線粒體自噬在心肌缺血再灌注損傷中作用的研究進(jìn)展

溫建麟，黃鋒，曾志羽

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

隨著冠狀動脈介入術(shù)、溶栓、冠狀動脈旁路移植術(shù)等再灌注治療的不斷發(fā)展和廣泛應(yīng)用，挽救了大量冠心病尤其是急性心肌梗死患者的生命。然而在臨床中，缺血心肌在梗死相關(guān)血管開通后可能導(dǎo)致比血管閉塞時更嚴(yán)重的急性損傷，患者出現(xiàn)惡性心律失常、無復(fù)流和心肌頓抑現(xiàn)象，致使心肌壞死面積擴(kuò)大甚至死亡，即心肌缺血再灌注損傷(MIRI)[1]。MIRI減弱了缺血心肌再灌注的效益，成為了冠心病預(yù)防與治療過程中亟待解決的關(guān)鍵問題。但是MIRI的確切機(jī)制尚未明確，目前認(rèn)為與自由基的作用、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、白細(xì)胞的激活及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等因素密切相關(guān)。而最新有研究表明，線粒體自噬與心肌缺血再灌注密切相關(guān)，線粒體自噬的相關(guān)分子通路被認(rèn)為是一個潛在的缺血性心臟病再灌注治療中的干預(yù)靶點。因此，本文將對線粒體自噬與MIRI的關(guān)系作一綜述。

1 線粒體自噬

自噬是一種通過溶酶體降解長壽蛋白和細(xì)胞器的代謝途徑[2]，以此途徑機(jī)體可維持自身結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和功能正常。自噬不單是細(xì)胞保守的防御機(jī)制，也是細(xì)胞程序性死亡的一種機(jī)制，與機(jī)體許多病理或生理進(jìn)程密切相關(guān)。根據(jù)細(xì)胞內(nèi)底物運(yùn)送到溶酶體腔的方式不同，可以分為大自噬、小自噬等非選擇性自噬；自噬也可以是選擇性的，比如線粒體自噬、過氧化物酶體自噬、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬和核糖體自噬等[3]。不同的自噬途徑又有著不同的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，但是其具體的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)并沒有完全闡明，線粒體自噬是研究得較多的一種自噬途徑。

線粒體是真核細(xì)胞有氧呼吸的主要場所，通過氧化磷酸化的方式為細(xì)胞提供能量，有“能量工廠”之稱。同時線粒體也是細(xì)胞凋亡的調(diào)控中心和活性氧產(chǎn)生的場所，因為在線粒體產(chǎn)生能量的同時，也會產(chǎn)生活性氧自由基(ROS)，ROS過度積累，可以攻擊線粒體DNA，從而損傷線粒體，導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)和功能紊亂。線粒體對缺血、缺氧等環(huán)境較為敏感，當(dāng)心肌缺血時，三磷酸腺苷(ATP)的缺乏影響了Ca2+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性，線粒體內(nèi)鈣超載導(dǎo)致Ca2+依賴性離子通道開放，從而使得線粒體膜通透性改變，其膜間隙內(nèi)的促凋亡蛋白會釋放至胞漿，通過一系列復(fù)雜的機(jī)制，最終引起細(xì)胞發(fā)生凋亡。

線粒體自噬作為一種選擇性自噬，是細(xì)胞內(nèi)清除損傷或過多線粒體的過程[4]，指在缺血、缺氧、氧化應(yīng)激和衰老等刺激下，細(xì)胞內(nèi)的線粒體發(fā)生去極化損傷，從而激活自噬體-溶酶體途徑，完成受損線粒體的降解，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的過程。因此，及時清除受損或過多的線粒體對機(jī)體細(xì)胞正常功能的維持至關(guān)重要，而真核生物主要通過激活線粒體自噬途徑來清除積累或者損傷的線粒體。根據(jù)線粒體自噬過程的特征，將線粒體自噬分為前期、早期、中期和末期四個時期，各個時期都有不同的特點。前期：線粒體自噬相關(guān)蛋白的活化；早期：線粒體自噬小體形成；中期：形成線粒體自噬溶酶體；末期：線粒體被溶酶體降解。參與這個過程的蛋白主要有：編碼線粒體外膜激酶(PINK1)、E3泛素連接酶(Parkin)、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(BCL2)和腺病毒相互作用蛋白3(BNIP3)、自噬相關(guān)基因(Atg)蛋白和Uthl蛋白。其中PINK1及Parkin蛋白：誘導(dǎo)線粒體自噬的發(fā)生，清除過多或損傷的線粒體，維持線粒體結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定；定位于線粒體外膜的BNIP3蛋白在發(fā)育過程中線粒體自噬的清除發(fā)揮了重要的作用；Atg蛋白系統(tǒng)主要作用是參與早期線粒體自噬體的形成；Uthl蛋白是線粒體內(nèi)蛋白質(zhì)，其基因突變或者缺失都會導(dǎo)致細(xì)胞不能清除受損傷或者衰老的線粒體。因此線粒體自噬過程中各個時期的協(xié)同作用，也需要相關(guān)的分子機(jī)制來調(diào)控。

2 MIRI激活線粒體自噬的分子機(jī)制

目前廣泛認(rèn)可的介導(dǎo)哺乳動物線粒體自噬的通路主要是由PINK1及Parkin介導(dǎo)的、BNIP3及其家族成員BNIP3a(又稱Nix)、FUNDC1等線粒體自噬受體介導(dǎo)的線粒體自噬[5]。而MIRI介導(dǎo)線粒體自噬主要通過以下幾條分子通路。

2.1 PINK1-Parkin經(jīng)典途徑 PINK1-Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬是哺乳動物細(xì)胞線粒體自噬最常見的方式。正常狀態(tài)下，PINK1進(jìn)入線粒體后，被線粒體內(nèi)膜蛋白酶剪切并最終被降解，在細(xì)胞內(nèi)維持低水平的PINK1。MIRI時，ROS損傷線粒體，線粒體去極化可抑制PINK1向線粒體運(yùn)輸，完整的PINK1聚集在線粒體外膜，招募Parkin到受損的線粒體上，并通過對Parkin和泛素磷酸化激活Parkin E3連接酶活性。然后，Parkin泛素化線粒體外膜融合蛋白1和線粒體外膜融合蛋白2等使線粒體泛素化[6]。泛素結(jié)合蛋白p62識別泛素化線粒體基質(zhì)蛋白，并通過與自噬相關(guān)蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)結(jié)合，把線粒體輸送到自噬泡，促進(jìn)線粒體降解[7]。

2.2 線粒體自噬受體介導(dǎo)的線粒體自噬途徑 線粒體自噬受體蛋白，具有與LC3反應(yīng)的特征性氨基酸序列模體，受體蛋白通過模體募集、結(jié)合LC3，從而介導(dǎo)線粒體自噬的發(fā)生[8, 9]。目前發(fā)現(xiàn)的線粒體自噬相關(guān)受體包括BNIP3、Nix和FUNDC1，其在線粒體自噬的激活過程中發(fā)揮重要作用。BNIP3屬于BCL2家族的一類非典型的、僅有BH3結(jié)構(gòu)域的促凋亡蛋白家族成員，主要定位于線粒體外膜，可促進(jìn)線粒體自噬與細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Nix是線粒體膜表面的結(jié)合蛋白，與BNIP3同源。BNIP3、Nix在正常生理條件下低表達(dá)，但在心肌缺血過程中，細(xì)胞內(nèi)BNIP3、Nix表達(dá)上調(diào)，誘導(dǎo)線粒體自噬發(fā)生，維持細(xì)胞正常的功能。BNIP3、Nix調(diào)控線粒體自噬主要有以下幾個方面：Nix可調(diào)控Parkin向線粒體轉(zhuǎn)移，激活PINK1-Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬，與PINK1-Parkin途徑共同作用激活線粒體自噬[10]。作為Bcl-2家族成員，Nix可能與參與自噬泡生成的重要蛋白Beclin-1競爭結(jié)合Bcl-2或Bcl-XL,導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)中游離的Beclin-1增加,進(jìn)而誘導(dǎo)自噬發(fā)生。同時Nix也可以作為自噬受體招募Atg8 蛋白家族啟動線粒體自噬。FUNDC1是存在于線粒體外膜上的三次跨膜蛋白。FUNDC1主要參與低氧及線粒體膜電勢降低引起的線粒體自噬，但是其介導(dǎo)線粒體自噬具體機(jī)制并未明確。有研究表明，在正常情況下，F(xiàn)UNDC1被第13位絲氨酸的激酶(CK2)和第18位酪氨酸的激酶(Src)磷酸化，磷酸化的FUNDC1與LC3 相互作用減弱，表現(xiàn)為對線粒體自噬起到抑制的作用；而在心肌缺血時，去磷酸化的FUNDC1和LC3 相互作用增強(qiáng)，介導(dǎo)線粒體自噬的發(fā)生[11]。同時Chen等[12]也發(fā)現(xiàn)FUNDC1與視神經(jīng)萎縮蛋白和動力蛋白基因結(jié)合可以引起線粒體膜蛋白裂解，這也說明FUNDC1參與了線粒體自噬的發(fā)生。

3 線粒體自噬對心肌缺血再灌注的作用

在心肌缺血/再灌注損傷過程中，心肌細(xì)胞內(nèi)的線粒體在缺氧等刺激下產(chǎn)生活性氧增多，啟動氧化應(yīng)激，進(jìn)一步造成線粒體損傷，而損傷的線粒體又會產(chǎn)生更多ROS，形成惡性循環(huán)，并有可能啟動線粒體相關(guān)凋亡通路，從而造成細(xì)胞凋亡與壞死，加重MIRI。研究表明，適當(dāng)增強(qiáng)線粒體自噬功能可減輕MIRI，而損傷線粒體的數(shù)量超過線粒體自噬的清除能力，或者線粒體自噬發(fā)生缺陷，細(xì)胞則會啟動死亡程序，加重MIRI損傷程度[13,14]。線粒體自噬在MIRI中是保護(hù)作用還是損傷作用，目前并沒有一致的看法。

3.1 線粒體自噬在MIRI中的有利作用 心臟組織是高耗能組織，心肌缺血再灌注會損傷線粒體，線粒體功能障礙是導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡的主要原因。線粒體自噬能通過自噬-溶酶體降解途徑特異性的降解受損傷的線粒體，維持線粒體內(nèi)氧自由基水平，防止活性氧、線粒體膜蛋白等造成線粒體內(nèi)容物的釋放從而激活細(xì)胞凋亡和壞死途徑。因此，線粒體自噬被認(rèn)為在MIRI中起到重要的保護(hù)作用。Yan 等[15]對豬的慢性心肌缺血模型進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)自噬現(xiàn)象的增加與心肌細(xì)胞的凋亡率下降有關(guān)。Loos 等研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞自噬現(xiàn)象輕度缺血時增加，而線粒體自噬對細(xì)胞膜的完整性具有保護(hù)作用，同時也對保持線粒體正常膜電位起著重要作用，這可降低細(xì)胞不可逆損傷。有研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠心肌梗死模型中，在急性期內(nèi)，發(fā)現(xiàn)Parkin易位至損傷的線粒體，并介導(dǎo)線粒體蛋白進(jìn)行泛素化降解。同時利用敲除Parkin基因的小鼠構(gòu)建心肌梗死模型，發(fā)現(xiàn)缺乏Parkin能夠抑制急慢性期心肌梗死后線粒體自噬的發(fā)生，導(dǎo)致線粒體功能障礙加重，心肌梗死范圍大、病死率高。上述研究均提示Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬在MIRI中起到保護(hù)心肌的作用。

3.2 線粒體自噬在MIRI中的有害作用 心肌細(xì)胞正常的代謝與功能與線粒體功能正常發(fā)揮密切相關(guān)，但如果缺血缺氧等刺激過度激活線粒體自噬則會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)線粒體的清除過度，線粒體結(jié)構(gòu)和功能紊亂，加重心肌細(xì)胞損傷。心肌缺血再灌注過程中，過度激活的線粒體自噬-溶酶體蛋白降解系統(tǒng)使細(xì)胞內(nèi)重要蛋白和細(xì)胞器降解，形成細(xì)胞的不可逆性損傷，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡，但是其具體的發(fā)生機(jī)制并未明確。有實驗證明，在心肌細(xì)胞缺血再灌注過程中，使用3-甲基腺嘌呤自噬抑制劑、下調(diào)或敲除Beclin-1等手段來抑制線粒體自噬，可使心肌細(xì)胞死亡率降低。此外研究發(fā)現(xiàn)， Beclin-1是再灌注階段調(diào)節(jié)自噬的關(guān)鍵因子，Bcl-2下調(diào)會影響其活性，進(jìn)而加劇激活細(xì)胞凋亡，加重MIRI。

以上研究結(jié)果提示，心肌缺血、缺氧過程中線粒體功能紊亂在MIRI中有著重要的作用，而線粒體自噬能清除損傷的線粒體，減輕心肌缺血再灌注過程中的氧化應(yīng)激及自由基的產(chǎn)生，進(jìn)而緩解MIRI，但是過度的線粒體自噬卻可以激活細(xì)胞凋亡等途徑加重MIRI，因此，推測適度增強(qiáng)線粒體自噬改善線粒體功能是防治MIRI有效途徑之一。

綜上所述，線粒體自噬與MIRI密切相關(guān)。心肌缺血再灌注時，主要通過介導(dǎo)PINK1-Parkin、Nix、BNIP3 和FUNDC1等分子通路激活線粒體自噬，適度的線粒體自噬對線粒體膜電位的維持以及細(xì)胞膜正常結(jié)構(gòu)和功能具有保護(hù)作用，從而減輕MIRI；而線粒體功能障礙導(dǎo)致自噬功能受損清除不足或過度激活的線粒體自噬，可以加重MIRI。

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