劉梓航, 蔡祥勝, 楊翌, 孫筱放, 謝英俊△

1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科研究所、廣東省產(chǎn)科重大疾病重點實驗室、廣東省普通高校生殖與遺傳重點實驗室、廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三臨床學(xué)院(廣東廣州 510150); 2中國科學(xué)院大學(xué)深圳醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院(廣東深圳 518601)

近年來,基因編輯技術(shù)在人類疾病治療方面發(fā)揮著越來越重要的作用,該技術(shù)能夠靶向目標(biāo)生物體基因序列進行較為精確的修飾?；蚓庉嫾夹g(shù)包括巨型核酸酶、鋅指核酸酶、轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶和CRISPR-Cas技術(shù)。本文將在綜述基因編輯技術(shù)簡要分類的基礎(chǔ)上,比較其之間的優(yōu)劣,并介紹近年來基因編輯技術(shù)在疾病治療方面的應(yīng)用進展,探討基因編輯技術(shù)的前景和突破方向。

1 基因編輯技術(shù)的原理

基因編輯工具是結(jié)構(gòu)和序列特異性的核酸酶,它在目標(biāo)基因組的特定位置產(chǎn)生雙鏈斷裂重組(DSB)[1],并通過兩種機體的自然機制誘導(dǎo)生物體修復(fù)DSB:非同源末端連接(NHEJ)和同源介導(dǎo)的雙鏈DNA修復(fù)(HDR)。NHEJ修復(fù)途徑不依靠模板,機制簡單,反應(yīng)比HDR更快,但容易出錯,容易導(dǎo)致基因序列的破壞[2]。而當(dāng)存在修復(fù)模板時,即完整原始的姐妹染色單體同源序列,生物體就會啟用HDR修復(fù)途徑[3]。隨著醫(yī)學(xué)和生物科技領(lǐng)域的不斷發(fā)展,許多基因編輯新技術(shù)開始迅速發(fā)展起來,并且擴充了基因編輯技術(shù)工具箱,開拓了新的研究和應(yīng)用領(lǐng)域。其中CRISPR-Cas9系統(tǒng)具有跨時代的重大意義,基因編輯技術(shù)還包括同源重組、大范圍核酸酶技術(shù)(meganuclease)、鋅指蛋白(zine finger protein,ZFP)技術(shù)、轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALEN)等(表1)。

表1 基因編輯技術(shù)的分類及比較

各類基因編輯技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀:

天然大范圍核酸酶的種類一直以來嚴(yán)重限制了大范圍核酸酶參與基因編輯的應(yīng)用,這是因為大部分的天然大范圍核酸酶在人類基因組上的應(yīng)用和研究很難找到匹配的識別和靶向位點,并且往往伴隨著一些細(xì)胞毒性作用和脫靶效應(yīng)。輔助因子的離子類型還會影響脫靶效應(yīng),例如:有研究表明使用錳代替鎂的方法可以減少錯配序列的發(fā)生,但這會顯著影響編輯效率[9]。

ZFN技術(shù)也存在相應(yīng)的技術(shù)難題:就應(yīng)用程度方面而言,因為實驗需要而開發(fā)新的ZFN,這需要開發(fā)人員具備在蛋白質(zhì)工程等技術(shù)方面的專業(yè)知識[5]。從安全性方面來說,ZFP間隔區(qū)長度、同源和異源二聚體的形成以及相鄰鋅指之間的相互作用與脫靶率密切相關(guān)[23-24]。

TALENs的特異性結(jié)合效率受到多方面的靶影響,包括細(xì)胞類型、靶點、作用持續(xù)時間和使用的傳遞系統(tǒng)。在重復(fù)單元的兩側(cè)截斷TALE支架或者將催化中心放在更合適的位置可以提高20%TALEN的修飾率和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性,同時還能降低細(xì)胞毒性[25]。但一些增強其特異性修飾率的修改可能會降低基因編輯的效率。例如,當(dāng)使用某些重復(fù)可變雙殘基(如用于識別鳥苷酸的NH和NK)時,重組TALE蛋白的活性會顯著降低,從而影響基因編輯效率[13, 26]。由于難以準(zhǔn)確預(yù)測TALEN脫靶活性,想要擴大臨床應(yīng)用,則需要進行更多更為詳細(xì)的分析。

CRISPR-Cas系統(tǒng)的編輯效率和特異性在不同的基因組位點上存在很大差別,而且與之前提到的TALEN和ZFN相比,CRISPR-Cas系統(tǒng)具有更高的脫靶率。另外,關(guān)于CRISPR-Cas系統(tǒng),最近有研究提出了一些新問題:正常人體內(nèi)可能存在針對CRISPR-Cas系統(tǒng)的免疫細(xì)胞和免疫分子。例如,Charlesworth 團隊在來自健康成人樣本的很大一部分捐獻者中檢測到針對SaCas9(SaCas9 Nuclease)和SpCas9(SpCas9 Nuclease)的抗體(分別占67%和42%)。此外,在血清供體中,抗SaCas9和SpCas9的抗原特異性T細(xì)胞(分別占78%和67%)的檢出率也很高[27]。這些發(fā)現(xiàn)引發(fā)了科研人員的思考,即使用該技術(shù)修飾的細(xì)胞可能會被患者的免疫系統(tǒng)識別并清除。往好處想:這僅僅只會使治療靶向細(xì)胞被免疫系統(tǒng)破壞而導(dǎo)致基因編輯治療效率降低;而考慮到人類與微生物接觸的頻繁性,則可能會在使用CRISPR-Cas系統(tǒng)產(chǎn)生的免疫反應(yīng)中,導(dǎo)致特異性免疫毒性反應(yīng)而產(chǎn)生不良結(jié)果。隨著CRISPR-Cas系統(tǒng)走向臨床試驗,這一容易忽視的方面需要引起十分的注意。

2 基因編輯技術(shù)的優(yōu)劣勢

在理想的情況下,基因編輯技術(shù)可以不需要同源模板來編輯任意基因位點,同時產(chǎn)生較少的副產(chǎn)物和雙鏈斷裂,具有高特異性、高效率的特點,應(yīng)用潛力大[28-30]。

CRISPR新技術(shù)的發(fā)展使得具有普遍性、DNA特異性、產(chǎn)品選擇性以及自然CRISPR系統(tǒng)的基本功能得到了改善,也促進了這種技術(shù)的創(chuàng)新和改變,研究人員還利用這些技術(shù)用來研究生命系統(tǒng)和開發(fā)人類疾病的新工具[30]?；蚓庉嬓录夹g(shù)用于治療遺傳疾病最能凸顯其價值。

基因編輯工具的不斷擴充和發(fā)掘向我們展示了基因編輯技術(shù)運用的廣泛性和可塑性,并被應(yīng)用在更多的方面和模型中,這在基因治療的選擇和開發(fā)中起到推動作用。例如,最近有研究顯示CRISPR-Cas9增加了在細(xì)胞和生物體模型中插入、刪除或編輯遺傳信息便利性,還可以用來促進基因型-表型的分析。最近有項研究就舉例說明了如何借助CRISPR系統(tǒng)識別細(xì)胞毒性組蛋白脫乙酰酶抑制劑曲古抑菌素A(trichostatin A, TSA)抗性相關(guān)的基因[31]。

基因編輯技術(shù)可以從發(fā)病機制上根治多種疾病。從理論和實驗來看,基因治療非常有效的,且可以保持長期的穩(wěn)定性。然而,治療的安全性和有效性以及涉及到的一系列倫理問題是無法忽視和避免的問題?；蚓庉嫷牟灰?guī)范使用會給人類以及生物界的基因庫帶來潛在的麻煩,并且經(jīng)過不恰當(dāng)基因修飾的人群會引發(fā)一系列社會倫理問題,對于人類的社會治安和公平問題產(chǎn)生非常大的沖擊。例如,2018年發(fā)生的“免疫艾滋病基因編輯嬰兒事件”就是非常惡劣的倫理問題。過度使用基因編輯也將從基因的層面對人體造成不可逆轉(zhuǎn)的影響,危害人類的長期發(fā)展[32]。在技術(shù)、社會、自然之間謀求一種穩(wěn)定是基因編輯技術(shù)應(yīng)用最理想的狀態(tài)。

3 基因編輯技術(shù)目前研究的技術(shù)瓶頸

3.1 如何減少脫靶現(xiàn)象以及基因毒性反應(yīng) 目前基因編輯技術(shù)遇到的最大問題就是如何減少技術(shù)的脫靶率以及預(yù)測并避免脫靶。對CRISPR系統(tǒng)進行改良其特異性,減少脫靶事件,這是許多科研人員都在努力的方向和目標(biāo)。

另外,如何增加基因編輯技術(shù)的安全性一直是一個困難且必須面對的問題。因為基因編輯引起的毒性反應(yīng)也是十分常見的。其中,對生產(chǎn)基因編輯工具中所涉及的基因毒性雜質(zhì)來源進行評估,分析其制造過程,考慮起始物質(zhì)、中間物質(zhì)、溶劑等,以免毒性物質(zhì)的產(chǎn)生和摻雜,這些可以啟發(fā)我們?nèi)绾螠p少基因毒性作用。

3.2 基因編輯效率和準(zhǔn)確性需要提高 依賴HDR同源修復(fù)的較為精準(zhǔn)基因編輯具有更廣泛的應(yīng)用前景,但是與已經(jīng)建立的基因編輯系統(tǒng)的編輯效率相比,其遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于由NHEJ修復(fù)介導(dǎo)的非精確的編輯系統(tǒng)。因此,我們需要通過優(yōu)化現(xiàn)有的系統(tǒng)或者研發(fā)新的技術(shù)從而突破當(dāng)前的技術(shù)瓶頸,改善目前存在的技術(shù)高效率和高精確度不能并存的劣勢。

3.3 靶向細(xì)胞的基因維持有效的問題 最近,有薈萃分析表明CRISPR-Cas9編輯的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞顯示出與早期植入對照組相比,基因編輯細(xì)胞的持久性在后期和二次移植接受者中降低的問題。針對血紅蛋白基因的研究分析顯示,無論使用HDR還是NHEJ,基因編輯后細(xì)胞維持有效性的能力都顯著降低[33]。靶向造血干細(xì)胞的移植持久性依舊是一個巨大的挑戰(zhàn)。

3.4 基因編輯中聚合物材料的研發(fā)與改進對于基因編輯過程有著重大意義 在基因治療中,聚合物材料在基因傳遞的靈活程度、成本的縮減方面擁有巨大的潛力,并且聚合物材料不受病毒載體和免疫原性問題的影響,因此科研人員對使用聚合物材料存在極高的熱情和興趣。為了解決效率和生物相容性的問題,在聚合物材料上的新發(fā)現(xiàn)對基因治療的實際應(yīng)用有著重大的影響。

最近有研究發(fā)現(xiàn),通過2%～11.5%的聚乙烯亞胺(polyethyleneimine,PEI)的琥珀?；饔蒙a(chǎn)了一系列兩性離子樣聚乙烯亞胺衍生物(zPEI)。琥珀?；饔煤?與未修飾的PEI相比,zPEI復(fù)合物表現(xiàn)出血清蛋白聚集減少,并且在競爭性聚陰離子存在下更容易解離的特性。另外,血清介導(dǎo)的基因傳遞顯示,在HEK293和HeLa細(xì)胞中,僅2%的PEI的琥珀酰化能夠使轉(zhuǎn)基因表達(dá)量比未修飾的PEI高260～480倍,比已經(jīng)商業(yè)化PEI-PEG2k高50～65倍。該研究還表明:2%琥珀酰化很大程度上不會降低聚合物-DNA結(jié)合能力以及與血清蛋白的相互作用,反而這種小的修飾能明顯地增加基因編輯的表達(dá)和基因敲入的效率[34]。

這些最新的研究成果表明聚合物材料的研發(fā)與改進對于基因編輯過程有著重大意義,能顯著提高基因編輯的表達(dá)和增強基因編輯帶來的效果,提升基因編輯的效率和預(yù)期效果,更好地解決疾病問題。

4 基因編輯技術(shù)在疾病治療方面的應(yīng)用

自基因編輯技術(shù)的誕生到現(xiàn)在的蓬勃發(fā)展,基因編輯在疾病治療領(lǐng)域有著重大的發(fā)展前景。特別是在過去的十年中,由于CRISPR-Cas系統(tǒng)的開發(fā),基因編輯領(lǐng)域取得了不少令人矚目的疾病治療研究成果。利用基因編輯技術(shù)可提供治療單基因遺傳病、癌癥腫瘤、線粒體疾病等新的治療方法和治療思路,展現(xiàn)出強大的應(yīng)用前景?；蚓庉嫾夹g(shù)在疾病治療中的應(yīng)用見表2。

表2 基因編輯技術(shù)在疾病治療方面的應(yīng)用

4.1 基因編輯在治療人類單基因遺傳疾病方面的應(yīng)用 大多數(shù)人類遺傳病都是基因中單一堿基的突變引起的。例如,當(dāng)胞嘧啶(C)替換為尿嘧啶(U)時,需要通過氧化脫氨作用脫去一位點上的氨基;而腺嘌呤(A)替換為鳥嘌呤(G),則需脫去另一位點上的氨基。這種變化可以通過酶的催化作用來實現(xiàn)。因此,單堿基編輯技術(shù)的基本原理是通過工具酶確定突變位點,然后進行氧化脫氨作用實現(xiàn)堿基對的替換[47]。

β-地中海貧血是我國華南地區(qū)常見的遺傳血液病,在廣東省的人群攜帶率接近10%,在廣西攜帶率更是可達(dá)到20%[35]。中山大學(xué)研究團隊利用BE3系統(tǒng)(胞嘧啶脫氨酶單堿基編輯技術(shù)CBE或BE:分為BE1, rAPOBEC1-XTEN-dCas9; BE2, rAPOBEC1-XTEN-dCas9-UGI和BE3, rAPOBEC1-XTEN-Cas9n-UGI三種[36])針對HBB-28(A>G)致病點突變首次在人類體細(xì)胞和胚胎中進行了編輯修復(fù)的研究工作[37]。

遺傳性血色病(hereditary hemochromatosis, HH)也是一種與鐵儲存相關(guān)的常染色體隱性遺傳病。在HH中,G-A突變導(dǎo)致人HFE基因中的C282Y突變,這會導(dǎo)致患者鐵的過量吸收。將ABE堿基編輯器應(yīng)用于淋巴母細(xì)胞系,使基因第282位的致病性酪氨酸替換為半胱氨酸[48]。盡管ABE堿基編輯器效率不高,但其在治療疾病中有著巨大潛力。

另外一種疾病:著色性干皮病,其C組蛋白(xeroderma pigmentosum group C, XPC) 是一種起到DNA修復(fù)作用的核酸內(nèi)切酶,參與識別和修復(fù)被紫外線損傷的皮膚的DNA。缺乏XPC的細(xì)胞容易損傷導(dǎo)致著色性干皮病。有研究人員通過使用腺嘌呤單堿基編輯器(adenine base editor, ABE)對著色性干皮病患者的成纖維細(xì)胞進行編輯,恢復(fù)了關(guān)鍵蛋白XPC的表達(dá)并至少維持了4周,在紫外線照射下,細(xì)胞在一定程度上恢復(fù)了對DNA損傷的抵抗能力[38]。這個結(jié)果證明通過ABE編輯校正突變的XPC基因可有效恢復(fù)細(xì)胞中XPC蛋白的表達(dá),該研究為很多其他皮膚病的治療提供了新的思路。

單基因遺傳病種類十分多樣,對人類的健康構(gòu)成了十分巨大的威脅,隨著工業(yè)的發(fā)展以及有害污染物的積累,基因突變的頻率大大升高,導(dǎo)致人群中致病基因增加。完善單基因遺傳病基因編輯的治療方法對人類的健康將會發(fā)揮重要的作用。

4.2 利用基因編輯來研究和治療腫瘤疾病 體細(xì)胞內(nèi)的基因組發(fā)生變異將會導(dǎo)致體細(xì)胞遺傳基因組的改變,當(dāng)這些遺傳物質(zhì)的改變積累到一定程度時將會發(fā)生癌變,這些癌變不會通過遺傳傳遞給子代最典型的疾病就是各種癌癥。

從治療靶標(biāo)上來看, CD147基因已經(jīng)應(yīng)用于腫瘤分子的靶向治療。在不同腫瘤組織和正常組織中,CD147基因的表達(dá)存在著顯著差異[39]。例如,在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中,CD147的表達(dá)明顯高于癌旁組織,轉(zhuǎn)移癌組織中的CD147表達(dá)也顯著升高,并且在CD147表達(dá)的蛋白質(zhì)中有一種在口腔黏膜下纖維化中起到關(guān)鍵作用的跨膜蛋白,其與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)之間有著明顯的關(guān)聯(lián),而EMT又與口腔鱗狀細(xì)胞癌之間有著明顯的關(guān)系,所以CD147很可能是口腔癌的潛在治療靶向基因[49]。在小鼠基因敲除實驗中,與野生型相比,敲除CD147的細(xì)胞系,其增殖和對阿霉素的抗性都明顯受到抑制,根據(jù)以上的結(jié)果得以表明敲除CD147可以顯著降低cal27腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲[39],CD147非?？赡苁强谇话┑臐撛谥委煱袠?biāo)。

從宏觀治療方法上來看,新晉的癌癥治療方法,CAR-T治療(嵌合抗原受體修飾的T細(xì)胞治療)有著良好的效果和巨大的提升潛力。CAR-T治療是一種是通過在T細(xì)胞的表面表達(dá)特異性受體,從而達(dá)到特異性識別、殺傷靶細(xì)胞的效果,使腫瘤失去免疫耐受。有研究人員通過CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建CAR-T細(xì)胞,通過編輯TRAC基因座,將CD19特異性的CAR插入受體細(xì)胞TRAC基因組,增強了T細(xì)胞效力,延遲效應(yīng)T細(xì)胞的分化和衰竭[50]。CAR-T療法在血液腫瘤和淋巴瘤的治療上都有很不錯的效果,但價格昂貴,對實體瘤效果不佳[40]。

從腫瘤體外實驗來看,動物腫瘤模型是非常好的研究對象。就肝癌來說,目前手術(shù)切除和放化療依舊是臨床治療的主要手段,但肝癌很容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,使得患者的預(yù)后很差,5年生存率僅有14.1%[51]。因此,肝癌的治療研究和肝癌動物模型的建立進程刻不容緩。有研究人員通過CRISPR-Cas9技術(shù),分別靶向編輯小鼠肝細(xì)胞的抑癌基因PTEN和P53。結(jié)果表明,3%的肝細(xì)胞同時缺失了抑癌基因PTEN和P53。3個月后,實驗的所有小鼠都生成了具有特征性的肝腫瘤,該研究成功構(gòu)建了肝癌的小鼠疾病模型,為肝癌疾病的研究奠定了新的研究基礎(chǔ)[41]。

在基因編輯治療領(lǐng)域,許多研究人員也致力于通過基因編輯手段建立動物癌癥模型和基因根源治療方法,這也逐漸成為了一種新的熱點。

4.3 基因編輯在治療人類線粒體疾病方面的研究 線粒體是必不可少的細(xì)胞器,它是真核細(xì)胞能量產(chǎn)生和細(xì)胞生長的中心結(jié)構(gòu)。一般情況下,正常和突變的線粒體可以在患病細(xì)胞中共存,其中兩者DNA的比例將反映疾病的嚴(yán)重程度。低比例的突變線粒體DNA/正常線粒體DNA可以出現(xiàn)在正常的表型中;當(dāng)細(xì)胞中突變mtDNA(線粒體DNA)與正常mtDNA的比例超過一定值時,機體則會因一些線粒體功能異常而導(dǎo)致臨床病癥。

例如,線粒體腦肌病伴乳酸血癥和卒中樣發(fā)作(mitochondrial encephalopathy-lactic acidosis and stroke like episodes,MELAS)是一種多器官疾病,常伴有發(fā)育不良、身材矮小、偏頭痛、癲癇、中風(fēng)樣發(fā)作、聽力障礙等[52];肌陣攣性癲痛伴碎紅纖維病的肌陣攣性癲癇的臨床特征包括肌病、肌陣攣、共濟失調(diào)和癲癇。這都是大量mtDNA點突變造成的疾病。從CPISPR-Cas9系統(tǒng)的功能和用途上來看,其很有可能解決mtDNA中的突變,但由于體積太大而無法進入線粒體基質(zhì)。相反,傳統(tǒng)的基因編輯方法似乎更適用于線粒體基因編輯。有研究人員開發(fā)了一種DddA細(xì)菌間毒素,它可以催化dsDNA中胞嘧啶脫氧核糖核苷酸的脫氨基作用。他們還融合了DddA的轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)陣列蛋白和尿嘧啶糖基化酶抑制劑,生成了一種不含RNA的DddA衍生的胞嘧啶堿基編輯器 (DdCBE),該編輯器可以準(zhǔn)確地將人類mtDNA中CG轉(zhuǎn)化為TA[42]。堿基編輯器的應(yīng)用使精確操縱mtDNA成為可能,在治療線粒體疾病方面具有廣闊的前景。

Leber遺傳性視神經(jīng)病(Leber′shereditaryopticneuropathy, LHON)也是非常典型的線粒體疾病,發(fā)病原理是復(fù)合物Ⅰ的泛醌氧化還原酶亞基4上出現(xiàn)組氨酸和精氨酸的替換,導(dǎo)致線粒體呼吸鏈異常,細(xì)胞產(chǎn)生三磷酸腺苷能力顯著下降?？蒲腥藛T發(fā)現(xiàn),構(gòu)建靶向線粒體的病毒載體來實現(xiàn)正常mtDNA遞送也是一種有效的治療方法。研究人員將MTS肽與AAV衣殼蛋白和VP2融合,達(dá)到傳遞mtND4基因治療LHON的目的,載體的基因傳遞效率在細(xì)胞和動物水平上得到了驗證[44]。這些研究為原位線粒體的基因傳遞來治療線粒體疾病提出了新的方向和參考。

目前,許多線粒體疾病都只能靠藥物來緩解癥狀,無法從根本上治愈,并且對疾病并發(fā)癥沒有緩解作用,所以找到一種從根本上解決線粒體基因突變的方法尤為重要。目前很少有研究專注于原位mtDNA傳遞,這也是一大難題,并且線粒體基因傳遞效率幾乎沒有在人體內(nèi)得到驗證,因此解決線粒體基因療法還有很多研究和實踐有待完成。

4.4 基因編輯中基因敲除方法在疾病治療中的應(yīng)用 基因敲除(knock out, KO) 是利用同源重組這一特性,使受體細(xì)胞中原本表達(dá)的特定基因失活,以實現(xiàn)修復(fù)目標(biāo)基因的研究。

前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶kexin-9(Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9) 可以減少低密度脂蛋白(LDL) 膽固醇從血液中清除,從而導(dǎo)致心血管方面疾病的發(fā)病[44]。有研究表明,可以通過抑制PCSK9的表達(dá)來降低血清膽固醇,從而達(dá)到治療心血管疾病的目的[53]。有研究人員對猴子靜脈注射經(jīng)過Ⅰ-CreⅠ開發(fā)的AAV8-M1PCSK9大范圍核酸酶,6個月后,實驗組猴子中檢測到大量的肝細(xì)胞的PCSK9基因失活,與對照組相比,血液中PCSK9蛋白的表達(dá)降低約60%,LDL降低了34%[45]。這項新的發(fā)現(xiàn)為不能耐受抗PCSK9蛋白藥物的高膽固醇血癥心臟病患者增加了新的診治方向。

脂質(zhì)代謝異常也會導(dǎo)致心血管疾病。最近,研究人員發(fā)現(xiàn),CRISPR技術(shù)可用于敲除或破壞脂肪細(xì)胞的產(chǎn)熱抑制基因NRIP1,從而治療糖尿病、肥胖以及胰島素調(diào)節(jié)和脂質(zhì)代謝失常的一些嚴(yán)重合并癥,包括一些心血管疾病和脂肪肝。脂質(zhì)代謝由儲存脂質(zhì)的白色脂肪細(xì)胞和分泌有利于脂質(zhì)代謝物質(zhì)的棕色脂肪細(xì)胞進行調(diào)節(jié)。將棕色脂肪注入肥胖小鼠體內(nèi)可明顯改善小鼠的葡萄糖耐受量,但由于人類棕色脂肪細(xì)胞含量較低,人類對于葡萄糖和脂肪相互轉(zhuǎn)化的能力較低。將經(jīng)過CRISPR修飾過的人或小鼠棕色脂肪細(xì)胞注入高脂飲食飼養(yǎng)的小鼠體內(nèi),可減少三酰甘油以及肥胖的產(chǎn)生,并增強葡萄糖耐受性[54]。

通過基因敲除技術(shù)可以確定特定基因的性質(zhì)以及研究它對機體的影響。這對了解疾病的根源或者是尋找基因治療的靶目標(biāo)都有重大的意義。

4.5 基因編輯中基因敲入方法在疾病治療中的應(yīng)用 基因敲入(knock in, KI)與基因敲除相對應(yīng),當(dāng)疾病的發(fā)生是由于體內(nèi)缺乏某種物質(zhì)表達(dá)的時候,基因敲入可以將關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)進行同源重組從而達(dá)到從根源上治療疾病的目的。

研究人員在遺傳性酪氨酸血癥成年小鼠模型中證明了注射編碼腺嘌呤堿基編輯器(adenine base editor, ABE)的質(zhì)粒DNA和sgRNA均可以糾正A>G的位點突變。通過注射ABE和sgRNA可以產(chǎn)生Fah+肝細(xì)胞并改善Fah突變小鼠的體重減輕的表型[55]。該研究表明,ABE在糾正成年哺乳動物模型中,具有修復(fù)突變基因方向的潛在應(yīng)用。

除了糾正疾病表型,基因敲入技術(shù)在腫瘤治療中也有實質(zhì)性的進步。有研究人員提出了一種將“自殺基因”插入基因組中從而提高癌癥模型小鼠生存率的方法:研究人員通過CRISPR-Cas9技術(shù)將“自殺基因”HSV1-tk插入斷裂點的位置,然后使用前體藥物更昔洛韋進行處理,發(fā)現(xiàn)這種方法能夠?qū)е?7%的腫瘤細(xì)胞死亡。這個發(fā)現(xiàn)使得研究人員的目光從細(xì)胞轉(zhuǎn)向了患癌模型小鼠,他們將帶有融合基因的腫瘤細(xì)胞移植到小鼠體內(nèi),成瘤后利用CRISPR-Cas9技術(shù)再次插入自殺基因,協(xié)同更昔洛韋對小鼠進行治療。結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤大小比最高值減小了29%,并且實驗過程中未發(fā)生明顯的腫瘤轉(zhuǎn)移和小鼠死亡的現(xiàn)象[56]。這項研究表明插入“自殺基因”可殺死腫瘤細(xì)胞并抑制腫瘤的生長,因此,該方法可以作為治療一些攜帶融合基因的腫瘤的可行策略。

不管是基因敲入還是基因敲除技術(shù),如何解決安全性及有效性是將來真正在患者身上應(yīng)用最大的難題。

4.6 表觀遺傳調(diào)控在基因治療中的應(yīng)用 表觀遺傳調(diào)控是細(xì)胞產(chǎn)生不同功能的生物基礎(chǔ),細(xì)胞的基因和外部環(huán)境就決定了不同細(xì)胞具有各種不同且相對固定的表觀調(diào)控模式。表觀遺傳學(xué)是指不包括DNA序列的變化基因表達(dá)的遺傳變化,機制包括DNA甲基化和去甲基化、組蛋白翻譯后修飾、染色質(zhì)重塑等[57]。由于重編程不會在普通的體細(xì)胞中自發(fā)產(chǎn)生,可以把這種重編程的非自發(fā)性理解為體細(xì)胞的身份決定機制,而只有人為干預(yù)體細(xì)胞重編程的過程,我們才能了解這些機制中哪些是具有關(guān)鍵調(diào)控地位[58]。

有研究人員采用CRISPR-Cas系統(tǒng),將MS2:P65:HSF1(MPH)轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合物同改良的sgRNAs(包括截短的14-bp gRNA和MS2環(huán))包裝到腺病毒載體系統(tǒng)中并感染表達(dá)dCas9的轉(zhuǎn)基因小鼠。通過靶向激活相應(yīng)內(nèi)源基因成功地改善了急性腎損傷、1型糖尿病和杜氏肌肉營養(yǎng)不良癥(Duchenne muscular dystrophy, DMD)模型的疾病表型[59]。

綜上所述,表觀遺傳學(xué)可以引領(lǐng)我們走向一個新的疾病治療時代,從而達(dá)到預(yù)防疾病,減輕疾病影響的目的。

5 基因編輯的新策略

目前,最為廣泛使用的CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)的工程核酸酶一直都在被推陳出新,這些新式工程核酸酶能夠精確的靶向基因組操作,揭示疾病基因型和表型之間的因果關(guān)系,而無需在靶向不同序列時重新設(shè)計特定酶。CRISPR-Cas9已成功用作胚胎干細(xì)胞和患者來源的干細(xì)胞中的離體基因編輯工具,還可以用來了解胰腺β細(xì)胞的發(fā)育和功能,最新研究RNA引導(dǎo)的核酸酶還為生成新的糖尿病動物模型開辟了道路,并可以用來測試各種糖尿病治療方法的有效率[60]。

在一項新的研究中,為了確定急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML) 細(xì)胞增殖過程中的關(guān)鍵代謝酶基因,有研究組進行了以代謝酶為靶點的CRISPR-Cas9功能基因組篩選,得到了目標(biāo)AML細(xì)胞。這些目標(biāo)細(xì)胞中具有吡哆醛激酶 (pyridoxal kinase,PDXK)以及負(fù)責(zé)催化維生素B6產(chǎn)生的磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate,PLP),后者負(fù)責(zé)促進AML細(xì)胞利用維生素B6,進而利用其產(chǎn)生AML增殖所需的酶和原料等。當(dāng)PDXK缺失或被抑制時,AML細(xì)胞無法利用維生素B6,增殖將受到阻礙[46]。該研究表明,通過抑制PDXK或阻斷維生素B6信號通路將會為治療AML的方法提供一條新的道路。這意味著基因編輯系統(tǒng)不僅可以用來靶向基因,還可以利用其特質(zhì)來進行基因篩選選取目標(biāo)細(xì)胞來進行研究。

另外,有研究人員發(fā)現(xiàn)沉默子也能在基因疾病治療中發(fā)揮作用。沉默子是一段能夠結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的DNA序列,沉默子激活時,會阻礙RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄DNA序列,進而阻礙RNA翻譯為蛋白質(zhì)的過程。但是在細(xì)胞的生長進程中,沉默子發(fā)揮著重要的的作用。例如,血紅蛋白F(fetal hemoglobin, HbF)也就是胎兒型血紅蛋白,這種血紅蛋白在胎兒時期體內(nèi)濃度較高,出生以后血紅蛋白F濃度逐漸下降,這就和沉默子的調(diào)控有著密不可分的關(guān)系[61]。

鐮刀形紅細(xì)胞貧血患者紅細(xì)胞內(nèi)有許多鐮刀狀的異常血紅蛋白,這些異常血紅蛋白可相互結(jié)合形成長纖維狀沉淀物,使紅細(xì)胞發(fā)生變形,其形狀如鐮刀形,由于形態(tài)異常而容易發(fā)生溶血。有研究顯示胎兒型血紅蛋白抑制鐮刀狀血紅蛋白聚合,自然發(fā)生的遺傳性HbF能夠持續(xù)性減輕疾病癥狀。因此,重新喚醒成年紅細(xì)胞中發(fā)育沉默的HbF可以作為一種治療策略?；蚪M編輯平臺的進展中,特別是使用CRISPR-Cas9,通過人工創(chuàng)建HPFH突變、編輯轉(zhuǎn)錄HbF沉默子以及調(diào)節(jié)控制HbF表達(dá)的表觀遺傳中間體,這一想法為有效誘導(dǎo)HbF提供良好的借鑒和啟發(fā)意義。另外,在研究BCL11A基因的臨床試驗中,編輯β-血紅蛋白病患者的增強子已經(jīng)展示出了非常有希望的結(jié)果[61]。

對于基因編輯系統(tǒng)內(nèi)的新策略、新方法也逐漸被挖掘開發(fā)出來。在提高時間和空間可控性方面,一些使用遺傳、化學(xué)和物理方法來調(diào)控 CRISPR-Cas9 活性的新興策略取得了可喜的成果。包括細(xì)胞特異性啟動子、小分子激活和抑制效應(yīng)、生物性轉(zhuǎn)基因載體以及光/熱/超聲/磁的激活[62]。CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)在其細(xì)胞內(nèi)低傳遞效率減少了臨床應(yīng)用中的用途和效率。在最近的研究中,納米載體、脂質(zhì)體、聚合物和無機納米粒子載體,已表現(xiàn)出巨大的基因傳遞潛力。其中納米粒子作為CRISPR-Cas9系統(tǒng)傳遞的非病毒載體有了顯著發(fā)展,也表現(xiàn)出了其在臨床治療應(yīng)用中的良好前景[63]。

另外,一些改善脫靶、毒性問題的新策略的也有了新的發(fā)現(xiàn)。在基因編輯的過程中,DNA雙鏈斷裂會引起CRISPR-Cas9核酸酶的基因毒性。例如,針對珠蛋白基因的基因組編輯會誘導(dǎo)從珠蛋白CRISPR-Cas9切割位點到端粒(5.2 Mb)的百萬堿基級雜合性(loss of heterozygosity, LOH)丟失[64]。CRISPR-Cas9還可以使活細(xì)胞中核酸的特性或豐度產(chǎn)生變化。為了減少脫靶效應(yīng),通過特定條件控制CRISPR-Cas9功能的工具正在積極研究中。例如,刺激響應(yīng)性引導(dǎo)RNA (gRNA)。然而,由于缺乏一種在化學(xué)中通用的合成方法來將各種不穩(wěn)定的修飾引入gRNA來觸發(fā)gRNA的生理相關(guān)刺激,使得該研究在很大程度上受到限制。在最近的一項研究中,清華大學(xué)研究人員開發(fā)了一種基于2′-O-甲基核糖核苷酸硫代磷酸酯(PS-2′-OMe) 位點特異性衍生化制備刺激響應(yīng)性gRNA的通用方法。研究人員分別在氧化應(yīng)激和可見光觸發(fā)的人類細(xì)胞中展示了利用CRISPR-Cas9進行的基因編輯。該項研究完成了一項合成方面的挑戰(zhàn),并為化學(xué)修飾的RNA在基因治療中發(fā)揮更積極的作用而作出了重大貢獻[65]。

因此,如何提高基因編輯的效率以及基因編輯片段的長度是許多科學(xué)家正在研究基因編輯領(lǐng)域新策略的方向。優(yōu)化材料,實現(xiàn)基因編輯工具的多功能性,實現(xiàn)副作用最小化是尋找新的基因編輯新策略最迫切的動力。

6 技術(shù)未來的發(fā)展方向

目前,基因編輯技術(shù)未來的發(fā)展方向包括以下兩點:藥物的研發(fā)應(yīng)用方面:開發(fā)遺傳疾病和腫瘤藥物的研發(fā)將會推動基因編輯技術(shù)不斷向前發(fā)展。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的進步和個體化治療的推進,基因編輯治療的普及、個體化將進一步發(fā)展,更多的基因編輯技術(shù)將在未來走進患者的治療與生活。

臨床治療應(yīng)用方面:如何將基因編輯技術(shù)運用于臨床實踐中,還有許多問題待解決,例如,怎樣提高基因編輯的轉(zhuǎn)染和編輯效率、減少和預(yù)測潛在的脫靶效應(yīng)和毒性反應(yīng)等。在實踐中不確定因素的影響也會對臨床治療應(yīng)用產(chǎn)生較大的影響,此外,這還涉及到倫理問題;沒有一個單獨的編輯技術(shù)是完全理想地適用于所有情況。每一項技術(shù)都有很明顯的限制,但相應(yīng)地也有它們各自適合應(yīng)用的優(yōu)點,所以需要我們運用技術(shù)優(yōu)勢來合理選擇方案。

此外,如何擴大基因編輯的靶向范圍,這對于誘導(dǎo)精確的HDR或NHEJ,以及實施配對切口酶等十分重要,是非常值得去努力的方向。Cas9、成對Cas9切口酶以及dCas9融合的這種靶向范圍限制的主要來源于PAM序列(protospacer adjacent motif, PAM),但需要更多的實驗來確定這些序列識別和切割的穩(wěn)定性。研究人員還需要制定新的方法來全面評估基因組中Cas9核酸酶或配對切口酶的脫靶效應(yīng)[29]。這些方法對于增強基因編輯平臺的特異性和基因治療真正意義進入臨床至關(guān)重要。

7 結(jié)語

基因編輯技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)從最開始的遺傳物質(zhì)隨機插入宿主基因組,逐步發(fā)展成為可控的非隨機插入宿主機基因組的技術(shù),是如今臨床領(lǐng)域的非常重要的治療方式。這期間,全世界的科研人員都在奮力發(fā)展這種興新的新技術(shù),為基因編輯不停地注入新鮮的血液。盡管目前基因編輯技術(shù)在疾病治療的研究以及科研任務(wù)上還有許多難題有待解決,但隨著基因編輯調(diào)控機制的研究深入和人類疾病原理的更深層次的發(fā)現(xiàn),基因編輯技術(shù)在疾病治療方面將會發(fā)揮出非常強大的能量。

利益相關(guān)聲明:所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻說明:劉梓航負(fù)責(zé)起草論文框架和論文撰寫,蔡祥勝負(fù)責(zé)文獻的檢索和查閱,楊翌負(fù)責(zé)論文的修改,孫筱放負(fù)責(zé)論文撰寫過程的規(guī)劃和指導(dǎo),謝英俊負(fù)責(zé)對論文研究整體方向的指導(dǎo)規(guī)劃和修改。