李紅 林鷙 何錫忠 ，林月霞 呂玉華 彭麗英

摘 ?要：利用牛腎（Madin-Darby bovine kidney，MDBK）細(xì)胞對(duì)上海市崇明區(qū)某羊場(chǎng)的痂皮病例進(jìn)行病毒分離，獲得一株羊口瘡病毒（orf virus，ORFV），命名為ORFVSH-01。參考NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中ORFV的保守基因B2L的序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序。結(jié)果表明：接種病料懸液的MDBK細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變，成功分離到毒株；經(jīng)PCR擴(kuò)增和測(cè)序，分離的毒株為ORFV，命名為ORFVSH-01。

關(guān)鍵詞：羊口瘡病毒；分離鑒定；PCR

中圖分類(lèi)號(hào)：S815 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? ? ? 文章編號(hào)：1001-0769（2023）03-0066-04

羊傳染性膿皰口炎，又稱(chēng)羊口瘡，是由羊口瘡病毒（orf virus，ORFV）引起山羊、綿羊以及中小反芻動(dòng)物的一種接觸性、嗜上皮性傳染病，也是一種人畜共患病，可感染綿羊、山羊、大角羊、巖羚羊、駱駝、麝香牛、鹿和人，1～ 3月齡的羔羊更易感，以口唇、舌、鼻、乳房、蹄及外陰等部位形成丘疹、膿皰、水皰及結(jié)成疣狀結(jié)痂為特征，嚴(yán)重影響病羊的采食和吸乳，會(huì)繼發(fā)或混合感染其他的病原微生物，最終導(dǎo)致羔羊死亡[1-2]。該病發(fā)病率50％，死亡率較高，常呈群發(fā)性流行，嚴(yán)重影響?zhàn)B羊業(yè)發(fā)展。近年來(lái)，該病在世界各地呈不斷上升趨勢(shì)，感染的宿主范圍在逐漸擴(kuò)大[3]，對(duì)人類(lèi)健康也構(gòu)成了威脅，引起了國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究人員的廣泛關(guān)注[4]。

ORFV屬于痘病毒科脊椎動(dòng)物痘病毒亞科副痘病毒屬成員，是一種具有囊膜的雙鏈DNA病毒，全基因組長(zhǎng)135.0～148.1 kb，可編碼多種蛋白。其中B2L基因全長(zhǎng)1 137 bp，是一個(gè)重要的保護(hù)性抗原基因，可以刺激機(jī)體產(chǎn)生良好免疫反應(yīng)[5-6]。研究表明，不同國(guó)家或地區(qū)分離到的ORFV的基因差異較大，不同分離株基因組長(zhǎng)度有10～25 kb的差異，致病性也存在較大差異，造成市場(chǎng)上現(xiàn)售的疫苗對(duì)一些感染變異株的羊群免疫保護(hù)效果不佳。

我國(guó)新疆、西藏、甘肅、內(nèi)蒙、吉林、四川、云南、陜西等地對(duì)該病都有過(guò)報(bào)道。2019年11月，上海市某羊場(chǎng)的羊疑似發(fā)病，口唇和舌頭處發(fā)生潰瘍、生瘡，有的已形成痂皮或疣狀病變。該羊場(chǎng)曾免疫羊傳染性膿皰口炎弱毒疫苗，因此該場(chǎng)羊群的發(fā)病率雖然較高，但死亡率較低。根據(jù)羊群的臨床特征和分子生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果，診斷為羊口瘡。本試驗(yàn)通過(guò)病料接種細(xì)胞獲得致病毒株，并對(duì)羊傳染性膿皰口炎病毒進(jìn)行了鑒定。

1 材料

1.1 細(xì)胞與病料

牛腎（Madin-Darby bovine kidney，MDBK）細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。病料為上海市崇明區(qū)某羊場(chǎng)疑似患羊口瘡山羊的唇部痂皮。

1.2 主要試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基、小牛血清、胰酶為Gibco公司提供；Premix Taq?、DNA Marker DL2000購(gòu)自TaKaRa公司；病毒DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自天根生物科技有限公司。

1.3 病毒

PCR陽(yáng)性對(duì)照病毒購(gòu)自山東泰豐生物制品有限公司的羊口瘡病毒疫苗毒株。

1.4 主要儀器

主要儀器有Retiga 2000R高敏感度冷CDD熒光數(shù)碼顯微鏡（日本OLYMPUS公司）、GeneAmp PCR System 9700擴(kuò)增儀（美國(guó)Applied Biosytems公司）、紫外凝膠成像系統(tǒng)（法國(guó) Vilber Lourmat公司）、DYY-6C型電泳儀（北京市六一儀器廠(chǎng)）。

2 ?試驗(yàn)方法

2.1 病料處理

取病羊唇部痂皮，用PBS緩沖液 ? ? （0.01 mol/L）反復(fù)沖洗幾次，用無(wú)菌剪刀剪碎，加入少量PBS緩沖液進(jìn)行研磨，加入青霉素和鏈霉素（終濃度1％），用PBS緩沖液將研磨液稀釋為懸液，于－70 ℃反復(fù)凍融3次后，5 000 r/min 離心10 min，取上清液，用孔徑0.22 μm的濾器過(guò)濾，獲病料懸液置于－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 病毒分離

MDBK細(xì)胞用含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)至狀態(tài)良好，待細(xì)胞鋪滿(mǎn)細(xì)胞瓶單層，接種2.1中處理好的病料懸液1 mL，置于37 ℃、5％CO2培養(yǎng)箱中吸附1 h，加入含2％小牛血清的DMEM維持液9 mL，置于37 ℃、5％CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀(guān)察細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞形態(tài)的變化，同時(shí)設(shè)未接毒細(xì)胞為陰性對(duì)照。當(dāng)75％細(xì)胞圓縮時(shí)收毒，－20 ℃凍融3次，收集病毒液，于－70 ℃保存。若細(xì)胞在接種病料后5 d內(nèi)未出現(xiàn)病變，則連續(xù)盲傳3代，直到細(xì)胞出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變，收集病毒液置于－70 ℃保存，繼續(xù)傳代；若盲傳3代后無(wú)細(xì)胞病變則棄之。

2.3 病毒純化

將2×DMEM（含4％胎牛血清）放入37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)預(yù)熱；將3％瓊脂在水浴鍋中溶解后放入43 ℃燒杯水中預(yù)熱。將病毒液做10倍稀釋?zhuān)磸?0-1稀釋至10-7，從10-3至10-7每個(gè)稀釋度的稀釋液中各取1 mL，依次加到6孔板中，每個(gè)稀釋度一孔，設(shè)未接毒細(xì)胞為對(duì)照組；37 ℃培養(yǎng)1～2 h，棄病毒吸附液，用無(wú)血清的DMEM洗滌2次。取10 mL瓊脂和10 mL DMEM等量混合，每孔加入2 mL瓊脂與DMEM培養(yǎng)基混合液；37 ℃孵育，最低稀釋度出現(xiàn)蝕斑時(shí)，收集蝕斑；用500 μL PBS溶解， －70 ℃凍融細(xì)胞3次，收集病毒液，提取病毒DNA，進(jìn)行PCR鑒定。取陽(yáng)性的蝕斑連續(xù)傳6代，并將各代次病毒液分別凍存于－70 ℃。

2.4 引物設(shè)計(jì)與合成

參照文獻(xiàn)[14]對(duì)羊口瘡病毒的B2L基因設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，由生工生物工程（上海）有限公司合成。上游引物：5'-ATGTGGCCGTTCTCCTC-3'，下游引物：5'-TTAATTTATTGGTTTGCAGAACT-3'。

2.5 病毒PCR鑒定

按照病毒DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)，分別從疫苗毒株、病料懸液的上清液和第1～6代傳代細(xì)胞病毒液中提取DNA。以提取的病毒基因組DNA為模板擴(kuò)增目的片段，PCR反應(yīng)體系為：2×Premix Taq? 25 μL、上下游引物各 ? ? 2 μL、DNA模板6 μL、ddH2O 15 μL，反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、53 ℃ 30 s、72 ℃ 90 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。取6 μL PCR產(chǎn)物在8 g/L瓊脂糖凝膠上電泳，對(duì)擴(kuò)增出目的條帶的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。

3 ?結(jié)果

3.1 病毒分離

將病料懸液接種MDBK細(xì)胞后，第1代細(xì)胞未出現(xiàn)病變，72 h后收毒并盲傳第2 代，從第2代開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)胞病變，病變出現(xiàn)時(shí)間在48 h左右，傳到第6代時(shí)細(xì)胞病變時(shí)間變得有規(guī)律，細(xì)胞病變出現(xiàn)時(shí)間在40 h左右，表現(xiàn)為：胞核濃縮、變圓、團(tuán)聚、拉網(wǎng)，最后脫落，未接毒的陰性對(duì)照細(xì)胞表現(xiàn)正常，詳見(jiàn)圖1。將該病毒分離株命名為ORFVSH-01。

3.2 病毒純化

病毒液稀釋至10-4時(shí)接種細(xì)胞，第一代細(xì)胞出現(xiàn)蝕斑，繼續(xù)傳代至第6代，隨著傳代次數(shù)的增加，蝕斑的出現(xiàn)更加有規(guī)律，病毒液稀釋至10-6時(shí)接種細(xì)胞均出現(xiàn)蝕斑。

3.3 PCR檢測(cè)及測(cè)序結(jié)果

以陰性對(duì)照（未接毒正常細(xì)胞）、陽(yáng)性對(duì)照（疫苗毒株）和分離毒株（第6代蝕斑）分別提取的病毒基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，擴(kuò)增出1 137 bp左右的目的片段（圖2）。測(cè)序序列經(jīng)NCBI核酸序列比對(duì)后，顯示與ORFA核酸序列同源性最高，說(shuō)明分離的病毒為ORFV。

4 ?結(jié)論

ORFV可以用不同的原代細(xì)胞或傳代細(xì)胞系進(jìn)行培養(yǎng)。原代細(xì)胞以初生羔羊睪丸細(xì)胞和初生羔羊腎細(xì)胞為主，牛腎細(xì)胞系被認(rèn)為是病毒分離和傳代培養(yǎng)常用的細(xì)胞系[7]。ORFV的B2L基因序列高度保守，有文獻(xiàn)報(bào)道，不同來(lái)源的羊口瘡病毒B2L基因僅有個(gè)別堿基存在差別，因此，B2L基因常用于鑒定ORFV[5-6]。本試驗(yàn)采用MDBK細(xì)胞對(duì)羊唇部結(jié)痂進(jìn)行病毒分離，經(jīng)過(guò)6代純化獲得了純化病毒，通過(guò)對(duì)ORFV的B2L基因的擴(kuò)增、測(cè)序，證明從羊唇部結(jié)痂中分離到的毒株為ORFV，將其命名為ORFVSH-01。

疫苗免疫接種是預(yù)防羊傳染性膿皰口炎的主要手段，常用的有弱毒疫苗和滅活疫苗。隨著病毒毒力的返強(qiáng)、病毒變異株的出現(xiàn)，羊傳染性膿皰口炎在各地羊群中呈暴發(fā)性流行，給養(yǎng)羊業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。ORFVSH-01毒株的獲得為今后羊口瘡疫苗研制打下了良好的基礎(chǔ)，為該病的防控提供了技術(shù)保障。

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