周虹 李蘭 劉文娥 陳鎮(zhèn) 鄧桂明 何陽 肖小芹

〔摘要〕 目的 探討暖巢煲調控卵巢線粒體功能治療化療性早發(fā)性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency， POI）損傷小鼠，為其臨床應用提供科學依據(jù)。方法 從40只8周齡雌性C57BL/6小鼠中抽取8只為空白組，其余構建POI模型。將成功建模的32只小鼠隨機分為模型組、暖巢煲低劑量組、暖巢煲中劑量組、暖巢煲高劑量組，每組8只。模型組、空白組予0.01 mL/g生理鹽水灌胃。觀察小鼠的一般狀況、體質量和動情周期變化，給藥3周后，稱取各組小鼠卵巢濕質量，計算卵巢指數(shù)。ELISA法檢測各組小鼠血清抗米勒管激素（anti-Müllerian hormone， AMH）水平，HE染色觀察卵巢組織形態(tài)學變化，透射電鏡觀察線粒體的形態(tài)和結構，Western blot檢測視神經(jīng)萎縮蛋白1（optic atrophy 1， OPA1）和PTEN誘導假定激酶1（PTEN-induced putative kinase 1， PINK1）的表達水平。結果 與空白組比較，模型組進食量減少、毛色枯燥;體質量增長率下降（P<0.05）;卵巢指數(shù)明顯下降（P<0.01）;動情周期紊亂;血清AMH下降（P<0.05）;各級生長卵泡減少、閉鎖卵泡明顯增加;線粒體結構破壞嚴重、空洞化明顯;OPA1及PINK1蛋白表達水平明顯下調（P<0.01）。與模型組比較，暖巢煲高、中、低劑量組體質量增長率上升（P<0.05）;暖巢煲中、低劑量組卵巢指數(shù)增加;動情周期逐漸規(guī)律;暖巢煲中、高劑量組血清AMH上升（P<0.05），小鼠的卵母細胞線粒體結構明顯改善，OPA1及PINK1蛋白表達明顯上調（P<0.01）。結論 線粒體功能障礙可能是小鼠卵巢功能不全的機制之一，而暖巢煲能夠調節(jié)卵巢線粒體功能，改善早發(fā)性卵巢不全，可能與其通過促進線粒體自我更新的動力過程有關。

〔關鍵詞〕 早發(fā)性卵巢功能不全;暖巢煲;線粒體;視神經(jīng)萎縮蛋白1;PTEN誘導假定激酶1;抗米勒管激素

〔中圖分類號〕R271.9? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2023.06.008

〔Abstract〕 Objective To discuss the clinical efficacy of Ovary-Warming Pot （OWP） on premature ovarian insufficiency （POI） mice by regulating ovarian mitochondrial function and to provide a scientific basis for its clinical application. Methods Eight of 40 8-week-old female C57BL/6 were selected as blank group， and the rest were used to establish the POI models. Then 32 successfully modeled mice were randomly divided into model group， low-， medium- and high-dose OWP groups， with 8 mice in each group. The model group and blank group were given 0.01mL/g normal saline by gastric lavage. The general condition， body weight， and estrous cycle of mice were observed. After 3 weeks of administration， the wet ovarian weight of mice in each group was weighed to calculate the ovarian index. The serum anti-Müllerian hormone （AMH） level was determined by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）， the morphological changes of ovarian tissue were observed by hematoxylin-eosin （HE） staining， and the morphology and structure of mitochondria were observed by transmission electron microscopy. Western blot was used to determine the expression levels of optic atrophy 1 （OPA1） and PTEN-induced protein kinase 1 （PINK1）. Results Compared with blank group， the mice in model group had less food intake and dull hair color; their growth rate of body mass was lower （P<0.05）; the ovarian index was significantly lower （P<0.01）; the estrous cycle was disordered; the serum AMH was lower （P<0.05）; the growth follicles at all levels decreased， while atresia follicles increased significantly; the mitochondrial structure was seriously damaged， with obvious cavitation; the expression levels of OPA1 and PINK1 were significantly down-regulated （P<0.01）. Compared with model group， the growth rates of body mass in high-， medium- and low-dose OWP groups were higher （P<0.05）; the ovarian indexes in medium- and low- dose OWP groups were higher， and the estrus cycle became regular gradually; the serum AMH in medium- and high- dose OWP groups was significantly higher （P<0.05）， the mitochondrial structure of mice oocytes was significantly improved， and the OPA1 and PINK1 protein expressions were significantly up-regulated （P<0.01）. Conclusion Mitochondrial dysfunction may be one of the mechanisms leading to ovarian insufficiency in mice. However， OWP can regulate mitochondrial function and improve premature ovarian insufficiency， which may be related to the dynamic process of promoting mitochondrial self-renewal.

〔Keywords〕 premature ovarian insufficiency; Ovary-Warming Pot; mitochondria; optic atrophy 1; PTEN-induced putative kinase 1; anti-Müllerian hormone

早發(fā)性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency， POI）的定義是40歲之前與閉經(jīng)相關的卵巢卵泡丟失或功能障礙，其主要的癥狀是繼發(fā)性的月經(jīng)紊亂、閉經(jīng)及生育能力下降[1]，伴有潮熱、睡眠障礙。卵巢衰老的特征是卵巢卵泡儲備的定量和定性改變[2]。線粒體是母系遺傳的雙膜細胞器，作為細胞的能量工廠，在卵母細胞中大量存在[3]，線粒體為卵泡成熟，受精和胚胎發(fā)育期間的轉錄和翻譯提供能量[4]，線粒體功能異常與卵巢衰老密切相關[5]，線粒體動力學紊亂（如線粒體融合、線粒體自噬）也會影響卵泡細胞衰老[6]。

尤昭玲教授（以下尊稱尤老師）是國家第四批名老中醫(yī)藥學術經(jīng)驗繼承指導老師，從事中醫(yī)、中西醫(yī)結合婦科教學、科研、臨床工作40余年。在卵巢功能異常、月經(jīng)不調、不孕等疾病的診治上推陳出新，創(chuàng)見獨特，有豐富的臨證經(jīng)驗。POI可歸屬于中醫(yī)學“閉經(jīng)”“血枯”“不孕”等范疇。結合多年的臨床經(jīng)驗，尤老師認為卵巢低反應病因應從脾-腎考慮，脾腎虧虛是導致POI的主要病機，臨證尤其重視調理脾腎，滋腎之陰陽，益脾之精血，以養(yǎng)泡育泡。獨創(chuàng)“暖巢煲”以暖巢助卵、調泡養(yǎng)泡。本研究采用環(huán)磷酰胺構建POI小鼠模型，觀察暖巢煲對模型小鼠卵巢線粒體功能的影響，為其治療機制提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1? 動物

8周齡SPF級雌性C57BL/6J小鼠40只，體質量（20±2） g，由湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，許可證號：SCXK（湘）2019-0004。分籠飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心SPF級屏障環(huán)境中，室溫（21.0±2.0） ℃，相對濕度50.0%±10.0%，自由飲食進水。本實驗經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學動物倫理委員會批準，倫理審查編號：LLBH-202111180001。

1.2? 藥物與試劑

暖巢煲由鐵皮石斛、黃精、黃芪、巴戟天組成，均由湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥劑科鑒定并提供。

環(huán)磷酰胺注射液粉末（上海百特醫(yī)療用品貿易有限公司，批號：PHR1404）;瑞氏染液（北京雷根生物科技有限公司，批號：DM0004）;抗米勒管激素（anti-Müllerian hormone， AMH）ELISA試劑盒（廈門侖昌碩生物科技有限公司，批號：YD20514）;視神經(jīng)萎縮蛋白1（optic atrophy 1， OPA1）抗體、PTEN誘導假定激酶1（PTEN-induced putative kinase 1， PINK1）抗體均購自江蘇阿爾法生物科技有限公司（批號分別為A19024、A19860）;β-actin（美國Proteintech公司，批號：60004-1-Ig）。

1.3? 主要儀器

正置熒光顯微鏡（德國蔡司公司，型號：Scope.A1）;數(shù)字玻片掃描系統(tǒng)（匈牙利3DHISTECH公司，型號：Pannoramic MIDI）;酶標分析儀（深圳市匯松科技發(fā)展有限公司，型號：MB-5390）;透射電鏡（上海日立高新技術國際貿易有限公司，型號：HT-7800）。

2 方法

2.1? 造模

將40只C57BL/6J小鼠分籠適應性喂養(yǎng)7 d，每天上午9：00行陰道脫落細胞涂片實驗，參考預實驗及文獻方法建立POI小鼠模型[7]，環(huán)磷酰胺每天100 mg/kg注射1次。模型組造模后第1天開始連續(xù)24 d進行陰道脫落細胞涂片，篩選動情周期延長、紊亂、停滯的小鼠[8]。

2.2? 動物分組及給藥

采用隨機數(shù)字表法將小鼠分為空白組8只和模型組32只，通過觀察動情周期，篩查剔除空白組動情周期延長的小鼠1只，空白組剩7只，其余32只小鼠造模，按隨機數(shù)字表分為模型組，暖巢煲低劑量組、暖巢煲中劑量組、暖巢煲高劑量組，每組8只。造模成功后第2天開始灌胃，暖巢煲生藥量9.36、18.72、28.08 g/kg，分別為成人臨床劑量的2、4、6倍，每天給藥一次，空白組和模型組均給予0.2 mL生理鹽水，連續(xù)給藥21 d。

2.3? 取材

末次給藥后禁食不禁水12 h，然后于腹腔注射戊巴比妥，待其處于完全麻醉狀態(tài)后，眼眶取血，離心后分離的血清，置于-80 ℃冰箱內保存?zhèn)溆?。取血后頸椎脫臼法處死小鼠，用組織剪和彎鑷分離雙側卵巢，剝離干凈后置于電子天平上稱量，左側卵巢放入2.5%戊二醛固定后制作透射電鏡切片，右側卵巢組織置于4%多聚甲醛溶液中固定備用切片。

2.4? 檢測指標及方法

2.4.1? 小鼠一般狀況、體質量增長率、卵巢指數(shù)? 觀察小鼠一般狀況（形態(tài)、活動、毛色）、根據(jù)體質量計算體質量增長率、兩側卵巢濕質量，計算卵巢指數(shù)。小鼠體質量增長率=（第n天小鼠體質量-第1天小鼠體質量）/第1天小鼠體質量×100%。卵巢指數(shù)=卵巢濕質量（mg）/小鼠體質量（g）[9]。

2.4.2? 動情周期? 每天早上9：00將小鼠綁定并暴露陰道口，用10 μL移液器吸取生理鹽水沖洗陰道，取沖洗物制作涂片，染色、固定后沖片、干燥，熒光顯微鏡及玻片掃描機觀察攝影。觀察各種細胞形態(tài)以判斷動情周期變化。動情前期以有核上皮細胞和部分白細胞為主;動情期有大量扁平無核上皮細胞分布，此期陰道有明顯乳白色分泌物，質地黏稠;動情后期有3種細胞：核上皮細胞、角質化無核上皮細胞及白細胞，間情期為少量白細胞為主[10]。

2.4.3? ELISA法檢測小鼠血清AMH激素水平變化? 全血室溫靜置3 h，置于4 ℃，5000 r/min（半徑6 cm）離心10 min，將收集到的血清標記好儲存于-80 ℃冰箱內，按ELISA試劑盒說明書操作，處理完成后在450 nm波長下的酶標儀測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算各樣本指標含量。

2.4.4? HE染色檢測卵巢組織病理情況? 取出將4%多聚甲醛液的卵巢，梯度乙醇脫水，包埋，制片，常規(guī)HE染色，采用蔡司熒光倒置顯微成像儀和數(shù)字玻片掃描系統(tǒng)采集圖像觀察卵巢組織。

2.4.5? 透射電鏡觀察卵巢組織線粒體結構? 取材時將卵巢放入2.5%戊二醇固定，在4 ℃冰箱內過夜，卵巢組織修樣成1 cm×1 cm×1 cm大小，加入1 mol/L的PBS漂洗3次，每次10 min;1%鋨酸固定，雙蒸水同法再次漂洗3次;50%、70%、90%、100%梯度濃度丙酮脫水，浸透，包埋固化，于37 ℃和60 ℃烘箱干燥，修樣后在超薄切片機切片后，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色，37 ℃烘箱干燥過夜;透射電鏡觀察卵巢組織線粒體形態(tài)。

2.4.6? Western blot檢測OPA1和PINK1表達? 將

-80 ℃冰箱凍存的卵巢取出，加入裂解液冰上研磨，4 ℃，12 000 r/min（半徑6 cm）離心15 min，進行蛋白定量，制分離膠，將定量后樣品與標準品蛋白上樣進行凝膠電泳，80 V，120 min恒壓電泳;200 mA，100 min恒流電轉，脫脂奶粉37 ℃封閉1 h。

2.5? 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件和Graph Pad Prism 8.0.1進行數(shù)據(jù)分析，計量資料均使用“x±s”表示，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且符合方差齊性檢驗采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD法。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1? 一般情況比較

實驗過程中空白組小鼠飲食、活動、二便等情況均正常，毛色有光澤，體質量增長率正常，動情周期規(guī)律;模型組小鼠較空白組大便較稀，毛色枯燥，尖端發(fā)黃，缺乏光澤。與空白組比較，模型組小鼠體質量增長率明顯下降（P<0.05）。與空白組比較，模型組、暖巢煲低劑量組卵巢指數(shù)均降低（P<0.01）。與暖巢煲中劑量組相比，模型組、暖巢煲高劑量組卵巢指數(shù)均降低（P<0.01）。詳見表1、圖1。

3.2? 暖巢煲對POI小鼠動情周期的影響

與空白組小鼠相比，模型組小鼠動情周期紊亂。造模前各組小鼠動情周期正常，為4～5 d，正?？梢娨?guī)律周期性改變（動情前期、動情期、動情后期、動情間期）。造模后，空白組小鼠動情周期規(guī)律穩(wěn)定;模型組表現(xiàn)為周期延長、紊亂、停滯，其中，周期延長居多，多為動情后期和間期，表明模型建立成功。詳見圖2—3、表2。

3.3? 暖巢煲對POI小鼠血清性激素的影響

與空白組比較，模型組、暖巢煲低劑量組小鼠血清AMH明顯下降（P<0.05）。與模型組比較，暖巢煲低劑量組無統(tǒng)計學意義。與模型組、暖巢煲低劑量組比較，暖巢煲中、高劑量組血清AMH明顯升高（P<0.05）。詳見表3。

3.4? 暖巢煲對POI小鼠組織形態(tài)的影響

空白組卵巢結構清晰，生長卵泡數(shù)目較多，少量閉鎖卵泡;與空白組比較，模型組生長卵泡數(shù)量及顆粒層明顯減少，閉鎖卵泡數(shù)量增加。與模型組比較，暖巢煲低劑量組、暖巢煲中劑量組、暖巢煲高劑量組生長卵泡數(shù)量明顯增多，形態(tài)清晰，閉鎖卵泡數(shù)量明顯減少。詳見圖4。

3.5? 暖巢煲對POI小鼠顆粒細胞線粒體形態(tài)的影響

與空白組比較，透射電鏡下觀察到模型組線粒體密度減低，嵴少見，出現(xiàn)病變如腫脹、空泡樣變形成，有白泡樣變，基質密度不均勻。空白組的線粒體基本呈橢圓形，分布密度適中，線粒體內嵴清晰，輪廓明顯。暖巢煲高劑量組線粒體嵴明顯，基質密度均勻，數(shù)量較多，暖巢煲低劑量組少量線粒體局部空化。詳見圖5。

3.6? 暖巢煲對POI小鼠OPA1、PINK1蛋白的影響

與空白組比較，模型組OPA1及PINK1蛋白表達量明顯下降（P<0.01）。與模型組比較，暖巢煲低、中、高劑量組OPA1蛋白表達量上調（P<0.01）。詳見圖6。

4 討論

卵巢是雌性哺乳動物生殖功能中十分重要的器官，卵巢功能的最終體現(xiàn)是卵泡細胞的成熟、發(fā)育和排卵。有研究報告稱其發(fā)病率為1.9%[11]，最近進行的一項薈萃分析估計全世界有3.7%的婦女受到影響[12]，促成POI患病率的背景是由促性腺毒性治療引起的醫(yī)源POI的絕經(jīng)前癌癥幸存者的發(fā)病率增加引起的[13]。POI的病因復雜，包括線粒體異常和醫(yī)源性因素（包括化療、放療和外科手術）引起的異質性疾病[14]，臨床對POI的一般治療是模擬生理激素釋放的激素替代療法，但臨床使用雌、孕激素有局限，存在副作用較多、遠期療效欠佳等弊端，會發(fā)生多種并發(fā)癥[15]。

中醫(yī)古籍沒有POI的相關概念，根據(jù)其臨床表現(xiàn)可將其歸為“月經(jīng)后期”“月經(jīng)量少”“閉經(jīng)”“不孕”“年未老經(jīng)水斷”等范疇?！端貑枴ど瞎盘煺嬲摗吩唬骸芭悠邭q，腎氣盛，齒更發(fā)長;二七而天癸至，任脈通，太沖脈盛，月事以時下，故有子?！薄端貑枴ち?jié)藏象論》曰：“腎者，主蟄，封藏之本，精之處也?！蹦I藏精，精化氣，腎精足則腎氣充，腎—天癸—沖任—胞宮軸調節(jié)女子月事，腎中精氣的盛衰，直接關系到生殖軸的功能狀態(tài)?！睹}貫·婦人脈》曰：“腎脈微澀與浮……皆經(jīng)閉不調之候。”《景岳全書·虛損》謂：“五臟之傷，窮必及腎?！蹦I精虧則腎氣衰，腎精先天不足或后天伐傷，天癸無以時至，則沖任空虛，胞宮失養(yǎng)，則經(jīng)水早斷。腎為命門，張景岳認為：“命門之火，謂之元氣，命門之水，謂之元精?！庇壤蠋煾鶕?jù)多年的臨床經(jīng)驗，認為腎精虧虛是該病的根本病機[16]，兼腎陰腎陽二者皆虛，腎陰虛則無以盈溢，腎陽虛則失以溫運，終至胞宮失養(yǎng)，月水早斷。《蘭室秘藏·經(jīng)閉不行有三論》曰：“婦人脾胃久虛或形羸，氣血俱衰而致經(jīng)水斷絕不行?！庇壤蠋熣J為脾胃為后天氣血生化之源，精血同源，卵泡的生長發(fā)育過程賴于后天精微物質滋養(yǎng)，脾虛則后天之精生化無源，巢中之泡無以滋養(yǎng)，或發(fā)育遲緩，或為無用之空泡。卵巢是女性生殖之卵泡發(fā)育場所，卵泡發(fā)育賴于先天腎精填充以及后天精微物質滋養(yǎng)，自創(chuàng)暖巢煲以補腎益精，暖巢養(yǎng)泡，在臨床使用量較大，現(xiàn)代藥理研究表明，其組成藥物與線粒體功能密切相關[17]。POI發(fā)病機制和治療機制復雜多樣涉及多因素、多基因、多環(huán)節(jié)、多通路，從卵巢功能減退到POI再到卵巢早衰是一個漸進的過程。了解POI的發(fā)展規(guī)律，尋找一種安全有效的治療手段，對于女性卵巢健康和POI防治有重大意義，中藥復方治療POI綜合多靶點、多環(huán)節(jié)、多機制，具有獨特的治療特色和優(yōu)勢，以減少傳統(tǒng)西藥治療帶來的不良反應。因此，研究臨床有效的中藥復方治療POI有重要意義。

本實驗結果顯示，與空白組比較，模型組小鼠體質量增長率緩慢。模型組大部分小鼠動情周期處于紊亂狀態(tài)，卵巢指數(shù)下降;血清AMH呈下調趨勢;卵巢組織HE切片提示模型小鼠卵巢形態(tài)受損，原始卵泡、竇前卵泡、竇狀卵泡均明顯減少，閉鎖卵泡增多。以上結果均符合POI診斷指征，提示模型建立成功，暖巢煲治療后，各治療組小鼠體質量增長率與正常小鼠相當，其暖巢煲中、高劑量組小鼠體質量增長率增加速度較快?！饵S帝內經(jīng)素問集注·五臟生成》曰：“脾主中央土，乃倉廩之官，主運化水谷之精，以生養(yǎng)肌肉，故合肉?！逼樯?，脾胃運化水谷精微滋養(yǎng)身體，黃芪、黃精益氣健脾，促進小鼠體質量恢復。除暖巢煲低劑量組外，暖巢煲中、高劑量組卵巢指數(shù)恢復至與空白組相當，動情周期在治療后期逐漸恢復。AMH是一種糖蛋白，屬于轉化生長因子β家族[18]，由前竇和小竇卵泡的顆粒細胞產(chǎn)生，是首選的卵巢儲備標志物[19]。與空白組比較，模型組、暖巢煲低劑量組小鼠血清AMH明顯下降，與模型組、暖巢煲低劑量組比較，暖巢煲中、高劑量組血清AMH明顯升高，與空白組相當，說明暖巢煲能改善POI小鼠性激素水平。卵泡正常發(fā)育成熟排出需要先天之精和后天精微的濡養(yǎng)，暖巢煲通過益腎健脾、暖巢調泡，改善卵巢儲備功能。

卵泡是卵巢中卵母細胞發(fā)生和發(fā)育的基本功能單位，卵泡由卵母細胞和圍繞在其周圍的多層顆粒細胞和最外層的卵泡膜細胞組成，卵泡的生長發(fā)育是三者相互作用的共同結果。顆粒細胞為卵母細胞提供能量底物，其線粒體的質量會影響卵母細胞[20]，多項研究發(fā)現(xiàn)，POI主要是由于顆粒細胞凋亡[21]從而引起卵泡閉鎖的[22]，從生殖角度來看，卵巢功能不全是卵巢功能的逐漸下降，表現(xiàn)為卵泡數(shù)量和質量的下降[4]，線粒體在濾泡閉鎖中起核心作用[23]，是細胞凋亡的中樞執(zhí)行者[24]。線粒體動力學保持其結構完整和細胞內分布以適應細胞能量需求，線粒體動力學可以通過控制融合和自噬蛋白的表達水平和活性來調節(jié)。線粒體內膜融合通過OPA1進行，PINK1是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，當線粒體損害、膜電位降低時被激活，清除受到嚴重損害的線粒體[25]。線粒體動力學能夠控制、調節(jié)并維持線粒體的功能和質量。線粒體動力學改變可能導致線粒體和細胞功能障礙，線粒體功能障礙是影響卵母細胞質量的關鍵因素，可能直接影響卵巢衰老[26]。形態(tài)學研究發(fā)現(xiàn)，卵巢衰老會影響卵母中的線粒體功能，導致線粒體腫脹、液泡化和碎裂[27]。在本研究中，與空白組比較，透射電鏡下觀察到模型線粒體密度減低，嵴少見，出現(xiàn)病變如腫脹、空泡樣變形成，有白泡樣變，基質密度不均勻。暖巢煲高劑量組線粒體嵴明顯，基質密度均勻，數(shù)量較多。通過檢測與線粒體內膜融合有關的OPA1、與自噬有關的PINK1，與空白組比較，模型組呈明顯下調狀態(tài)，而暖巢煲對這2個蛋白都有顯著上調作用。以上結果顯示暖巢煲可能通過線粒體融合及自噬的動力過程，維持其結構、功能完整，進而維持卵巢卵泡正常功能。

綜上所述，本研究證實暖巢煲能通過調節(jié)線粒體功能，改善卵巢功能，保護卵巢儲備的功能，從而對POI發(fā)揮治療作用。

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