趙帥帥,顏 諾,李曉貴,吳起才,周學(xué)亮

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟大血管外科,南昌 330006)

肺動(dòng)脈高壓(pulmonary hypertension,PH)是由肺動(dòng)脈壓力進(jìn)行性升高所引起的一系列嚴(yán)重的心血管疾病,其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)逐年上升[1-2]。PH的發(fā)病機(jī)制與遺傳、環(huán)境和生物學(xué)等多個(gè)因素有關(guān),然而,PH的病因尚未被完全闡明。因此,探索PH發(fā)病的細(xì)胞基礎(chǔ)和分子機(jī)制,探索新的治療靶點(diǎn)對(duì)其臨床治療具有重大的意義。隨著RNA修飾領(lǐng)域的研究不斷取得進(jìn)展,代謝和表觀遺傳學(xué)之間的串?dāng)_在基因表達(dá)、細(xì)胞增殖和分化中起的關(guān)鍵作用逐漸清晰。特別是N6-甲基腺苷(m6A)修飾因其在調(diào)控基因表達(dá)和細(xì)胞命運(yùn)決定過程中發(fā)揮的重要作用受到了人們的廣泛關(guān)注。RNA m6A修飾可能與PH的形成有關(guān),并且m6A結(jié)合蛋白YTHDF2在該過程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。為了更好地認(rèn)識(shí)這些新發(fā)現(xiàn),本綜述將對(duì)m6A修飾、YTHDF2和EGFR在PH發(fā)病機(jī)制中的作用進(jìn)行系統(tǒng)性的介紹和探討。

1 PH的研究現(xiàn)狀

PH的主要組織病理學(xué)特征是血管壁的重塑,包括內(nèi)膜增生、中膜肥厚、外膜纖維化和細(xì)胞外基質(zhì)沉積,這些變化綜合導(dǎo)致了肺動(dòng)脈管腔進(jìn)行性狹窄、閉塞,肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(pulmonary arterial endothelial cells,PAECs)、肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)在該病理過程中具有重要作用,PASMCs的過度增殖是肺動(dòng)脈重構(gòu)的主要特征[3]。

PH的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,涉及多種生物學(xué)過程,包括血管活性分子分泌、離子通道調(diào)節(jié)、凋亡抵抗、氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥和免疫失調(diào)等[4]。目前正在被研究的參與PH疾病發(fā)生的信號(hào)通路包括MAPK/MK2通路、Hippo-YAP/PI3K/AKT通路、NF-κB/TNF-α通路、Src/EGFR/NOX2通路、AK4/HIF-1α通路、EGFR/ERK通路、SEDT2/METTL14通路、METTL3/YTHDF2/PTEN通路和Notch通路等[3-11]。

PH的治療方案包括一般治療、藥物治療和手術(shù)治療。其中,一般治療主要指活動(dòng)和康復(fù)指導(dǎo),抗凝藥物、利尿劑和心血管活性藥物治療,氧氣治療,改善貧血和補(bǔ)鐵治療以及社會(huì)心理支持等。藥物治療則包括鈣通道阻滯劑(calcium channel blockers,CCB)、內(nèi)皮素受體拮抗劑(endothelin receptor antagonists,ERA)、5-磷酸二酯酶抑制劑、鳥苷酸環(huán)化酶激動(dòng)劑(guanylate cyclase stimulators,sGC)、前列環(huán)素類似物和前列環(huán)素受體激動(dòng)劑[12]。以上藥物雖然可以改善PH患者的癥狀,但其長(zhǎng)期預(yù)后仍然較差,病死率較高。因此,新藥物和治療方案的研發(fā)成為PH研究中的重點(diǎn)領(lǐng)域。

2 EGFR在PH中的作用

表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)是一種酪氨酸激酶受體,由細(xì)胞外配體結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶受體結(jié)構(gòu)域組成,對(duì)包括細(xì)胞增殖和血管生成在內(nèi)的多種生物過程起重要調(diào)節(jié)作用[6]。有研究[9]表明人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(human pulmonary microvascular endothelial cells,hPMVECs)增殖依賴于EGFR的激活。增殖的PMVECs釋放多種生長(zhǎng)因子和趨化因子,包括精氨酸酶-2(arginase-2,Arg-2)、血小板源性生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor,PDGF)、趨化因子(C-X-C chemokine ligand12,CXCL12)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(fibroblast growth factor 2,FGF2)、巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)和內(nèi)皮素-1(endothelin-1,ET-1)[13],這些因子共同促進(jìn)PASMCs增殖和肺血管重構(gòu)[14]。另有研究[15]證明來自PH患者的PASMCs比來自健康人的對(duì)生長(zhǎng)因子更敏感,EGFR過度表達(dá)是導(dǎo)致PH患者PASMCs過度增殖的重要原因。同時(shí),免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到在缺氧和野百合堿 (monocrotaline,MCT) 誘導(dǎo)的PH模型中的肺血管壁EGFR表達(dá)增加,主要分布在PASMCs中。

有研究表明[16]EGFR促進(jìn)泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)化,并加速以平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞積累為特征的動(dòng)脈粥樣硬化病變。有研究者[17]證實(shí)缺氧導(dǎo)致了核蛋白亞細(xì)胞分布的改變,顯著促進(jìn)了EGFR信號(hào)的激活,EGFR的磷酸化修飾增強(qiáng)了血管細(xì)胞對(duì)Ca2+的敏感性,導(dǎo)致血管收縮作用增強(qiáng)以及肺血管重構(gòu)發(fā)生發(fā)展[18]。而注射EGFR抑制劑可以改善MCT誘導(dǎo)的PH大鼠的肺動(dòng)脈重構(gòu)[17-18]。上述研究結(jié)果表明EGFR的異常激活是PASMCs、PMVECs增殖、遷移和存活的重要原因,因此,EGFR信號(hào)通路的正常轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)肺血管功能的維持十分重要,也是治療PH的潛在靶點(diǎn)。

EGFR可以激活下游細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)[19],ERK是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族成員,ERK/MAPK信號(hào)通路已被證明對(duì)多種細(xì)胞的生存和增殖過程至關(guān)重要。缺氧處理誘導(dǎo)EGFR激活導(dǎo)致ERK的磷酸化,從而促進(jìn)細(xì)胞增殖[9]。同時(shí)磷酸化的ERK可以激活缺氧誘導(dǎo)因子-1(Hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)[20],HIF-1是一種由α亞基和β亞基組成的異二聚體轉(zhuǎn)錄因子。激活后的HIF-1α亞基積累并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核,與HIF-1β結(jié)合形成異源二聚體,激活并轉(zhuǎn)錄與能量代謝、細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞外基質(zhì)重組有關(guān)的基因[21]。HIF-1的過表達(dá)也將促進(jìn)PASMCs增殖和肺血管重構(gòu)[22]。綜上所述,EGFR激活是PASMCs增殖和肺血管重構(gòu)過程中的關(guān)鍵信號(hào)。

3 m6A修飾及其結(jié)合蛋白調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性

RNA修飾包括甲基化、磷酸化、乙?；然瘜W(xué)修飾,N6-甲基腺苷(m6A)修飾是真核生物mRNA中最豐富的堿基修飾,mRNA的m6A修飾與多種細(xì)胞過程密切相關(guān)[23]。m6A主要分布于mRNA的開放閱讀框(ORF)[24-25]、3′-非翻譯區(qū)(UTRs)和終止密碼子附近[26]。mRNA甲基化修飾受甲基轉(zhuǎn)移酶、去甲基化酶以及甲基化結(jié)合蛋白的動(dòng)態(tài)調(diào)控以維持基因的正常表達(dá),其中所涉及的調(diào)控因子有:甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物METTL3 /METTL14/WTAP,其中METTL3是核心酶,METTL14在體內(nèi)與METTL3形成穩(wěn)定的異二聚體,WTAP可以與METTL3和METTL14形成復(fù)合物重新組裝成泛甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物,共同催化m6A甲基化。去甲基化酶ALKBH5和FTO負(fù)責(zé)催化去甲基化作用,m6A結(jié)合蛋白識(shí)別mRNA的目標(biāo)區(qū)域并與之結(jié)合以實(shí)現(xiàn)相應(yīng)的功能(詳見表1)[27]。

表1 m6A調(diào)節(jié)因子在RNA代謝中的功能

m6A結(jié)合蛋白的YTH結(jié)構(gòu)域由134個(gè)氨基酸組成[28],YTH結(jié)構(gòu)域蛋白包括YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1和YTHDC2,YTHDC蛋白通常局限于細(xì)胞核,而YTHDF蛋白主要存在于細(xì)胞質(zhì)中,已有證據(jù)[29]表明它們調(diào)控mRNA的加工、翻譯和降解過程。YTHDF1通過與翻譯起始因子和核糖體相互作用來增強(qiáng)翻譯;YTHDF2通過與靶mRNA結(jié)合,促進(jìn)其降解;YTHDF3與YTHDF1和YTHDF2相互作用[27],協(xié)助調(diào)控mRNA的翻譯和降解。m6A結(jié)合蛋白相互作用,共同控制細(xì)胞內(nèi)RNA的穩(wěn)定、剪切和翻譯,從而影響基因表達(dá)調(diào)節(jié)和相關(guān)疾病的發(fā)生。m6A的失調(diào)可導(dǎo)致腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病、心血管疾病和代謝性疾病的發(fā)生和發(fā)展,如何維持上述分子表達(dá)和功能水平處于穩(wěn)態(tài),是預(yù)防血管異常增生和血壓升高的關(guān)鍵。

4 m6A結(jié)合蛋白YTHDF2對(duì)EGFR mRNA的調(diào)控

m6A修飾在細(xì)胞中的作用是通過多種機(jī)制介導(dǎo)的,通過影響mRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)、降解、翻譯和代謝,參與多種病理生理過程。在干細(xì)胞中,m6A修飾通過改變mRNA的穩(wěn)定性,調(diào)節(jié)干細(xì)胞的分化[25]。已有研究[3,10]證明m6A修飾影響PH病理生理過程中多個(gè)特定基因的表達(dá)水平,METTL3、METTL14參與調(diào)節(jié)PASMCs增殖和肺血管重構(gòu)。在哺乳動(dòng)物YTH蛋白家族中,YTHDF2已被證明通過CCR4-NOT復(fù)合物的去烯基化[30],或HRSP12-RNaseP/MRP7-9復(fù)合物來破壞mRNA穩(wěn)定性[31],從而影響細(xì)胞的自我更新和分化過程。在細(xì)胞質(zhì)內(nèi),YTHDF2在正常和應(yīng)激條件下促進(jìn)了m6A依賴的mRNA的降解[32]。

近期研究[28-30]表明m6A及其結(jié)合蛋白YTHDF2均參與PH的發(fā)生發(fā)展,并影響EGFR mRNA水平,進(jìn)而影響疾病進(jìn)展。值得注意的是,m6A結(jié)合蛋白YTHDF2可以選擇性地識(shí)別和結(jié)合m6A修飾的RNA,并對(duì)相關(guān)基因的mRNA轉(zhuǎn)錄和降解發(fā)揮關(guān)鍵作用。在YTHDF2的干預(yù)下,EGFR mRNA的轉(zhuǎn)錄水平和穩(wěn)定性發(fā)生了變化,這影響了PH的發(fā)病過程。LI等[16]的研究也表明m6A介導(dǎo)了EGFR mRNA降解,從而導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙。另有一項(xiàng)肝癌研究[33]的數(shù)據(jù)也顯示YTHDF2通過結(jié)合EGFR 3′-UTR的m6A修飾位點(diǎn),加速EGFR的降解來抑制ERK/MAPK通路和細(xì)胞增殖,影響肝癌的進(jìn)展。

研究已經(jīng)表明在PH模型的PASMCs、PMVECs中EGFR過表達(dá)[9,15],EGFR mRNA的穩(wěn)定性受m6A級(jí)聯(lián)反應(yīng)的調(diào)控。筆者的研究團(tuán)隊(duì)據(jù)此推測(cè),EGFR mRNA在PMVECs的胞質(zhì)中生成并獲得m6A修飾,在缺氧環(huán)境中YTHDF2表達(dá)上調(diào),影響EGFR mRNA的穩(wěn)定性,而EGFR磷酸化后可以激活ERK/MAPK通路,誘使HIF-1α轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核與HIF-1β結(jié)合形成異源二聚體,通過旁分泌方式分泌細(xì)胞因子促進(jìn)PAECs增殖,并促使PAECs分泌ET-1,ET-1被PASMCs攝入并內(nèi)化后,通過調(diào)控其細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度和下游靶基因mRNA和蛋白的表達(dá),調(diào)控PASMCs的增殖、凋亡等細(xì)胞過程,參與PH的病理變化(機(jī)制流程示意見圖1)。

圖1 YTHDF2通過調(diào)控EGFR mRNA 影響PH發(fā)展的機(jī)制假設(shè)

5 總結(jié)與展望

PH是一種進(jìn)行性加重的心血管疾病,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量,目前無法根治。RNA的m6A修飾參與了PH發(fā)病機(jī)制的調(diào)控,YTHDF2作為m6A“讀取器”蛋白家族的主要成員之一,通過調(diào)控EGFR mRNA的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄水平來影響PH的發(fā)生和發(fā)展,因此,探討m6A結(jié)合蛋白YTHDF2對(duì)EGFR mRNA的調(diào)控機(jī)制對(duì)PH治療有著重要的意義。

PASMCs和PAECs的過度增殖和凋亡抵抗直接導(dǎo)致了PH患者的肺血管重構(gòu),EGFR在其中的作用不可忽視。YTHDF2/EGFR參與調(diào)控細(xì)胞凋亡、增殖、遷移等過程,很可能通過與ERK/MAPK、HIF-1α、ET-1、Ca2+等因子相互作用,構(gòu)成了一個(gè)多通路、多層次的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò),介導(dǎo)了肺血管重構(gòu)的發(fā)生。關(guān)于EGFR在各種疾病中作用的研究?jī)H揭開了其機(jī)制的冰山一角,而對(duì)PH中EGFR角色的研究才剛剛開始。