具有氨氮降解能力的海洋芽孢桿菌的篩選及其降解能力研究

趙玲，叢明，鞠寶，呂家森

(1.煙臺大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺 264000；2.煙臺大學(xué)海洋學(xué)院，山東 煙臺 264000)

我國是水產(chǎn)養(yǎng)殖大國，高密度養(yǎng)殖過程中殘余餌料、動物排泄物等殘留在水中，對水體環(huán)境造成一定程度的污染[1]。 污染物主要有懸浮顆粒物、有機物、無機氮磷等[2]。 根據(jù)《2021 年中國生態(tài)環(huán)境狀況公報》，對大部分水產(chǎn)養(yǎng)殖資源區(qū)和養(yǎng)殖水域進行監(jiān)測，結(jié)果顯示，無機氮為主要超標物質(zhì)，無機氮濃度優(yōu)于評價標準的面積占所監(jiān)測面積的40.9%[3]。 研究表明，過量的氨氮對蝦、魚類等海水養(yǎng)殖動物產(chǎn)生毒害作用，甚至致其死亡，從而影響?zhàn)B殖經(jīng)濟[4]。 例如氨氮破壞魚鰓的表皮、粘膜、神經(jīng)系統(tǒng)，破壞紅血球并降低氧結(jié)合的能力，使呼吸機能下降，肝腎系統(tǒng)遭受破壞，體表及內(nèi)臟充血、肌肉增生及出現(xiàn)腫瘤[5]。

處理氨氮一般有物理、化學(xué)、生物等方法，由于物理、化學(xué)方法消耗能量多、技術(shù)成本高、污染嚴重，在海水養(yǎng)殖池塘中應(yīng)用受限[1]。 生物方法主要有施加微生物制劑、給養(yǎng)殖水體補充微型綠藻和單細胞硅藻等，由于其良好環(huán)保特性、操作簡單，越來越得到人們的認可。 王珺等[6]篩選出兩株氨氮降解菌株，經(jīng)鑒定分別為淺黃色假單胞菌(Pseudomonas lurida)和魏氏假單胞菌(P.weihenstephanensis)，其對養(yǎng)殖海水氨氮降解率可達95%以上。 阮明君等[7]篩選到一株氨氮降解率為62.82%的異養(yǎng)硝化細菌，為不動桿菌屬(Acinetobactersp.)。 本研究擬從海洋環(huán)境中分離篩選出能高效降解氨氮的芽孢桿菌，為進一步開發(fā)應(yīng)用海水凈化微生態(tài)菌劑提供菌種支持。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

樣品采自山東省煙臺市周邊海域。

1.2 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:氯化鈉0.5%、牛肉膏0.5%、蛋白胨1%、陳海水1 000 mL，pH 7.0，瓊脂1.5%～2.0%。

篩選培養(yǎng)基:硫酸銨0.2%、葡萄糖0.5%、氯化鈉0.2%、磷酸氫二鉀0.1%、硫酸亞鐵0.04%、硫酸鎂0.05%、陳海水1 000 mL，pH 7.0，瓊脂1.5%～2.0%[8]。

基礎(chǔ)降解液一:氯化銨0.1605 g、葡萄糖0.5 g、陳海水1 000 mL，pH 7.0。

基礎(chǔ)降解液二:葡萄糖0.5 g、陳海水1 000 mL，pH 7.0[9]。

1.3 菌株的分離與篩選

1.3.1 菌株的分離 將采集的海水在80℃水浴鍋中加熱20 min，殺死營養(yǎng)體。 將1 mL 海水與1 mL 海泥懸濁液按梯度稀釋后，吸取0.05 mL 在篩選培養(yǎng)基上涂布，27℃恒溫培養(yǎng)3 ～5 d，挑出形態(tài)、顏色、大小不一樣的菌落，劃線分離，純化兩到三次，試管斜面保存。

1.3.2 菌株的篩選 利用基礎(chǔ)降解液一與基礎(chǔ)降解液二篩選對氨氮去除率高的菌株。 分離菌株在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，將不同菌液稀釋到相同吸光度(A≈0.28)，取3 mL 稀釋過的菌液8 000 r/min 離心10 min，用無菌生理鹽水洗滌3 次，接種于100 mL 基礎(chǔ)降解液中，170 r/min、27℃搖床中培養(yǎng)48 h。 分別在試驗初始和結(jié)束時測定培養(yǎng)液中的氨氮(NH＋4-N)濃度，挑選具有較高效脫氮能力的菌株進行進一步研究。

氨氮去除率(%)＝(處理前氨氮濃度-處理后氨氮濃度)/處理前氨氮濃度×100 。

1.4 菌株鑒定

1.4.1 形態(tài)和生理生化試驗 對菌株進行形態(tài)觀察，生理生化特征試驗參考《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[10]。

1.4.2 分子鑒定 采用通用引物27F(5′-AGTTTGATCMTGGCTCAG- 3′) 和1492R (5′ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)擴增16S rDNA 序列。 反應(yīng)體系(25 μL):10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP (each 10 mmol/L)1 μL，TaqPlus DNA Polymerase(5 U/μL)0.2 μL，MgSO4(50 mmol/L)8.8 μL，引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。 PCR 擴增條件:95℃5 min；94℃30 s，57℃30 s，72℃90 s，共30 個循環(huán)；72℃10 min。PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，由生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。 測序結(jié)果在NCBI 數(shù)據(jù)庫進行比較分析，選取同源性高的菌株序列在MEGA-X 軟件上采用Neighbor-joining 算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 菌株生長曲線測定

菌株活化后接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，接種量2%，170 r/min、27℃培養(yǎng)，測定OD600值。每2 h 測定一次，共重復(fù)測定3 組，選取平均值，以時間為橫坐標，OD600值為縱坐標，繪圖。

1.6 菌株氨氮降解性能影響因素研究

選取時間、溫度、pH 值、轉(zhuǎn)速、接種量5 個條件，研究不同因素對菌株氨氮降解能力的影響。時間設(shè)置為1、2、3、4、5、6、7 d，溫度設(shè)置為22、27、32、37、42℃，pH 值設(shè)置為4、5、6、7、8、9，轉(zhuǎn)速設(shè)置為50、120、170、220、270 r/min，接種量設(shè)置為2%、4%、6%、8%、10%。 根據(jù)以上設(shè)置單一變量，接種于基礎(chǔ)降解液二中，除時間組外其余組搖床振蕩培養(yǎng)48 h 取樣，以未接菌作為空白對照，檢測氨氮濃度變化。

1.7 混料設(shè)計確定菌株復(fù)配比

應(yīng)用軟件Design-Expert 10.0.4，以菌株X6和X37 為自變量，以氨氮的去除率為因變量，兩株菌的比例邊界設(shè)置為0 ～1。 將兩株菌按照表2中的比例接種到基礎(chǔ)降解液二中，在30℃、pH 6.5、轉(zhuǎn)速170 r/min、接種量6%條件下培養(yǎng)48 h測定氨氮含量。 通過軟件對結(jié)果進行分析，確定最佳復(fù)配比例，并按照最佳復(fù)配比進行驗證試驗。

1.8 復(fù)合菌劑的氨氮降解性能研究

將復(fù)合菌劑按照1.7 混料設(shè)計出的最佳比例接種到基礎(chǔ)降解液二中，分別在2、4、6 d 檢測培養(yǎng)基中的氨氮、亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮的含量。

氨氮的檢測采用納式試劑分光光度法[11]；亞硝態(tài)氮的檢測采用分子吸收分光光度法[12]；硝態(tài)氮的測定采用紫外分光光度法[13]。 菌體生長在可見分光光度計上測定，波長設(shè)定600 nm。

1.9 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS R26.0.0.0、Microsoft Excel(97-2003)、Design Expert 10.0.4 對數(shù)據(jù)進行分析處理，用OriginPRO(2022b)和MEGA-X 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離與篩選

2.1.1 菌株的分離 從煙臺周邊海水及海泥中采集的樣品，經(jīng)過初步分離純化，得到61 株可以利用氨氮的菌株，分別將其命名為X1～X61。

2.1.2 菌株的篩選 在初始氨氮濃度為63.27 mg/L 左右的基礎(chǔ)降解液一中61 株菌的氨氮利用情況見圖1。 菌株X6、X10、X11、X19、X25、X26、X37、X58 的氨氮去除率高于其他菌株，分別為61.02%、42.86%、43.70%、42.96%、58.31%、54.53%、50.96%、45.97%。 因此，選擇以上8 株菌進行后續(xù)試驗。

圖1 61 株候選菌株48 h 的氨氮去除率

基礎(chǔ)降解液二中接入在基礎(chǔ)降解液一中氨氮去除率較高的菌株，初始氨氮濃度為27.00 mg/L左右，氨氮去除率結(jié)果見圖2。 8 株菌的氨氮去除率分別為35.30%、28.49%、34.07%、26.56%、28.72%、27.74%、35.53%、22.81%。 其中菌株X6、X37 氨氮去除率高于其他菌株，因此，選擇菌株X6、X37 進行后續(xù)試驗。

圖2 8 株菌株在基礎(chǔ)降解液二中的氨氮去除率

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)和生理生化特征 菌株X6 的菌落形態(tài)為圓形，邊緣整齊，表面光滑，顏色為淡黃色，革蘭氏陽性，菌體桿狀。 菌株X37 菌落暗黃色，邊緣不整齊，表面有褶皺，不透明，革蘭氏陽性，菌體桿狀。 生理生化特征如表1 所示。

表1 菌株X6 和X37 的生理生化特征

2.2.2 菌株16S rDNA 基因測序和系統(tǒng)發(fā)育樹分析 菌株X6 和X37 的16S rDNA 基因序列分別為1 249 bp 和1 451 bp，經(jīng)Blast 比對，發(fā)現(xiàn)菌株X6 和X37 與Bacillussp.菌株的16S rDNA 基因序列相似性高。 將這兩株菌與同源性高的細菌進行系統(tǒng)發(fā)育分析(圖3)，結(jié)合形態(tài)和生理生化特征，確定菌株X6 為花津灘芽孢桿菌(Bacillus hwajinpoensis)，菌株X37 為巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)。

圖3 基于16S rDNA 基因序列同源性構(gòu)建的菌株X6、X37 的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 菌株的生長曲線

如圖4 所示，菌株X6 和X37 在0 ～4 h 處于生長延滯期，4 h 后開始進入對數(shù)生長期，生長加快，尤其在6～10 h 期間生長最快，菌株X6 在14 h 進入穩(wěn)定期，菌株X37 在12 h 進入穩(wěn)定期。

圖4 菌株X6 和X37 的生長曲線

2.4 不同因素對菌株降解氨氮性能的影響

2.4.1 時間對菌株氨氮去除率的影響 由圖5可知，菌株X6 和X37 在7 d 內(nèi)的氨氮去除率整體均呈上升趨勢，兩株菌在1 ～2 d 時間內(nèi)氨氮去除率增長最快，菌株X6 從9.95%上升到33.07%，X37 從14.90%上升到35.15%。 菌株X6 在4、7 d時氨氮去除率下降，X37 在5、7 d 時氨氮去除率下降，原因可能是該時期部分菌體死亡或發(fā)生反硝化作用。

圖5 不同時間菌株X6、X37 的氨氮去除率

2.4.2 溫度對菌株氨氮去除率的影響 由圖6 可知，兩菌株在22 ～42℃均有氨氮去除能力。 菌株X6 在22℃時生長緩慢，氨氮去除率為24.97%；在32℃時生長最好，氨氮去除率也最高，為36.60%；當溫度達到42℃時，生長受抑制，氨氮去除率降低，為26.95%。 菌株X37 在27℃時生長最好，氨氮去除率最高，為37.54%，其他時間的氨氮去除率差別不大，在22℃和42℃的氨氮去除率分別為29.80%、29.43%，比菌株X6 在該溫度下的去除率高。

圖6 溫度對菌株X6、X37 氨氮去除率的影響

2.4.3 pH 值對菌株氨氮去除率的影響 由圖7可知，pH 值對菌株X6 氨氮去除率的影響整體呈先上升后下降的趨勢。 在pH ＝4 時，氨氮去除率為27.37%；pH 值升高至7，氨氮去除率升高為35.37%；在pH 值9 時降為30.54%。 pH 值對菌株X37 的去除率影響也呈先上升后下降的趨勢，在pH＝6 時，菌株氨氮去除率最高，為37.95%，在pH值為5、8 時氨氮去除率分別為36.82%、33.21%，比菌株X6 在該pH 值下的去除率高。

圖7 pH 值對菌株X6、X37 氨氮去除率的影響

2.4.4 轉(zhuǎn)速對菌株氨氮去除率的影響 由圖8可知，菌株X6、X37 的氨氮去除率隨著轉(zhuǎn)速的升高先上升后降低，在170 r/min 時氨氮去除率最高，分別為37.95%、36.75%。 當轉(zhuǎn)速較低時，由于溶解氧不足，導(dǎo)致菌體生長代謝受到影響，影響氨氮去除率；轉(zhuǎn)速太高時，菌株碰壁可能會引起菌株受損，從而影響氨氮去除率。

圖8 轉(zhuǎn)速對菌株X6、X37 氨氮去除率的影響

2.4.5 接種量對菌株氨氮去除率的影響 由圖9可知，兩株菌在不同接種量條件下氨氮去除率差異不明顯，表明接種量對氨氮去除率的影響不大。

圖9 接種量對菌株X6、X37 氨氮去除率的影響

2.5 菌株的配比優(yōu)化

以A(X6)、B(X37)為自變量，接種量為6%，菌種對氨氮的去除率為因變量，設(shè)計方案如表2。通過統(tǒng)計分析軟件Design-Expert 10.0.4 對結(jié)果進行分析，建立氨氮去除率的回歸模型方程:Y ＝35.64A＋31.71B＋84.38AB-7.06AB(A-B)-77.88 AB(A-B)2。 式中，Y 為氨氮去除率，A 為菌株X6的質(zhì)量分數(shù)，B 為菌株X37 的質(zhì)量分數(shù)。

表2 菌株復(fù)配設(shè)計方案及結(jié)果

對氨氮去除率回歸方程進行方差分析可知，該模型回歸顯著(P＜0.0001)，失擬項不顯著(P＝0.1610)。 R2＝0.9989，校正后R2＝0.9983，均大于0.99，說明該模型能很好地擬合氨氮去除率與菌種配比的關(guān)系。 通過F 值和P值可知，AB 交互作用對菌種氨氮去除率影響顯著。 即A∶B ＝1∶1時，氨氮去除率最高，為54.66%。

2.6 驗證試驗

對2.5 得到的結(jié)果進行驗證，結(jié)果顯示，當X6 ∶X37 ＝1∶1 時，氨氮降解率為54.768%。 驗證結(jié)果表明，氨氮去除率與預(yù)測值差異較小，軟件得到的結(jié)果具有意義。

2.7 復(fù)合菌劑對無機氮的降解

將復(fù)合菌劑接種到基礎(chǔ)降解液二中，按照2.5中的試驗條件培養(yǎng)2、4、6 d，結(jié)果如圖10 所示:氨氮濃度從38.98 mg/L 降低到12.99 mg/L，48 h 降解率為53.82%；硝態(tài)氮濃度呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，可能發(fā)生了同化作用和硝化作用[14]；亞硝態(tài)氮濃度呈現(xiàn)下降的趨勢，但整體上變化不大。OD600值總體呈上升趨勢。 表明該菌株可能有硝化和反硝化的功能，能利用氨氮、硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮。

圖10 復(fù)合菌劑對無機氮的降解

3 討論

3.1 菌株的分離、篩選和鑒定

研究發(fā)現(xiàn)許多菌株均能利用氨氮，例如弗式檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)[15]、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)[16]、糞產(chǎn)堿菌(Alcaligenes faecalisNo.4)[17]、泛營養(yǎng)副球菌(Paracoccus pantotrophus)、產(chǎn)堿菌(Alcaligenessp.)、戈爾多尼亞菌(Gordonia terrae)[18]等。 從這些菌株中找到能高效利用氨氮的菌株，或者發(fā)掘新的氨氮去除率高的菌株，對氨氮廢水的處理有重要意義。 本試驗共篩選到61 株可以利用氨氮的芽孢桿菌，復(fù)篩得到兩株氨氮去除率較高的菌株，同時具有耐高溫、耐高鹽的特點，適用于含氨氮廢水的處理。

3.2 環(huán)境因素對菌株氨氮去除率的影響

研究表明，溫度、pH 值、轉(zhuǎn)速、時間都對菌株氨氮去除率有影響，接種量對菌株的氨氮去除率沒有明顯影響。 結(jié)合生長曲線表明環(huán)境因素對菌株氨氮去除率的影響與菌株生長情況有一定的關(guān)系。

3.3 兩株菌的復(fù)配

將兩株菌(X6、X37)以1∶1 最優(yōu)組合比進行復(fù)配，降解率達到54.768%，低于成鈺[19]從刺參養(yǎng)殖環(huán)境中篩選到的花津灘芽孢桿菌。 其原因可能是篩選環(huán)境和降解環(huán)境及菌株的營養(yǎng)條件不同導(dǎo)致降解效果有所區(qū)別。 兩株菌按1∶1 復(fù)配時比單個菌株的降解效果好，具體作用原理還有待研究。

芽孢桿菌抗逆性強、作用廣泛，可應(yīng)用在許多領(lǐng)域中。 楊傳倫等[20]的試驗表明，枯草芽孢桿菌能高效拮抗霍亂弧菌。 孫筱君等[21]的研究表明，芽孢桿菌在除臭方面有明顯效果。 Liu 等[22]從鈣質(zhì)根際土壤中篩選出的巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等均具有良好的解磷效果。 Ma 等[23]篩選出的枯草芽孢桿菌能在一天之內(nèi)完全降解亞硝態(tài)氮，溶解氧用量極少，可利用于水產(chǎn)養(yǎng)殖。

4 結(jié)論

本試驗共分離出61 株可利用氨氮的菌株，復(fù)篩得到2 株氨氮去除效果較好的菌株，分別為花津灘芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌。 花津灘芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌在初始氨氮濃度為63.27 mg/L 時48 h去除率分別為61.02%、50.96%，在初始濃度為27.00 mg/L 的培養(yǎng)基中48 h 氨氮去除率分別為35.30%、35.53%。

花津灘芽孢桿菌在32℃、pH 7.0、轉(zhuǎn)速為170 r/min 時氨氮去除率最高，巨大芽孢桿菌在27℃、pH 6.0、轉(zhuǎn)速為170 r/min 時氨氮去除率最高。 接種量對兩株菌的氨氮去除率影響不大。 在2 d 時的氨氮去除速率高于其他時間。 兩株菌復(fù)配時比單個菌株的去除效果好，最佳復(fù)配比例為1∶1。