焦瑞寶,劉 洋,周佳麗,張 盛,陳繼中

銅陵市人民醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心,安徽銅陵 244000

華法林是口服后間接發(fā)揮作用的雙香豆素類抗凝劑,其化學(xué)結(jié)構(gòu)與維生素K相似,是通過競爭性拮抗維生素K,進(jìn)而影響維生素K依賴性凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ在肝臟的合成,對血液中已經(jīng)存在的上述4種因子無抵抗作用?？捎糜谥委熝ㄋㄈ约膊?防止血栓的形成與發(fā)展,治療手術(shù)后或創(chuàng)傷后的靜脈血栓形成,可預(yù)防血栓栓塞性疾病。華法林是迄今為止使用最多的口服抗凝藥,因其作用時(shí)間長,服用方便,價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)而成為長期抗凝治療的首選藥物,但其治療窗很窄,掌控好抗凝治療強(qiáng)度非常重要,華法林抗凝用量不足,容易形成血栓栓塞。用藥過量易致各種出血,早期表現(xiàn)有瘀斑、紫癜、牙齦出血、鼻衄、月經(jīng)量增多、傷口出血經(jīng)久不愈,出血也可發(fā)生在泌尿道和消化道。凝血酶原時(shí)間-國際標(biāo)準(zhǔn)化比值(PT-INR)被公認(rèn)用于衡量華法林的抗凝強(qiáng)度,中等強(qiáng)度抗凝即PT-INR在2.0～3.0是安全范圍,患者需要定期監(jiān)測PT-INR并及時(shí)調(diào)整服藥劑量,就可以降低出血等不良反應(yīng)的發(fā)生。影響華法林藥效因素主要有遺傳和非遺傳因素,華法林作用靶點(diǎn)——維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合體亞單位1(VKORC1)、華法林代謝酶——細(xì)胞色素P450酶2C9(CYP2C9)是目前影響華法林抗凝時(shí)給藥劑量個體化差異最主要的遺傳因素[1]?！度A法林抗凝治療的中國專家共識》認(rèn)為基因多態(tài)性可解釋30%～60%的個體差異[2]。本研究回顧性收集住院抗凝患者上述兩個基因位點(diǎn)多態(tài)性信息和其他基本資料,探討VKORC1和CYP2C9*3基因位點(diǎn)突變對華法林抗凝效果的影響,指導(dǎo)臨床個體化用藥。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性收集2019年8月至2022年1月在銅陵市人民醫(yī)院住院的患者69例,其中男31例,女38例,年齡25～87歲,平均(68.88±12.14)歲,納入標(biāo)準(zhǔn):正在接受華法林抗凝治療患者,包括腦梗死、心功能不全、心臟瓣膜病、風(fēng)濕性心臟病等;排除標(biāo)準(zhǔn):肝腎功能不全、凝血功能障礙或合并嚴(yán)重疾病的患者。

1.2儀器與試劑 PyroMark Q24 MDx實(shí)時(shí)熒光定量焦磷酸序列分析儀、東勝ETC 811基因擴(kuò)增儀、MX-M型混勻儀、MX-S型漩渦震蕩儀、STAR-MAX全自動凝血分析儀,DNA提取試劑盒、測序反應(yīng)通用試劑盒(長沙三濟(jì)公司)、脫氧核糖核苷三磷酸試劑(日本TakaRa公司),凝血酶原時(shí)間試劑(上海太陽生物公司)。

1.3方法

1.3.1VKORC1和CYP2C9*3檢測 采集所有研究對象靜脈血2 mL,乙二胺四乙酸二鉀抗凝,采用硅膠柱提取、純化基因組DNA,將提取的DNA進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR),反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性25 s,56 ℃退火25 s,72 ℃延伸25 s,共35個循環(huán),最后72 ℃延伸5 min。采用PyroMark Q24 MDx實(shí)時(shí)熒光定量焦磷酸序列分析儀測定擴(kuò)增產(chǎn)物VKORC1和CYP2C9*3位點(diǎn)基因多態(tài)性。

1.3.2凝血酶原時(shí)間及PT-INR檢測 采集所有研究對象靜脈血2 mL,枸櫞酸鈉抗凝,1 610×g離心10 min獲得血漿備用,運(yùn)用STAR-MAX全自動凝血分析儀采用磁珠法測定凝血酶原時(shí)間,并與健康人群比較計(jì)算獲得PT-INR。

1.3.3華法林穩(wěn)定劑量與PT-INR達(dá)標(biāo)天數(shù)檢測 PT-INR連續(xù)檢測3次,每次監(jiān)測間隔時(shí)間3 d,連續(xù)3次PT-INR達(dá)到目標(biāo)抗凝強(qiáng)度范圍且華法林劑量未發(fā)生改變,即為華法林穩(wěn)定劑量,所用天數(shù)為PT-INR達(dá)標(biāo)天數(shù)。

2 結(jié) 果

2.169例患者兩種基因型分布情況 VKORC1野生型占85.51%(59/69),突變型占14.49%(10/69)。CYP2C9*3野生型占89.86%(62/69),突變型占10.14%(7/69)。兩種基因位點(diǎn)均為野生型占78.26%(54/69),一種基因位點(diǎn)突變占18.84%(13/69),兩種基因位點(diǎn)均突變占2.90%(2/69)。見表1。

表1 69例住院患者VKORC1與CYP2C9*3基因型分布情況(n)

2.2VKORC1基因型對華法林穩(wěn)定劑量及PT-INR達(dá)標(biāo)天數(shù)的影響 VKORC1基因型AG+GG的華法林穩(wěn)定劑量和PT-INR達(dá)標(biāo)天數(shù)均大于VKORC1基因型AA,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 VKORC1基因型對華法林穩(wěn)定劑量及PT-INR達(dá)標(biāo)天數(shù)影比較

2.3CYP2C9*3基因型對華法林穩(wěn)定劑量及PT-INR達(dá)標(biāo)天數(shù)的影響 CYP2C9*3基因型AC的華法林穩(wěn)定劑量低于CYP2C9*3基因型AA,CYP2C9*3基因型AC的PT-INR達(dá)標(biāo)天數(shù)大于CYP2C9*3基因型AA,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 CYP2C9*3基因型對對華法林穩(wěn)定劑量及 PT-INR達(dá)標(biāo)天數(shù)影響比較

2.4兩種基因型組合對華法林穩(wěn)定劑量及PT-INR達(dá)標(biāo)天數(shù)的影響 VKORC1基因型AA+CYP2C9*3基因型AC的華法林穩(wěn)定劑量均低于其他VKORC1+CYP2C9*3基因型組合,VKORC1基因型AG/GG+CYP2C9*3基因型AA的華法林穩(wěn)定劑量高于其他VKORC1+CYP2C9*3基因型組合,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而VKORC1基因型AA+CYP2C9*3基因型AA的華法林穩(wěn)定劑量與VKORC1基因型AG+CYP2C9*3基因型AC比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。VKORC1基因型AA+CYP2C9*3基因型AA 的PT-INR達(dá)標(biāo)天數(shù)少于其他VKORC1+CYP2C9*3基因型組合,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);VKORC1基因型AA+CYP2C9*3基因型AC、VKORC1基因型AG/GG+CYP2C9*3基因型AA、VKORC1基因型AG+CYP2C9*3基因型AC的PT-INR達(dá)標(biāo)天數(shù)比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 兩種基因型組合對華法林穩(wěn)定劑量及PT-INR達(dá)標(biāo)天數(shù)的影響

3 討 論

華法林是臨床上使用最廣泛,也是最有效的抗凝藥物,華法林藥代動力學(xué)口服胃腸道吸收迅速而完全,生物利用度高達(dá)100%,吸收后與血漿蛋白結(jié)合率達(dá)98%～99%,由肝臟代謝,代謝產(chǎn)物經(jīng)腎臟排泄,服藥后12～18 h起效,36～48 h達(dá)抗凝高峰,維持3～6 d,血漿半衰期36～42 h?？鼓Ч资茱嬍?、合并用藥、遺傳因素等影響,其最佳劑量因不同地區(qū)、不同民族而有所差異,某些疾病如長期腹瀉或嘔吐、泛氧狀態(tài)、化療、發(fā)熱和甲狀腺功能亢進(jìn)等,以及肝功能異常、慢性腎功能不全時(shí)華法林需求也會降低;富含維生素K的食物可降低華法林療效,如酸奶酪、蛋黃、綠葉蔬菜等,某些西藥和中藥會影響華法林藥效[3]。

近年來,隨著藥物基因組學(xué)深入研究和發(fā)展,發(fā)現(xiàn)華法林藥代動力學(xué)和藥效學(xué)通路上某些基因的遺傳變異可能是造成個體間華法林差異的主要原因之一。隨著藥物基因組學(xué)的發(fā)展,全基因組關(guān)聯(lián)研究和臨床研究表明,CYP2C9和VKORC1基因在華法林發(fā)揮抗凝作用中起主要作用[4]。

VKORC1基因集中位于16號染色體上,在維生素K依賴性凝血因子(Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ)生成中發(fā)揮著主導(dǎo)作用,屬于華法林作用靶點(diǎn)。有研究證實(shí)[5],VKORC1等位基因A突變?yōu)榈任换騁,可促使VKORC1蛋白合成及其酶活性明顯降低,如需達(dá)到相同的抗凝強(qiáng)度,所需華法林劑量明顯增加,首次達(dá)標(biāo)時(shí)間明顯延長。本研究結(jié)果顯示,VKORC1基因型AG+GG的華法林穩(wěn)定劑量和PT-INR達(dá)標(biāo)天數(shù)均大于VKORC1基因型AA,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與武元竹等[6]研究結(jié)果一致。

華法林是R-華法林和S-華法林對映異構(gòu)物外消旋混合物,其中S-華法林的抗凝活性是R-華法林的3～5倍,并主動經(jīng)CYP2C9酶代謝。CYP2C9基因位于10號染色體上,具有高度遺傳多態(tài)性,其中CYP2C9*2和CYP2C9*3最為常見[7-9]。CYP2C9作為華法林的S異構(gòu)體代謝酶,其*2與*3位點(diǎn)基因變異可導(dǎo)致CYP2C9酶活性降低,致使華法林S異構(gòu)體代謝減弱,華法林血藥濃度增加,出現(xiàn)過度抗凝,增加患者出血風(fēng)險(xiǎn)。有研究顯示*2與*3位點(diǎn)基因變異可分別使華法林S異構(gòu)體代謝降低30%～40%和80%～90%,故此類人群達(dá)到相同抗凝強(qiáng)度,所需華法林劑量明顯減少[10-11]。本研究結(jié)果顯示,CYP2C9*3基因型AC的華法林穩(wěn)定劑量低于CYP2C9*3基因型AA,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說明華法林代謝藥物在體內(nèi)蓄積,造成血藥濃度增高。

本研究結(jié)果顯示,VKORC1基因型AA+CYP2C9*3基因型AC的華法林穩(wěn)定劑量均低于其他VKORC1+CYP2C9*3基因型組合,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),可能是由于作用靶點(diǎn)正常,而代謝酶活性下降,其血藥濃度升高引起的;VKORC1基因型AG/GG+CYP2C9*3基因型AA的華法林穩(wěn)定劑量高于其他VKORC1+CYP2C9*3基因型組合,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),可能是由于作用靶點(diǎn)減少,為了達(dá)到足夠抗凝效果,需要更高劑量來維持。與武元竹等[6]研究結(jié)果一致。

基于華法林藥物基因組學(xué)(包括基因型)構(gòu)建藥物模型,華法林藥物基因組學(xué)聯(lián)合會建立華法林劑量公益網(wǎng)站(www.warfarindosing.org),可根據(jù)患者的基因型和臨床特征(如性別、種族、年齡、身高、體重、臨床診斷、用藥情況等)自動計(jì)算出華法林推薦劑量。既往多項(xiàng)研究表明,性別、年齡、身高、體重、CYP2C9、VKORC1基因多態(tài)性可以解釋30%～60%的華法林劑量個體差異[12-14]。當(dāng)然還有其他基因如CYP4F2、APOE、GGCX、EPHX1基因多態(tài)性也是華法林個體差異的重要影響因素[15]。目前,為了減少經(jīng)驗(yàn)性用藥造成PT-INR達(dá)標(biāo)天數(shù)的延長,臨床上可以運(yùn)用遺傳藥理學(xué)算法預(yù)測華法林劑量,開展個體化用藥指導(dǎo)。

綜上所述,VKORC1和CYP2C9*3兩個基因位點(diǎn)多態(tài)性與華法林穩(wěn)定劑量和PT-INR達(dá)標(biāo)天數(shù)有關(guān),在臨床相關(guān)疾病抗凝過程中需考慮其影響,指導(dǎo)個體化用藥,努力減少經(jīng)驗(yàn)性用藥,縮短PT-INR達(dá)標(biāo)天數(shù),早日達(dá)到滿意抗凝效果。