成衍男 潘振宇

糖皮質激素(GCs)在臨床上使用十分廣泛,由此誘發(fā)的激素性股骨頭壞死(GA-ONFH)的發(fā)病率逐年上升,發(fā)病年齡亦日趨年輕。國內每年報告新發(fā)病例在100～200萬[1]。多數(shù)病人罹患后會在2～3年內股骨頭塌陷,隨后髖關節(jié)發(fā)生骨性關節(jié)炎。大部分病人最終只能選擇關節(jié)置換。GCs引起 GA-ONFH的發(fā)病機制可能與骨髓間充質干細胞(BMSCs)成脂/成骨分化異常、氧化應激、細胞凋亡與自噬、炎癥和免疫、外泌體調控、及非編碼RNA的異常表達等因素相關。本文主要圍繞GA-ONFH致病機制進行綜述。

一、BMSCs成脂/成骨失衡

BMSCs是一種具有自我更新和多能分化潛力的細胞,它們能夠分化為多種不同類型的細胞,包括成骨細胞、脂肪細胞和成軟骨細胞等。長期大劑量使用糖皮質激素可能會破壞BMSCs成骨和成脂分化的平衡,影響骨修復能力,增加髓內脂肪的堆積。有研究說明,從皮質醇誘導的股骨頭壞死病人體內提取的BMSCs的細胞增殖能力及成骨分化能力顯著下降。體外皮質類固醇誘導的BMSCs中脂肪細胞數(shù)量增加,脂肪特異性基因表達增強,但成骨基因表達降低[2]。GCs通過糖皮質激素受體(GR),激活Wnt/β-catenin、TGF-β/BMP、Notch等信號通路調控BMSCs成脂或成骨分化[3]。此外,GCs可以正向或負向調節(jié)多種轉錄因子(Runx2、PPARγ、C/EBP、TAZ)。有研究發(fā)現(xiàn),GCs上調BMSCs中C/EBPα的表達促進成脂分化是通過抑制組蛋白去乙酰化酶3(HDAC3)來實現(xiàn)的[4]。HDAC3表達降低激活了BMSCs中啟動子區(qū)域中PPARγ的組蛋白H27K1乙?；?這一過程最終導致BMSCs成脂分化增強。

二、氧化應激及活性氧機制

GCs在正常生理水平下對于發(fā)育、代謝、成骨細胞分化和骨形成至關重要。過量GCs導致活性氧自由基(ROS)積累,產生氧化應激來影響骨代謝相關細胞(骨細胞、成骨細胞、BMSCs、破骨細胞)及血管內皮細胞的功能,最終引起骨組織內環(huán)境失衡,細胞發(fā)生內質網應激和線粒體功能損傷。皮質類固醇誘導的股骨頭壞死模型的早期就可以發(fā)現(xiàn)氧化應激。有研究表明,GA-ONFH病人氧化應激和(或)抗氧化標志物在體內異常表達[5]。核因子E2相關因子2(Nrf2)作為主要應激反應轉錄因子在氧化還原穩(wěn)態(tài)中起核心作用,keap1/Nrf2通路失衡是GA-ONFH發(fā)生的關鍵因素之一。大量研究表明,GCs耗竭單?；视椭久?MAGL),抑制抗氧化通路keap1/Nrf2的激活,造成BMSCs中ROS過載,發(fā)生氧化損傷和細胞凋亡[6]。GCs可以下調編碼抗氧化酶相關基因(NAD(P)H、HO-1)和抗氧化酶(γ-GCS、SOD1)在股骨頭內的表達,引起微環(huán)境氧化應激,產生大量的ROS,激活破骨細胞活性,RANKL、組織蛋白酶K表達增加,激活或募集更多破骨細胞,造成骨量減少、骨質流失,最終導致GA-ONFH的發(fā)生[7]。

三、個人易感性和遺傳

個體易感性和遺傳因素在GA-ONFH中發(fā)揮了某種程度的作用。大量的研究表明,PAI-1、ABCB1、IL1B、MMP2、MMP10和CYP450等基因的多態(tài)性和GA-ONFH密切相關。一項病例對照研究結果顯示,PAI-4基因的5 G/1 G多態(tài)性是GA-ONFH的危險因素[8]。還有研究發(fā)現(xiàn),IL1B rs1143630降低了GA-ONFH的風險,IL1B rs2853550增加了類固醇誘導的GA-ONFH的風險[9]。類似研究證實了與ABCB1(C3435T)的TT和TC基因型相比,CC基因型與骨壞死風險增加有關,ABCB1 3435T等位基因降低了GCs誘導的ONFH風險[10]。中國人群中MMP-2rs2241146和rs11646643與單側GA-ONFH存在患病風險,而MMP-10中rs470154則使得患雙側類固醇誘導股骨頭壞死的風險增加[11]。

四、細胞凋亡和自噬

GCs導致細胞發(fā)生凋亡是GA-ONFH的主要特征之一。內質網應激誘導的細胞凋亡在許多疾病中都被觀察到,而GCs治療會導致內質網應激并引起各種變化,包括成骨細胞、骨細胞和內皮細胞的功能障礙和凋亡。內質網應激抑制抗凋亡蛋白BCL-2的表達,導致線粒體中BAX含量增加,從而啟動Caspase9/Caspase3信號通路,最終觸發(fā)細胞凋亡。過量活性氧(ROS)的細胞內積累導致內質網應激增加,線粒體DNA(mtDNA)損傷,線粒體功能障礙,也能激活BCL-2 / BAX細胞凋亡途徑。大量研究表明,GCs通過抑制PI3K / AKT 通路誘導成骨細胞細胞凋亡和線粒體損傷[12]。

自噬是真核細胞中的溶酶體通過降解細胞中受損的細胞器和蛋白質為細胞提供營養(yǎng)的過程。但過度的自噬也會破壞細胞成分。在骨重塑中,成骨細胞和破骨細胞對GA-ONFH有重大意義。自噬所需要的蛋白質(Atg4B和LC3)對破骨細胞的分泌功能和體內、體外骨吸收非常重要。自噬發(fā)生的關鍵蛋白FIP200的缺失會抑制成骨細胞自噬,導致骨質的流失和骨量下降[13]。 此外,有研究表明,GCs導致BMSCs中Parkin下調和p53上調,其自噬水平降低,線粒體損傷積累,最終導致凋亡和衰老。通過上調Parkin并下調p53的表達水平,可以顯著增強BMSCs的線粒體自噬,并減少受損線粒體在細胞內的積累,有效抵御氧化應激所誘導的細胞損傷,從而改善了BMSCs移植對早期類固醇誘導的骨壞死的影響[14]。

五、凝血功能異常及血栓

減少血管數(shù)量和破壞局部血液供應被認為是GCs誘導的股骨頭壞死的重要因素之一。GCs誘發(fā)內皮細胞凋亡,破壞凝血纖維蛋白溶解系統(tǒng),促進股骨頭內血管微血栓形成,造成股骨頭內血供減少,最終導致GA-ONFH的發(fā)生。纖溶酶原激活物抑制劑1型(PAI-1)是一種糖蛋白,通過與組織纖溶酶原激活劑形成復合物來調節(jié)纖維蛋白溶解。高劑量GCs引起股骨頭微環(huán)境PAI-1水平增高,繼而誘發(fā)凝血功能障礙,血流減緩,使微循環(huán)中血液呈現(xiàn)高凝狀態(tài)及血栓形成[15]。Liu等[16]對小鼠進行血管緊張素Ⅱ和天冬酰胺酶聯(lián)合處理后,相關凝血因子(Ⅲ、Ⅴ、Ⅹ)水平顯著升高,提高了小鼠GA-ONFH的發(fā)生率。

六、炎癥和免疫

在以前的研究中,炎癥已被證明在GA-ONFH的發(fā)展和進展中起著不可或缺的作用。已有研究表明,通過收集GA-ONFH病人血清后檢測基因表達譜,將8個基因(BIRC5、CBL、CCR1、LYN、PAK1、PTEN、RAF4和TLR10)確定為GA-ONFH的候選血清生物標志物,而在功能上,這些候選血清生物標志物在GA-ONFH進展過程中參與幾種病理過程,例如免疫調節(jié)和炎癥,骨代謝和血管生成[17]。而在GA-ONFH的動物模型中,骨壞死組織中中性粒細胞和巨噬細胞升高,同時壞死骨可以通過激活Toll樣受體4(TLR4)和上調下游轉錄因子包括核因子-κB(NF-κB)和單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)刺激巨噬細胞調節(jié)炎癥反應[18]。單核細胞起源于骨髓中的造血干細胞并在骨髓中發(fā)育。有研究發(fā)現(xiàn),相比于其他原因導致的股骨頭壞死,類固醇導致的骨壞死病人骨髓標本中的單核細胞數(shù)量高3倍[19]。GCs可以在體內和體外直接作用于單核細胞,誘導單核細胞擴增,同時通過增加細胞因子信號傳導抑制因子3(SOCS3)、FOS樣1(Fosl1)、Forsb、白細胞介素-1受體1型(IL1R1)、白細胞免疫球蛋白樣受體成員3A(Lilrb3a)、配對的Ig樣受體B(Pirb)和破骨細胞相關的Ig樣受體(Oscar)的表達,使單核細胞向破骨細胞分化,發(fā)揮其炎癥反應和碎骨能力,最后導致骨量流失,血供減少[19]。

七、非編碼RNA在GA-ONFH中的作用

1．MicroRNA:miRNA在多種生理過程中發(fā)揮著至關重要的作用,包括發(fā)育、細胞增殖、分化、代謝、遷移和凋亡,同時也參與了GA-ONFH的發(fā)生和發(fā)展。

在GA-ONFH病人(對照組為股骨頸骨折病人)中壞死骨、骨髓血及外周血中均存在miRNA的表達譜差異[20]。Li等[21]在3例類固醇誘導的ONFH病人的股骨頭的坍塌區(qū)和非坍塌區(qū)發(fā)現(xiàn)了8個miRNA上調(has-miR-4472,has-miR-4306,has-miR-4747-5p,has-miR-4441,has-miR-4709-3p,ebv-miR-BHRF1-2-3p,has-miR-585-3p和has-miR-5572),兩個miRNA下調(has-miR-195-5p和has-miR-645)。目前,已經發(fā)現(xiàn)了大量的miRNA直接或者間接參與GA-ONFH的致病過程,主要是參與調節(jié)脂肪生成、細胞凋亡、成骨和血管生成相關通路。Cao等[22]發(fā)現(xiàn),miR-224-5p在GC處理的BMSCs中上調,miR-224-5p可以抑制BMSCs的成骨,但促進BMSCs的成脂分化。GCs通過上調miR-30b-5p的表達,抑制RUNX2通路及下游基因(MMP3、MM9、Col10a1),介導股骨頭軟骨細胞發(fā)生凋亡[23]。

2．長鏈非編碼RNA(lncRNA):lncRNA對于許多疾病的發(fā)生和發(fā)展至關重要。有研究顯示,從GA-ONFH病人獲取的BMSCs中l(wèi)ncRNA的差異表達譜,其中有1 878個lncRNA上調和1 842個lncRNA下調[24]。這些lncRNA的靶基因參與細胞增殖、分化和遷移等過程。某些lncRNA具有某些miRNA的“種子序列”,它們能夠像海綿一樣結合miRNA,從而阻止miRNA與其靶mRNA結合。最近的研究發(fā)現(xiàn),lncRNA Tmem235能夠結合miR-3a-5p,抑制miR-3a-5p對下游基因BIRC的調控,有效抑制了缺氧環(huán)境下BMSCs的凋亡,并提高了BMSCs在GA-ONFH的早期移植療效[25]。lncRNA LINC00473可以通過激活miR-23a-3p/LRP5/Wnt/β- catenin信號通路軸來促進成骨并抑制BMSCs的脂肪生成,同時,通過激活miR-23a-3p/PEBP1/Akt/Bad/Bcl‐2信號通路軸從Dex誘導的細胞凋亡中拯救BMSCs[26]。

3.環(huán)狀RNA(circRNA) :與lncRNA相似,circRNA包括多個miRNA結合位點,類似于海綿吸附水,將miRNA與靶mRNA“隔離”,從而影響miRNA對靶mRNA的負調控。已有研究使用circRNA微陣列分析篩選了類固醇誘導的GA-ONFH中的circRNA表達譜,鑒定出多達182個差異表達的circRNA,其中108個circRNA顯著上調。而上調最明顯的circRNA(稱為circHGF)可以通過靶向miR-25-3p/SMAD7軸抑制GA-ONFH中BMSCs的增殖和成骨分化[27]。Chen等[28]通過GA-ONFH來源BMSCs中篩選出了820種差異表達的circRNA,其中circRNA CDR1as通過調控miR-7-5p-WNT5B促進BMSCs發(fā)生成脂分化,而敲低circRNA CDR1as增強了BMSCs成骨分化能力,同時減弱 BMSC 的成脂分化能力。

八、外泌體在GA-ONFH中的應用

外泌體是由細胞形成的直徑為50～100nm的細胞外脂質結構囊泡,這些囊泡將生物活性蛋白、脂質和RNA傳遞到靶細胞進行細胞間通訊,其發(fā)揮的作用與其來源的細胞功能相似。外泌體治療GA-ONFH具有顯著的潛力,這些外泌體主要來源于脂肪間充質干細胞、滑膜間充質干細胞、CD34陽性干細胞、臍帶間充質干細胞、BMSCs和尿液來源間充質干細胞。除此之外,血小板來源的外泌體可以減少GA-ONFH中細胞凋亡的發(fā)生。來自GA-ONFH壞死骨的外泌體可導致CD41蛋白表達降低,通過調控整合素β3-FAK-Akt-Runx2通路,抑制BMSCs的成骨分化和遷移從而誘導GA-ONFH發(fā)生[29]。在此病理過程中,GA-ONFH壞死骨的外泌體導致BMSCs缺乏CD41成骨能力下降而無法修復壞死骨可能是GA-ONFH加重的主要原因[29]。而更值得注意的是,Li等[30]發(fā)現(xiàn)與健康的小鼠同住可以延緩GCs處理導致的股骨頭壞死,同時挽救GCs誘導的腸道動物乳桿菌減少,而口服補充動物乳桿菌通過增加血管生成、增強成骨和減少細胞凋亡來減輕GCs誘導的 GA-ONFH,來自動物乳桿菌(L.animalis-EVs)的細胞外囊泡含有豐富的功能蛋白,可以進入股骨頭發(fā)揮促血管生成、促成骨和抗凋亡作用。

GA-ONFH發(fā)病機制仍在持續(xù)研究之中。一般認為,GA-ONFH的發(fā)生并不是單因素所致,而是多因素并存,破壞了股骨頭局部微環(huán)境的骨代謝平衡,使骨質流失、骨量下降、血管內皮細胞損傷和血供受損。GA-ONFH的早期癥狀并不明顯,癥狀明顯時多處于進展期和終末期,治療十分棘手。因此,早期預防和治療的研究具有重要的臨床意義。深入探討GA-ONFH的致病靶標可能會成為治療GA-ONFH的新方向。