劉 影，張 睿，楊 雪，鄧加加，徐 鋒，2

(1 貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽 550000；2 貴州中醫(yī)藥大學(xué)薏苡仁資源與開發(fā)研究中心，貴州 貴陽 550000)

薏苡仁為禾本科植物薏苡Coixlacrma-jobiL.var.mayuen(Roman.)Stapf的干燥成熟種仁，現(xiàn)代研究表明，薏苡仁除了能夠降血糖、抗炎鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)腸胃和機(jī)體免疫功能外，其主要的化學(xué)成分更是包含有抗腫瘤、抗癌、抗腫瘤、抗病毒、抗菌、鎮(zhèn)痛、抗氧化等活性成分[1-6]，在臨床上對(duì)多種惡性腫瘤、婦科疾病、各種炎癥、免疫力低下等具有明顯的治療作用[7]。因此，對(duì)于薏苡仁藥材化學(xué)成分的研究也在不斷的深入當(dāng)中。關(guān)于薏苡仁酯類成分的抗腫瘤作用研究，最早出現(xiàn)在1961年，英國學(xué)者從薏苡仁中第一次分離出薏苡仁酯并推測(cè)其為薏苡仁抗腫瘤的主要化學(xué)成分[8]，后面陸續(xù)從薏苡仁中分離出的無羈萜、白茅素、圣草素等也使得薏苡仁藥材發(fā)展更進(jìn)一步[9-10]。

對(duì)于薏苡仁質(zhì)量控制方面的技術(shù)大都采用分光光度法、紅外光譜法、色譜法、生物效價(jià)法等[11-14]。關(guān)于中藥材或中藥制劑的優(yōu)劣評(píng)價(jià)、真?zhèn)舞b別、物種區(qū)分方面的相關(guān)技術(shù)，普遍采取中藥指紋圖譜，該法是一種綜合的、可量化的鑒定手段，能夠較大程度的保證中藥材、中藥制劑等在質(zhì)量控制研究當(dāng)中的優(yōu)良性、真實(shí)性、穩(wěn)定性、一致性等。目前針對(duì)薏苡仁的相關(guān)文獻(xiàn)關(guān)注點(diǎn)都主要集中在脂溶性成分，而少有對(duì)薏苡仁藥材整體質(zhì)量的一個(gè)控制、評(píng)價(jià)和比較。本研究將針對(duì)黔產(chǎn)野生和家種薏苡仁藥材建立HPLC指紋圖譜，意在通過指紋圖譜分析比較兩者之間的一個(gè)差異，用于二者之間的鑒別，以期為二者臨床用藥提供參考。

1 材 料

1.1 儀 器

高速粉碎機(jī)，浙江屹立工貿(mào)有限公司；JP2-160電子天平，日本；藥匙；稱量紙；具塞錐形瓶；玻璃漏斗；濾紙，杭州富陽北木漿紙有限公司；蒸發(fā)；DHS0260超聲波清洗機(jī)，天津奧泰；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州越新儀器制造有限公司；玻璃棒；2 mL容量瓶；一次性注射器；0.22 μm有機(jī)相濾；高液小瓶；Waters高效液相色譜儀(E2695)。

1.2 試劑與藥材

分析冰醋酸，重慶川東化工有限公司；色譜甲醇，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；色譜乙腈，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；哇哈哈純凈水；薏苡素對(duì)照品(批號(hào)：J26GB152842)、甘油三油酸酯對(duì)照品(MUST-2008 2001)，上海源葉生物科技有限公司；10批市面收集的產(chǎn)地貴州的薏苡仁；10批采自貴州的野生薏苡仁。具體來源見表1和表2。

表2 黔產(chǎn)家種薏苡仁藥材來源

1.3 薏苡仁藥材的產(chǎn)地來源

實(shí)驗(yàn)所用的野生和家種薏苡仁均來自于貴州省的幾個(gè)不同產(chǎn)地，經(jīng)鑒定詳細(xì)情況見表1，表2。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Waters Diamonsil Plus 5 μm C18(250 mm×4.6 mm)色譜柱，乙腈(A)-0.05%乙酸水 洗脫系統(tǒng)梯度洗脫(0～40 min，5%～30%A；40～55 min，30%～40%A；55～65 min，40%～70%A；65～85 min，70%～100%A；85～87 min，100%～5%A)，流速0.1 mL·min-1，柱溫設(shè)置為30 ℃，檢測(cè)波長254 nm，進(jìn)樣量為20 μL。

2.2 供試品溶液的制備

精密稱定薏苡仁樣品粉末1.0 g于具塞錐形瓶中，加入50 mL甲醇，超聲提取0.5 h，濾過于蒸發(fā)皿中，置65 ℃水浴鍋上揮干，揮干剩下物質(zhì)加甲醇溶解并定容至2 mL，用有機(jī)相微孔濾膜(0.22 μm)濾過，取續(xù)濾液1.5～2 mL于高液小瓶中，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn)

取薏苡仁供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下給出的色譜方法連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，以13號(hào)峰為參照峰，測(cè)得共有峰與參比峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均<3.0%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn)

取薏苡仁藥材6份，按“2.2”項(xiàng)下的操作制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，測(cè)得其各共有峰與參比峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均<3.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按“2.1”項(xiàng)下方法分別在0、4、8、16、32、64 h進(jìn)樣，測(cè)定薏苡仁供試品溶液，其各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3.0%，表明樣品溶液在室溫下64 h內(nèi)穩(wěn)定，足以滿足穩(wěn)定性要求

2.4 指紋圖譜的建立

按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定10批黔產(chǎn)家種薏苡仁樣品與10批黔產(chǎn)野生薏苡仁樣品，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果建立薏苡仁的UPLC指紋圖譜，見圖1、圖2、圖3和圖4。家種薏苡仁選擇了以保留時(shí)間約32.851的峰為參照峰S，共確立了26個(gè)共有峰；野生薏苡仁選擇了以保留時(shí)間約24.637的峰為參照S，確立了23個(gè)共有峰。并對(duì)各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積進(jìn)行了計(jì)算，見表3和表4。

圖1 10批黔產(chǎn)野生薏苡仁的HPLC對(duì)照指紋圖譜

圖2 10批黔產(chǎn)野生薏苡仁的HPLC對(duì)照指紋圖譜

圖3 10批黔產(chǎn)家種薏苡仁的HPLC對(duì)照指紋圖譜

圖4 10批黔產(chǎn)家種薏苡仁的HPLC指紋圖譜

表3 10批野生薏苡仁藥材UPLC指紋圖譜共有峰相對(duì)保留時(shí)間

表4 10批野生薏苡仁藥材UPLC指紋圖譜共有峰相對(duì)面積

2.5 相似度評(píng)價(jià)

將收集的10批黔產(chǎn)家種薏苡仁和10批黔產(chǎn)野生薏苡仁藥材的圖譜導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》2012年版相似度軟件，進(jìn)行相似度的評(píng)價(jià)，具體相似度見表5和表6。

表5 10批家種薏苡仁藥材UPLC指紋圖譜共有峰相對(duì)保留時(shí)間

表6 10批家種薏苡仁藥材UPLC指紋圖譜共有峰相對(duì)面積

在對(duì)收集到的10批黔產(chǎn)家種和10批黔產(chǎn)野生薏苡仁藥材的HPLC指紋圖譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，10批黔產(chǎn)家種薏苡仁的相似度在0.852～0.994，10批黔產(chǎn)野生薏苡仁的相似度為0.808～0.983。從二者的指紋圖譜中可以明顯的看出二者指紋圖譜的不一樣，其中就包括二者共有峰的個(gè)數(shù)和分布情況。

3 討 論

3.1 提取方式的考察

在對(duì)薏苡仁的處理上，分別采用了乙腈-二氯甲烷(65∶35)、石油醚、乙酸乙酯和甲醇作為溶劑，利用超聲和回流的提取方式，結(jié)果表明，在用甲醇作為提取溶劑，超聲30 min的條件下，對(duì)藥材中各成分的提取效果較好，且色譜峰的數(shù)量也較多。

3.2 色譜條件的考察

本研究依次對(duì)甲醇-水、乙腈-0.05%乙酸水和甲醇-0.05%乙酸水等流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)在乙腈-0.05%乙酸水的條件下其每個(gè)峰的分離度較好。考察不同的流速(0.8、1.0 mL·min-1)和柱溫(25、30 ℃)對(duì)色譜峰分離度的影響，發(fā)現(xiàn)流速1.0 mL·min-1，柱溫30 ℃的色譜峰分離度良好。

3.3 檢測(cè)波長的選擇

按“2.1”色譜條件對(duì)黔產(chǎn)家種和野生薏苡仁進(jìn)行了多波長掃描檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在254 nm波長處，各峰的分離度良好，基線較平穩(wěn)，吸收較大且所出的峰個(gè)數(shù)較多，特此選擇254 nm作為檢測(cè)波長。

3.4 黔產(chǎn)家種和野生薏苡仁的差異

本研究分別建立了10批黔產(chǎn)家種和10批黔產(chǎn)野生薏苡仁藥材的HPLC指紋圖譜，結(jié)果表明10批黔產(chǎn)家種薏苡仁的相似度在0.852～0.994，10批黔產(chǎn)野生薏苡仁的相似度為0.808～0.983，二者各自的相似度均較高。對(duì)黔產(chǎn)野生薏苡仁和家種薏苡仁指紋圖譜進(jìn)行比較，可以明顯發(fā)現(xiàn)兩者的色譜峰個(gè)數(shù)和共有峰峰面積均存在較大差異，家種的共有峰為26個(gè)，野生的則只有23個(gè)，在整體共有峰的分布上來說，家種薏苡仁的共有峰以保留時(shí)間60 min為界，在保留時(shí)間60 min后仍發(fā)現(xiàn)約11個(gè)共有峰出現(xiàn)，且分布較密集，峰面積亦較大，野生薏苡仁在約60 min所出現(xiàn)的峰則只有4個(gè)，且分布較均勻，峰面積較前者亦更小。我們推測(cè)黔產(chǎn)野生薏苡仁相較于黔產(chǎn)家種薏苡仁來說，其藥材內(nèi)共有成分較少，可能與其生長環(huán)境有較大的聯(lián)系。由上可知HPLC液相指紋圖譜可用于黔產(chǎn)野生和家種薏苡仁的識(shí)別，可為兩者的深入研究提供一定的參考。