RNA-linc00858和miR-3182在宮頸癌組織表達(dá)變化、對(duì)宮頸癌細(xì)胞株侵襲遷移調(diào)控作用及靶向關(guān)系

吳穎，魏敏，冀瑞晴，王建，羅彩霞，單燕麗

1 徐州醫(yī)科大學(xué)研究生院，江蘇徐州 221004；2 徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院婦科；3 新疆維吾爾自治區(qū)伊犁哈薩克自治州友誼醫(yī)院婦產(chǎn)科

宮頸癌（CC）的發(fā)病率和病死率居女性生殖惡性腫瘤的首位。宮頸癌的發(fā)病率逐年上升，呈年輕化趨勢(shì)［1］。目前，宮頸癌的主要治療方法有腫瘤切除術(shù)、放療和化療，對(duì)于中晚期宮頸癌患者中放療不耐受、不敏感以及宮頸癌復(fù)發(fā)患者的療效不佳［2-3］。尋找新的、更有效的宮頸癌治療方法是目前的研究熱點(diǎn)。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（LncRNA）是一類長(zhǎng)度超過200 個(gè)核苷酸的轉(zhuǎn)錄本［4］。研究［5］發(fā)現(xiàn)，LnCRNAlinc00858 在肺癌、結(jié)直腸癌、骨肉瘤等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。微小RNA-3182（miR-3182）是一種miRNA，可抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展［6］。但linc00858 與miR-3182 在宮頸癌組織中的表達(dá)變化及其在宮頸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中的相關(guān)研究較少。為此，2022 年1 月—2023 年1 月，我們觀察了linc00858 和miR-3182 在宮頸癌組織表達(dá)變化、對(duì)宮頸癌細(xì)胞株侵襲遷移的調(diào)控作用，分析宮頸癌細(xì)胞中l(wèi)inc00858、miR-3182 的靶向關(guān)系?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 宮頸癌及癌旁組織linc00858、miR-3182 檢測(cè) 選取徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院2022 年1—6 月間收治的宮頸癌患者40 例，均接受宮頸癌根治術(shù)治療，術(shù)中保留宮頸癌及其相應(yīng)癌旁組織（癌組織2cm 外組織）標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理學(xué)診斷為宮頸癌；②年齡45～60 歲；③臨床分期ⅠB1～ⅡA1期；④入院前未經(jīng)過放療、化療等治療；⑤患者臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他腫瘤；②并非原發(fā)灶，由其他腫瘤轉(zhuǎn)移所致；③存在嚴(yán)重的肝腎功能損傷、心肺疾病史，不能耐受手術(shù)。該研究方案已獲得徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（XYFY2022-KL193-01）。宮頸癌及癌旁組織標(biāo)本均在患者知情同意情況下獲取。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）法檢測(cè)宮頸癌及癌旁組織linc00858、miR-3182 的表達(dá)。TRIzol 法提取宮頸癌及癌旁組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR 擴(kuò)增：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s，70 ℃退火延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)。以18S 及U6 為內(nèi)參，以2-ΔΔCt代表linc00858、miR-3182 相對(duì)表達(dá)量。linc00858 上游引物：5’- CCCAGCTCCTTACACACGTT-3’，下游引物：5’-TTCAGAGGCCTGCATCACTG-3’；miR-3182 上游引物：5’-CACTCAGCTGGCTTCTGTAGTG-3’，下游引物：5’- CTGGTGTCGTGGAGTCG-3’。重復(fù)檢測(cè)3次，取平均值。

1.2 linc00858、miR-3182 對(duì)人宮頸癌細(xì)胞株遷移侵襲的調(diào)控作用觀察

1.2.1 受試細(xì)胞篩選 人宮頸癌細(xì)胞株CaSki、Si-Ha、ME180、MS751 及人正常宮頸上皮細(xì)胞株Ect1/E6E7（ATCC 細(xì)胞庫(kù)），接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基，5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CaSki、SiHa、ME180、MS751 及Ect1/E6E7細(xì)胞，采用RT-qPCR 法檢測(cè)linc00858、miR-3182 的表達(dá)，所有操作均同“1.1”。CaSki、SiHa、ME180、MS751 及Ect1/E6E7 細(xì)胞linc00858 相對(duì)表達(dá)量分別為3.11 ± 0.45、4.45 ± 0.44、6.22 ± 0.67、6.67 ± 0.78、1.00 ± 0.00，miR-3182 相對(duì)表達(dá)量分別為0.58 ± 0.08、0.60 ± 0.07、0.48 ± 0.04、0.69 ±0.07、1.00 ± 0.00。與Ect1/E6E7 細(xì)胞比較，4 種宮頸癌細(xì)胞linc00858相對(duì)表達(dá)量高，miR-3182相對(duì)表達(dá)量低（P均＜0.01）。選擇linc00858 表達(dá)量最高的MS751進(jìn)行后續(xù)研究。

1.2.2 MS751 細(xì) 胞 分 組 及 si-linc00858 、OE-linc00858 轉(zhuǎn)染方法 培養(yǎng)48 h 時(shí)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MS751 細(xì)胞，分為4 個(gè)組（1、2、3、4 組），每組6 個(gè)復(fù)孔。 1～4 組分別轉(zhuǎn)染si-linc00858（小干擾linc00858，沉默linc00858 表達(dá)）、OE-linc00858（過表達(dá)linc00858）、si-NC（小干擾陰性對(duì)照）、OE-NC（過表達(dá)陰性對(duì)照），所有操作均嚴(yán)格按照Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行，培養(yǎng)8h后更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 各組細(xì)胞侵襲、遷移情況觀察 轉(zhuǎn)染48 h時(shí)取各組細(xì)胞，采用Transwell 實(shí)驗(yàn)觀察各組細(xì)胞侵襲、遷移情況。所有操作嚴(yán)格按照使用說明書進(jìn)行，于倒置顯微鏡下隨機(jī)取3 個(gè)視野拍照（×200），計(jì)算各組侵襲細(xì)胞數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)檢測(cè)3次，取平均值。

1.2.4 各組細(xì)胞linc00858、miR-3182 檢測(cè) 培養(yǎng)48 h 時(shí)取轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞，采用RT-qPCR 法檢測(cè)各組細(xì)胞linc00858、miR-3182 的表達(dá)。所有操作同“1.1”。重復(fù)測(cè)算3次，取平均值。

1.3 MS751細(xì)胞中l(wèi)inc00858與miR-3182的靶向關(guān)系分析 分別采用RNA 免疫沉淀測(cè)定（RIP）實(shí)驗(yàn)、雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)分析MS751 細(xì)胞中l(wèi)inc00858與miR-3182 的靶向關(guān)系。①RIP 實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MS751 細(xì)胞分為兩組，根據(jù)Magna RIPTM RNA 結(jié)合蛋白免疫沉淀試劑盒的說明，分別加入抗AGO2抗體和IgG 抗體（陰性對(duì)照），在RIP 緩沖液中加入linc00858與miR-3182抗體結(jié)合磁珠，處理細(xì)胞裂解物，提取沉淀RNA，采用RT-qPCR 方法檢測(cè)linc00858 與miR-3182。重復(fù)檢測(cè)3 次，取平均值。沉淀RNA 相對(duì)表達(dá)量具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異說明linc00858 與miR-3182 間存在靶向關(guān)系。②雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)：構(gòu)建含有結(jié)合位點(diǎn)的野生型載體WT-linc00858 與含有突變位點(diǎn)的突變型載體MUTlinc00858。將MS751 細(xì)胞分為一、二、三、四組，分別轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-linc00858 + NC-miR、WT-linc00858+miR-3182 mimics （miR-3182 模 擬 物 ） 、MUT-linc00858+NC-miR 、MUT-linc00858 + miR-3182 mimics，轉(zhuǎn)染24 h時(shí)檢測(cè)各組相對(duì)熒光素酶活性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s描述，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，采用Spearman 相關(guān)性分析分析宮頸癌組織中l(wèi)inc00858 和miR-3182 的相關(guān)性。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌及癌旁組織linc00858、miR-3182 相對(duì)表達(dá)量比較 宮頸癌、癌旁組織linc00858 相對(duì)表達(dá)量分別為2.73 ± 0.22、1.00 ± 0.00，二者比較，P＜0.05。宮頸癌、癌旁組織miR-3182 相對(duì)表達(dá)量分別為1.00 ± 0.00、0.71 ± 0.04，二者比較，P＜0.05。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，宮頸癌組織中l(wèi)inc00858和miR-3182的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=0.343 2，P＜0.05）。

2.2 培養(yǎng)48 h 時(shí)各組細(xì)胞linc00858、miR-3182 相對(duì)表達(dá)量比較 培養(yǎng)48 h 時(shí)1、2、3、4 組細(xì)胞linc00858 相對(duì)表達(dá)量分別為0.45 ± 0.05、4.31 ±0.56、1.00 ± 0.00、1.00 ± 0.00，與3 組比較，1 組細(xì)胞linc00858 相對(duì)表達(dá)量低，與4 組比較，2 組細(xì)胞linc00858 相對(duì)表達(dá)量高（P均＜0.05）。培養(yǎng)48 h 時(shí)1、2、3、4 組細(xì)胞miR-3182相對(duì)表達(dá)量分別為4.36 ±0.60、0.54 ± 0.03、1.00 ± 0.00、1.00 ± 0.00，與3組比較，1 組細(xì)胞miR-3182 相對(duì)表達(dá)量高，與4 組比較，2組細(xì)胞miR-3182相對(duì)表達(dá)量低（P均＜0.05）。

2.3 MS751 細(xì)胞linc00858 與miR-3182 的靶向關(guān)系 ①RIP法分析結(jié)果為，加入抗AGO2抗體、IgG抗體的MS751細(xì)胞 linc00858和miR-3182沉淀RNA 相對(duì)表達(dá)量分別為0.68 ± 0.08、0.05 ± 0.02，二者比較，P＜0.05。 說明MS751 細(xì)胞中l(wèi)inc00858與miR-3182 存在靶向關(guān)系。②雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果為，一、二、三、四組細(xì)胞熒光素酶活性分別為1.00 ± 0.00、0.48 ± 0.04、1.00 ± 0.00、0.96 ±0.11。與一組比較，二組細(xì)胞熒光素酶活性低（P＜0.05），說明MS751 細(xì)胞中l(wèi)inc00858 與miR-3182 存在靶向關(guān)系。

2.4 培養(yǎng)48 h時(shí)各組細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)比較 培養(yǎng)48 h時(shí)1、2、3、4 組MS751 細(xì)胞遷移數(shù)分別為0.49 ± 0.05、3.71 ± 0.13、1.00 ± 0.00、1.00 ±0.00，與3 組比較，1 組細(xì)胞遷移數(shù)少，與4 組比較，2組細(xì)胞遷移數(shù)多（P均＜0.05）。培養(yǎng)48 h時(shí)1、2、3、4組MS751 侵襲細(xì)胞數(shù)分別為0.46 ± 0.06、2.84 ±0.21、1.00 ± 0.00、1.00 ± 0.00，與3 組比較，1 組細(xì)胞侵襲數(shù)少，與4 組比較，2 組細(xì)胞侵襲數(shù)多（P均＜0.05）?；貜?fù)實(shí)驗(yàn)顯示，培養(yǎng)48 h 時(shí)si-NC 組、si-linc00858 組、si-linc00858 + miR-3182 inhibitor 組MS751 細(xì)胞的遷移數(shù)分別為1.00 ± 0.00、0.55 ±0.08、0.91 ± 0.15，與si-NC 組比較，si-linc00858 組細(xì)胞遷移數(shù)少，與si-linc00858 組比較，si-linc00858+ miR-3182 inhibitor 組細(xì)胞遷移數(shù)多（P均＜0.05）。培養(yǎng)48 h 時(shí)si-NC 組、si-linc00858 組、si-linc00858+ miR-3182 inhibitor 組MS751 細(xì)胞的侵襲數(shù)分別1.00 ± 0.00、0.55 ± 0.09、0.87 ± 0.01，與si-NC 組比較，si-linc00858 組細(xì)胞侵襲數(shù)少，與si-linc00858組比較，si-linc00858 + miR-3182 inhibitor 組細(xì)胞侵襲數(shù)多（P均＜0.05）。

3 討論

宮頸癌是發(fā)病率僅次于乳腺癌的女性第二常見惡性腫瘤。據(jù)報(bào)道，宮頸癌患者因腫瘤生長(zhǎng)快、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高等特點(diǎn)，預(yù)后較差［7］。進(jìn)一步探究宮頸癌的發(fā)病機(jī)制以及尋求新的分子標(biāo)記物對(duì)宮頸癌的診斷、治療和改善預(yù)后有著重要的意義。近年來，lncRNA 作為多種疾病分子基礎(chǔ)的一部分被廣泛研究，是腫瘤領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。據(jù)報(bào)道，lncRNA 與癌癥的發(fā)生密切相關(guān)，它可以調(diào)節(jié)DNA 甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑，并作為miRNA 的前體，最終誘導(dǎo)癌癥的發(fā)生［8］。與此同時(shí)，lncRNA 也可以與ceRNA 等與癌癥發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的驅(qū)動(dòng)基因競(jìng)爭(zhēng)miRNA 反應(yīng)元件，從而削弱miRNA 對(duì)靶基因的抑制，間接調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)水平，最終參與癌癥的調(diào)控過程［9］。LncRNA 在宮頸癌中異常表達(dá)，并通過不同的分子機(jī)制來參與調(diào)控宮頸癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等過程［10］，有望成為治療宮頸癌的有效靶點(diǎn)和預(yù)測(cè)預(yù)后的重要分子生物標(biāo)志物。

Linc00858 （位于10q23.1 上，長(zhǎng)度為2 685 nt）是一種新型的lncRNA，已被認(rèn)為是致癌基因，它通過調(diào)節(jié)復(fù)雜的ceRNA 網(wǎng)絡(luò)促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展。最先在肺癌中被研究，其在肺癌組織及細(xì)胞中異常高表達(dá)，且linc00858 的上調(diào)促進(jìn)了肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和EMT［11］。我們前期研究中，linc00858 在宮頸癌細(xì)胞中表達(dá)水平顯著上調(diào)，并通過miR-3064-5p/VMA21 軸促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡［12］，提示linc00858 與宮頸癌等腫瘤的惡性行為相關(guān)。因此為了深入研究linc00858 在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用，本研究首先檢測(cè)了linc00858 在宮頸癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在宮頸癌組織中l(wèi)inc00858 的表達(dá)明顯高于癌旁組織，MS751 細(xì)胞中l(wèi)inc00858 的表達(dá)高于Ect1/E6E7 細(xì)胞，與之前的研究結(jié)果相一致。干擾linc00858 顯著抑制宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，提示linc00858 可能成為治療宮頸癌的潛在靶點(diǎn)，這與linc00858 在肺癌［11］、胃癌［13］以及結(jié)直腸癌［14］等惡性腫瘤中的作用相吻合。多項(xiàng)研究表明linc00858 的異常高表達(dá)與腫瘤不良預(yù)后相關(guān)，Ai 等［15］發(fā)現(xiàn)，linc00858 的高表達(dá)與胃癌的TNM 分期和淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)，linc00858高表達(dá)患者的總生存期和無(wú)病生存期明顯低于低表達(dá)患者。然而linc00858 的表達(dá)與患者的年齡、腫瘤直徑、FIGO分期、TNM、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及能否成為預(yù)測(cè)宮頸癌預(yù)后的生物標(biāo)志物有待我們通過臨床試驗(yàn)的進(jìn)一步分析。

MiRNA 是一種具有17～25 個(gè)核苷酸的小型非編碼RNA，已被確定為細(xì)胞過程的主要調(diào)節(jié)劑，它們?cè)谀[瘤的發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中起著至關(guān)重要的作用［16］。MiR-3182 是miRNA 家族之一，有人提出miR-3182 可作為部分腫瘤的抑制因子。在黑色素瘤的研究中，miR-3182 作為抑癌因子阻礙了黑色素瘤惡性行為的發(fā)展［17］。本研究首先通過RT-qPCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-3182 在宮頸癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平較低。通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)及RIP 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證linc00858 與miR-3182 之間存在靶向結(jié)合位點(diǎn)。上調(diào)miR-3182 的表達(dá)逆轉(zhuǎn)了linc00858 對(duì)宮頸癌細(xì)胞惡性行為的促進(jìn)作用，證實(shí)linc00858 可作為宮頸癌的促癌基因靶向負(fù)調(diào)控miR-3182 的表達(dá)。且回復(fù)實(shí)驗(yàn)表明，抑制miR-3182 的表達(dá)，可以抵消沉默linc00858 的表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞侵襲和遷移的抑制作用。

綜上所述，在宮頸癌組織及人宮頸癌細(xì)胞株中l(wèi)inc00858 高表達(dá)，miR-3182 低表達(dá)。Linc00858 可能通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-3182，抑制miR-3182 表達(dá)，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的侵襲和遷移。LncRNA 作用網(wǎng)絡(luò)是一個(gè)多層次、多方向、多交互和多維的結(jié)構(gòu)，linc00858 是否與其他miRNA/lncRNA/mRNA/RBPs通信形成RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚有待后續(xù)研究。