藥物耐藥，以期為該地區(qū)仔豬副豬嗜血桿菌合理用藥及防控提供參考。

關(guān)鍵詞：副豬嗜血桿菌；致病性；藥敏試驗(yàn)；仔豬

中圖分類號(hào)：S855.1+2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-0769（2023）03-0056-04

副豬嗜血桿菌病是由副豬嗜血桿菌引起的豬的一種傳染性呼吸道疾病。該病常見臨床癥狀為纖維素性胸膜炎、呼吸困難及關(guān)節(jié)炎等；副豬嗜血桿菌病具有較高的感染率和致死率，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。在養(yǎng)豬生產(chǎn)過程中，副豬嗜血桿菌病可通過不同途徑感染不同年齡段的豬，尤其是4～8周齡仔豬，且經(jīng)常與豬圓環(huán)病毒病、豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征等免疫抑制性病毒病混合感染，導(dǎo)致動(dòng)物死亡加快，給臨床診斷帶來一定的困難[3-4]。

仔豬副豬嗜血桿菌病已經(jīng)成為多個(gè)國(guó)家和地區(qū)豬群中普遍流行的疾病之一，不同的國(guó)家與地區(qū)流行的仔豬副豬嗜血桿菌血清型具有差異性，導(dǎo)致疫苗制備存在一定的困難[5-6]。由于抗菌藥在臨床的廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致副豬嗜血桿菌產(chǎn)生了嚴(yán)重的耐藥性，給該病的臨床治療帶來了一定的困難，同時(shí)也嚴(yán)重危害著人們的健康[7]。

本試驗(yàn)通過細(xì)菌分離培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)觀察、生化試驗(yàn)和PCR方法對(duì)副豬嗜血桿菌進(jìn)行分離鑒定、致病性和耐藥性分析，以期為該地區(qū)仔豬副豬嗜血桿菌合理用藥及防控提供參考。

1 ?材料與方法

1.1 病料

2023年2月，采集某規(guī)?；i場(chǎng)中因呼吸道疾病致死的仔豬鼻腔、肺臟、胸腔積液等組織或黏液樣本4份。

1.2 細(xì)菌分離與培養(yǎng)

在無菌條件下，將采集的鼻拭子、肺臟、胸腔積液等病料樣本接種于巧克力培養(yǎng)基上，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱（5％CO2）培養(yǎng)12～18 h后，挑取培養(yǎng)基上單個(gè)的典型菌落，革蘭染色，置于顯微鏡下觀察其形態(tài)。

1.3 細(xì)菌生化特性鑒定

挑取培養(yǎng)基上典型菌落，接種于胰酪大豆胨（tryptone soy broth，TSB）液體培養(yǎng)基中。在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中震蕩培養(yǎng)12～18 h后，用無菌的TSB液體培養(yǎng)基將菌液濃度調(diào)整為0.5個(gè)麥?zhǔn)蠞岫?，按照革蘭陽性菌的生化試劑盒說明書對(duì)分離菌株進(jìn)行生化試驗(yàn)鑒定。

1.4 細(xì)菌PCR鑒定

參照杜炎斌等[4]報(bào)道的方法，設(shè)計(jì)副豬嗜血桿菌分離株鑒定引物。引物序列為F1：5'-TACGGCTACCTTGTTTTG-3'；F2：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGG-3'，由深圳華夫基因股份有限公司合成，提取分離株HS-1的基因組DNA，以提取的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR鑒定。

1.5 致病性試驗(yàn)

在無菌條件下，挑取巧克力培養(yǎng)基上單個(gè)的典型菌落，接種于TSB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，利用菌落計(jì)數(shù)法對(duì)HS-1株進(jìn)行計(jì)數(shù)，用TSB液體培養(yǎng)基將菌液濃度調(diào)整至107 CFU/mL。攻毒組和對(duì)照組分別為5只昆明系小鼠，攻毒組小鼠腹腔注射劑量為0.25 mL/只，對(duì)照組小鼠腹腔注射0.25 mL/只TSB液體培養(yǎng)基，在試驗(yàn)期間觀察小鼠發(fā)病情況，并對(duì)死亡小鼠進(jìn)行細(xì)菌學(xué)鑒定，試驗(yàn)期為6 d。

1.6 藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）的要求對(duì)分離株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)和耐藥性結(jié)果判斷。

2 ?結(jié)果

2.1細(xì)菌分離培養(yǎng)

疑似副豬嗜血桿菌的HS-1株在巧克力培養(yǎng)基上培養(yǎng)，利用革蘭染色鏡檢觀察其形態(tài)學(xué)（圖1）。HS-1株培養(yǎng)特性和形態(tài)學(xué)與《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》中報(bào)道的副豬嗜血桿菌的培養(yǎng)特性和形態(tài)學(xué)基本一致。

2.2 細(xì)菌生化鑒定結(jié)果

生化特性結(jié)果顯示，HS-1株硝酸鹽還原酶、接觸酶為陽性，分解葡萄糖、果糖；氧化酶試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、脲酶試驗(yàn)、甲基紅（Methyl red，MR）試驗(yàn)及Voges-Proskauer（VP）試驗(yàn)為陰性，不分解甘露醇。與《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》中報(bào)道的副豬嗜血桿菌的生化特性基本一致，HS-1株生化特性鑒定結(jié)果為副豬嗜血桿菌。

2.3 細(xì)菌PCR鑒定

對(duì)分離的HS-1株進(jìn)行PCR鑒定。結(jié)果顯示，PCR擴(kuò)增出大約為822 bp的目的條帶（圖2）。對(duì)HS-1株的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，其測(cè)序結(jié)果與GenBank中的副豬嗜血桿菌基因序列同源性為98.9％～99.0％，表明HS-1株為副豬嗜血桿菌。

2.4 致病性試驗(yàn)

攻毒組的5只小鼠在攻毒后2～3 d出現(xiàn)了精神沉郁、采食量減少、呼吸困難等臨床癥狀，攻毒的小鼠相繼出現(xiàn)死亡，第6天5只小鼠全部死亡，對(duì)照組小鼠無臨床癥狀，健康存活。剖檢攻毒組小鼠，采集病料組織，分離得到了副豬嗜血桿菌。致病性試驗(yàn)結(jié)果表明，HS-1分離株為致病性副豬嗜血桿菌。

2.5耐藥性分析

采用紙片擴(kuò)散法（Kirby-Bauer，簡(jiǎn)稱K-B法）檢測(cè)HS-1株對(duì)常用抗菌藥的耐藥性，判定結(jié)果為耐藥（R）、敏感（S）、中敏（I）（表1）。

由表1可知，分離的HS-1株對(duì)頭孢噻呋、頭孢噻肟、頭孢曲松、多西環(huán)素、替米考星、氟苯尼考6種藥物敏感；對(duì)阿莫西林、氨芐西林、磺胺間甲氧嘧啶、多黏菌素、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、大觀霉素、林可霉素8種藥物耐藥。說明分離的HS-1株對(duì)臨床中常用的藥物具有不同的耐藥性。

3 討論

近幾年，隨著規(guī)?；B(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，豬的飼養(yǎng)量呈現(xiàn)逐年增多的趨勢(shì)，但副豬嗜血桿菌病作為養(yǎng)豬業(yè)常見的傳染性疾病，可感染不同年齡段的豬，尤其是仔豬，具有發(fā)病急、高死亡率等特點(diǎn)，嚴(yán)重危害著我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展[1-4]。副豬嗜血桿菌廣泛存在于飼養(yǎng)環(huán)境中，可以通過多種途徑在不同豬群之間傳播，尤其是豬免疫力下降時(shí)更容易引發(fā)副豬嗜血桿菌病[7-8]。本試驗(yàn)從患呼吸道病死亡的仔豬鼻拭子、肺臟、胸腔積液等病料中分離得到1株致病性副豬嗜血桿菌HS-1株，通過藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離株HS-1對(duì)頭孢噻呋、頭孢噻肟、頭孢曲松等6種藥物敏感，對(duì)阿莫西林、氨芐西林、磺胺間甲氧嘧啶等8種藥物耐藥。說明分離的副豬嗜血桿菌對(duì)常用抗菌藥產(chǎn)生嚴(yán)重的耐藥性。因此，在臨床防治副豬嗜血桿菌中應(yīng)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，選擇敏感的藥物進(jìn)行交替使用，應(yīng)注意副豬嗜血桿菌病的疫苗免疫，同時(shí)配合環(huán)境的消毒，提高其治療效果。

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