白藜蘆醇治療潰瘍性結(jié)腸炎的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究及實驗驗證

曹劉菁，吳與倫，張欣然，魏麗慧，沈阿靈，3，彭軍，陳友琴

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點實驗室，福建 福州 350122；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新與轉(zhuǎn)化中心，福建 福州 350122；4.美國凱斯西儲大學(xué)醫(yī)學(xué)院，俄亥俄州 克利夫蘭 44106）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種慢性非特異性腸道炎癥性疾病，是引起結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)腸癌的高危因素［1］。早期防治UC對降低結(jié)腸癌的發(fā)病率具有重要意義。中醫(yī)藥在治療UC中優(yōu)勢顯著，療效確切，抗炎效果明顯［2］。臨床常用中藥虎杖、桑白皮、土茯苓等具有抗炎作用［3-5］，白藜蘆醇是三者重要的活性成分，研究證實白藜蘆醇具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫等作用［6］，可減輕UC患者的炎癥［7-8］，但其治療UC的作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步探討。本研究擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究探討白藜蘆醇治療潰瘍性結(jié)腸炎的相關(guān)機(jī)制并開展體內(nèi)實驗驗證，以期闡明白藜蘆醇治療UC的新機(jī)制和新靶點，為臨床治療UC藥物的研發(fā)提供更多的思路和方向。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 6～8周齡SPF級雄性C57BL/6小鼠18只，體質(zhì)量（21±3 g）購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心屏障系統(tǒng)，使用許可證號：SYXK（閩）2020-0002。

1.2 實驗藥物的配制 通過文獻(xiàn)調(diào)研，小鼠按照100 mg/（kg/d）的劑量經(jīng)口服給藥。白藜蘆醇加入蒸餾水配置成25 mg/mL的混懸液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 實驗試劑 白藜蘆醇（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：501-36-0）；葡聚糖硫酸鈉（DSS）（美國MP Biomedicals公司，批號：0216011080-100 g），便血（OB）試劑（珠海貝索生物技術(shù)有限公司，批號：BA2020B）；蘇木素溶液、伊紅溶液、4%多聚甲醛固定液（北京Solarbio公司，批號：G1140、G1100、LA0427）；Western blot及IP細(xì)胞裂解液、ECL發(fā)光試劑盒、PMSF（南京碧云天公司，批號：P0013、P0018、P0100）；PhosSTOPTM（德國Roche公司，批號：4906837001）；蛋白Marker、BCA蛋白定量試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司，批號：26617、23225）；PVDF膜（德國Millipore公司，批號：ISEQ 00010）；PI3K、p-Akt、Akt抗體（美國Cell Signaling Technology公司，批號：4257、4060、4691）；GAPDH抗體（中國Abbkine公司，批號：ABL1021）。

1.4 實驗儀器 自動脫水機(jī)與石蠟包埋機(jī)（湖北孝感亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司）；全自動石蠟切片機(jī)、DM4000B顯微鏡（德國Leica公司）；組織研磨機(jī)（上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司）；Western blot電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、化學(xué)成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

2 實驗方法

2.1 UC疾病靶點的收集 在DisGenet（http：//www.disgenet.org/）數(shù)據(jù)庫中，輸入“ulcerative colitis”為檢索詞，搜集UC的相關(guān)靶點。

2.2 白藜蘆醇作用靶點預(yù)測 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺（TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php）、Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）、SymMap（http：//www.symmap.org/）、BATMANTCM（http：//bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）中獲取白藜蘆醇對應(yīng)的蛋白靶點，在Unitprot數(shù)據(jù)庫（http：//www.Unitprot.org/）中查找蛋白統(tǒng)一的基因名，以此對檢索得到的蛋白進(jìn)行校正，從而獲得白藜蘆醇的作用靶點，去掉重復(fù)項后，與UC的作用靶點相映射，得到白藜蘆醇治療UC的共同靶點，即為白藜蘆醇治療UC的潛在靶點。

2.3 GO和KEGG富集分析 將預(yù)測的作用靶點導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）中進(jìn)行GO（gene ontology）生物學(xué)過程富集分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）信號通路富集分析，得到并保存結(jié)果。以P＜0.001為篩選條件，并且依據(jù)富集基因數(shù)的大小進(jìn)行排序，選擇KEGG通路富集分析中排名前20的通路及GO分類富集分析中排名前10的通路，采用R-Studio軟件中的ggplot2來繪制氣泡圖。

2.4 構(gòu)建靶點相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò) 將白藜蘆醇治療UC的作用靶點導(dǎo)入STRING網(wǎng)絡(luò)平臺，物種選擇“homo sapiens”，置信度設(shè)定＞0.9，獲取靶點的相互作用關(guān)系的信息表格。通過Cytoscape 3.7.2軟件繪制潛在靶點PPI網(wǎng)絡(luò)，同時對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，確定白藜蘆醇治療UC的核心靶點。

2.5 小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型的構(gòu)建 通過周期性的自由飲用2%葡聚糖硫酸鈉（DSS）溶液建立慢性UC模型，以21 d為1個周期循環(huán)，第1～7天給予2% DSS溶液讓小鼠自由飲用，DSS溶液每2天更換1次，第8～21天更替為蒸餾水，重復(fù)2個周期，第43～49天繼續(xù)自由飲用2% DSS溶液7天［9］，第50天取材。

2.6 分組與干預(yù) 將18只C57BL/6小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為對照組、模型組和白藜蘆醇組，每組6只。采用“2.5”所示造模法構(gòu)建慢性UC模型，造模的同時對小鼠進(jìn)行給藥處理，造模期間白藜蘆醇組給予100 mg/（kg/d）混懸液經(jīng)口服給藥。對照組和模型組經(jīng)口服給予等體積的蒸餾水。

2.7 疾病活動指數(shù)（disease activity index，DAI）評分計算 造模期間觀察小鼠的體質(zhì)量、大便的性狀及便血情況，參照J(rèn)ACKSON等［10］的評估標(biāo)準(zhǔn)，計算DAI評分。同時記錄小鼠體質(zhì)量變化，制作百分比統(tǒng)計圖，體質(zhì)量均與給藥第1天比較［11-12］。

2.8 組織取材與結(jié)腸長度測量 小鼠先經(jīng)由2%異氟烷麻醉，之后脫頸處死小鼠，在冰上采集結(jié)腸組織（從肛門到回盲部為結(jié)腸位置），將其分離后拍照、測量，隨后將其剪為3段，將靠近肛門的第1段浸泡于4%多聚甲醛中固定，剩余組織保存至-80 ℃超低溫冰箱。

2.9 結(jié)腸組織病理學(xué)檢測 取材后的結(jié)腸組織，4%的多聚甲醛溶液固定24 h后，經(jīng)過脫水、透明、浸蠟處理后進(jìn)行包埋，并將組織切成4 μm的薄片，用載破片承載后烘烤6 h，將其脫蠟至水，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，鏡下觀察并拍照。

2.10 組織病理學(xué)評分 使用光學(xué)顯微鏡觀察HE染色的組織切片并拍照分析，按照表1所示的評分標(biāo)準(zhǔn)從4個方面評估結(jié)腸組織病理情況，將每個部分評分相加得到的總分即為組織病理學(xué)評分。

表1 組織病理學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)

2.11 結(jié)腸組織Western blot檢測 取材后的結(jié)腸組織樣本加入適量的裂解液，置于組織研磨機(jī)上研磨，充分裂解后離心，收集上清，采用BCA法測定蛋白的總濃度，按相同質(zhì)量的蛋白量進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用封閉液室溫封閉1 h。將其置于p-Akt（1∶1 000）、Akt（1∶1 000）、PI3k（1∶1 000）和GAPDH（1∶5 000）一抗中，4 ℃搖床過夜，用含0.2% Tween的TBST洗膜15 min，加入相對應(yīng)的二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，TBST洗膜15 min，隨后滴加1∶1的ECL發(fā)光液，用Bio-Rad凝膠成像儀器掃描成像。

2.12 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計量資料服從正態(tài)分布以（）表示，2組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，3組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 白藜蘆醇治療UC的潛在靶點 采用DisGenet數(shù)據(jù)庫檢索疾病靶點，得到UC疾病靶點1 458個，TCMSP數(shù)據(jù)庫，Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫、Sym-Map數(shù)據(jù)庫、BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫中獲取白藜蘆醇作用靶點358個。將白藜蘆醇作用靶點與UC疾病靶點相映射，獲得白藜蘆醇可能作用于UC的潛在靶點127個，見圖1。

圖1 白藜蘆醇潛在靶點

3.2 GO功能富集分析 運(yùn)用DAVID數(shù)據(jù)庫對白藜蘆醇治療UC的潛在靶點進(jìn)行GO功能富集分析，通過設(shè)定P＜0.001的指標(biāo)，并根據(jù)富集基因數(shù)的大小進(jìn)行排序，整理出排名前10項。GO富集功能分析顯示涉及生物過程（biological process，BP）272個，包括藥物反應(yīng)、凋亡過程的負(fù)調(diào)控、衰老、對外界刺激的反應(yīng)、基因表達(dá)、凋亡過程的正調(diào)控、細(xì)胞遷移的正調(diào)控、缺氧反應(yīng)及過氧化氫反應(yīng)等，見圖2。細(xì)胞組分（cellular component，CC）28個，包括高分子復(fù)合物、細(xì)胞質(zhì)、胞質(zhì)溶膠、細(xì)胞外液、膜性小腔、膜筏、細(xì)胞表面、細(xì)胞外區(qū)、細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)膜等，見圖3。分子功能（molecular function，MF）40個，包括酶結(jié)合、相同蛋白質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、血紅素結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合等，見圖4。

圖2 白藜蘆醇生物過程分析

圖3 白藜蘆醇細(xì)胞組分分析

圖4 白藜蘆醇分子功能分析

3.3 KEGG通路分析 采用 DAVID 數(shù)據(jù)庫對交集靶點進(jìn)行KEGG通路分析，共得到131條通路，以P＜0.001作為篩選條件，依據(jù)富集基因數(shù)的大小進(jìn)行排序，篩選得到了排名前20的通路。這些交集靶點主要富集在PI3K-Akt信號通路、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、乙型肝炎、糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE通路、TNF信號通路等通路。見圖5。

圖5 KEGG信號通路富集分析結(jié)果（前20名）

3.4 潛在靶點PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 將白藜蘆醇治療UC的127個潛在靶點蛋白錄入到STRING數(shù)據(jù)庫中，構(gòu)建蛋白相互作用PPI網(wǎng)絡(luò)，得到127個節(jié)點，2 627條相互作用關(guān)系。使用Cytoscape 3.7.2軟件對PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪制，節(jié)點度值的均值為41.37，≥均值的節(jié)點有59個；節(jié)點介數(shù)中心性的均值為0.006 044，≥該介數(shù)中心性2倍中位數(shù)的節(jié)點有35個。共有30個節(jié)點的度值和介數(shù)中心性均高于均值，包括Akt1、TNF、IL-6、TP53、STAT3、IL-1B、MAPK3和PTGS2等，這些靶點即為白藜蘆醇的核心靶點。見圖6。

圖6 白藜蘆醇核心靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)

3.5 白藜蘆醇對UC小鼠體質(zhì)量的影響 對照組小鼠正常飼養(yǎng)，體質(zhì)量增加；與對照組相比，模型組小鼠體質(zhì)量顯著降低（P＜0.05）；與模型組小鼠相比，白藜蘆組小鼠體質(zhì)量顯著升高（P＜0.05）。見圖7。

圖7 白藜蘆醇對UC小鼠體質(zhì)量的影響

3.6 白藜蘆醇對UC小鼠DAI評分的影響 3組小鼠取材前的DAI評分結(jié)果顯示，對照組小鼠DAI評分為0分。與對照組比較，模型組小鼠的DAI評分顯著提高（P＜0.05）；與模型組比較，白藜蘆醇組小鼠DAI評分顯著下降（P＜0.05）。見圖8。

圖8 白藜蘆醇對UC小鼠DAI評分的影響

3.7 白藜蘆醇對UC小鼠結(jié)腸長度的影響 與對照組比較，模型組小鼠結(jié)腸的長度明顯縮短（P＜0.05）；與模型組比較，白藜蘆醇組小鼠結(jié)腸的長度的縮短明顯緩解（P＜0.05）。見圖9。

圖9 白藜蘆醇對UC小鼠結(jié)腸長度的影響

3.8 白藜蘆醇對UC小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)的影響 對照組小鼠結(jié)腸的黏膜完整，腺體排列規(guī)則，未發(fā)現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤，病理組織學(xué)評分為0分。與對照組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)紊亂，腺體排列不規(guī)則，出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤，病理組織學(xué)評分顯著增加（P＜0.05）。與模型組比較，白藜蘆醇組小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)趨向正常，腺體排列趨向整齊，炎性細(xì)胞浸潤情況明顯減輕，病理組織學(xué)評分明顯降低（P＜0.05）。見圖10。

圖10 白藜蘆醇對UC小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)損傷的影響

3.9 白藜蘆醇對UC小鼠結(jié)腸組織中PI3K、p-Akt、Akt蛋白的影響 與對照組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織蛋白中p-Akt/Akt比率明顯升高（P＜0.05），PI3K蛋白表達(dá)升高。與模型組比較，白藜蘆醇組小鼠結(jié)腸組織蛋白p-Akt/Akt比率明顯下降（P＜0.05），PI3K蛋白表達(dá)降低。見圖11。

圖11 白藜蘆醇對UC小鼠結(jié)腸組織中PI3K、p-Akt、Akt蛋白的影響

4 討 論

白藜蘆醇具有多種生物活性，可緩解UC癥狀，本研究通過TCMSP、BATMAN-TCM、Swiss Target Prediction、SymMap、DisGenet等多個數(shù)據(jù)庫的挖掘，篩選并確定白藜蘆醇可能作用于UC的潛在靶點127個。通過KEGG通路分析，富集到PI3K/Akt信號通路、HIF-1信號通路、FOXO信號通路等信號通路。戰(zhàn)晶玉等［13］發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt信號通路活化后對其下游mTOR的活化有促進(jìn)作用，從而調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡、炎癥因子的分泌和腸道炎癥反應(yīng)來治療UC。楊顯娟等［14］研究結(jié)果證實，PI3K/Akt通路活化后可通過調(diào)控Bcl-2和cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá)，影響細(xì)胞凋亡，從而影響UC的進(jìn)展。PAZMANDI等［15］研究表明，HIF是缺氧應(yīng)激應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄因子，HIF-1α在炎癥性腸病（IBD）發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，影響先天性和適應(yīng)性腸道免疫，它的普遍激活通過STAT3的活性增加RORγt的表達(dá)和FOXP3的抑制來促進(jìn)Th17的極化，從而促進(jìn)分泌促炎細(xì)胞因子IL-17、IFN-γ、TNF-α和TNF-β，隨后通過刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1、IL-6、IL-8、IL-12和IL-18進(jìn)而促進(jìn)炎癥的發(fā)生，此外HIF-1α活化可增強(qiáng)糖酵解和葡萄糖攝取，促進(jìn)炎癥反應(yīng)［16］。WANG等［17］研究表明，F(xiàn)OXOs轉(zhuǎn)錄激活或抑制下游靶基因，在增殖、凋亡、自噬、代謝、炎癥、分化和抗應(yīng)激等方面發(fā)揮重要作用。FOXO4的整體缺失可加劇結(jié)腸炎對炎癥刺激的反應(yīng)，另外FOXO轉(zhuǎn)錄因子可介導(dǎo)部LPS誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子表達(dá)，其中FOXO1通過增強(qiáng)成熟巨噬細(xì)胞中由TLR4介導(dǎo)的對LPS的信號傳導(dǎo)來促進(jìn)炎癥。

通過構(gòu)建白藜蘆醇治療UC的潛在靶點PPI網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)Akt1、TNF、IL-6、TP53、STAT3和PTGS2等核心靶點。研究證實，Akt1可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化，活化的Akt可以促進(jìn)NF-κB的磷酸化，促進(jìn)TNF-α等炎性因子的轉(zhuǎn)錄，造成細(xì)胞因子失衡，從而調(diào)控炎癥反應(yīng)［18］。在腸黏膜中，TNF-α和IL-6的活化可促進(jìn)NF-κB的活化，隨后通過正反饋調(diào)節(jié)進(jìn)一步增加IL-6及TNF-α的分泌，由此發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)，不斷擴(kuò)大炎癥過程［19］。p53可以通過抑制NF-κB的活化抑制體內(nèi)炎癥的發(fā)生［20］；也可通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞在M1方向的極化，抑制體內(nèi)廣泛的促炎基因的表達(dá)而發(fā)揮抗炎的作用，在炎癥性腸病等慢性炎癥向癌癥的轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用［21］。STAT3是IL-10下游的轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)慢性腸道疾病，STAT3的激活可以刺激抗炎特性基因的表達(dá)，抑制促炎基因的表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮抗炎作用［22］。前列腺素-內(nèi)過氧化物合酶2（PTGS2）是一種在炎癥反應(yīng)中具有特殊作用的關(guān)鍵基因，在腸上皮細(xì)胞和單核細(xì)胞中表達(dá)，對結(jié)腸黏膜愈合過程至關(guān)重要［23］，另外PTGS2 mRNA水平升高是細(xì)胞鐵死亡的關(guān)鍵特征［24］，有助于UC的發(fā)展。

本研究體內(nèi)實驗結(jié)果提示白藜蘆醇可明顯改善慢性UC小鼠體質(zhì)量下降、結(jié)腸長度縮短、DAI評分升高等狀況；在病理學(xué)研究中，白藜蘆醇干預(yù)后的小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)評分顯著降低；Western blot檢測證實白藜蘆醇干預(yù)后，小鼠結(jié)腸組織中PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達(dá)降低，這些結(jié)果提示我們白藜蘆醇可能通過調(diào)控PI3K/Akt通路發(fā)揮治療UC的作用。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討白藜蘆醇治療UC的分子機(jī)制，通過體內(nèi)實驗驗證白藜蘆醇可能通過調(diào)控PI3K/Akt信號通路緩解UC，為臨床治療UC藥物的研發(fā)提供了思路和方向。本研究僅對PI3K/Akt這一信號通路進(jìn)行了探索研究，未來可對網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選的其他通路進(jìn)一步驗證。