王雪惠　王禎輝　董學(xué)旺　郝俊　耿緒云　孫金生

摘??? 要：為獲得安全有效的牙鲆益生菌，從牙鲆（Paralichthys olivaceus）腸道分離到94株菌，經(jīng)溶血性、消化酶活力測試篩選出3株候選菌：Y1、Y5、I66，進(jìn)行16S rDNA分子鑒定，分別為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloidophilus）和蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）。經(jīng)安全性檢驗(yàn)后，開展為期4周的投喂試驗(yàn)，分別將3株菌以1×108 CFU·g-1 添加到飼料中投喂牙鲆，為3個試驗(yàn)組，同時設(shè)對照組（C），定期檢測各組魚血液先天免疫指標(biāo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，試驗(yàn)組魚淋巴細(xì)胞吞噬百分比顯著升高（P<0.05），血清堿性磷酸酶（AKP）和溶菌酶（LYZ）活性顯著升高（P<0.05），血清超氧化物歧化酶（SOD）活性極顯著升高（P<0.01）。投喂相應(yīng)飼料4周，腹腔注射溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）攻毒，試驗(yàn)組魚死亡延遲，累積死亡率顯著低于對照組（P<0.05）。綜上，Y1、Y5和I66是牙鲆安全有效的益生菌，能促進(jìn)先天免疫，提高抗病力，具有推廣應(yīng)用優(yōu)勢和潛力。

關(guān)鍵詞：牙鲆；益生菌；酶活；先天免疫；抗病力

中圖分類號：S917.1???????? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A????????? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006－6500.2023.08.007

Isolation， Screening and Evaluation of Intestinal Probiotics from Paralichthys olivaceus

WANG Xuehui1， WANG Zhenhui2， DONG Xuewang3，? HAO Jun1，? GENG Xuyun1，? SUN Jinsheng4

（1. Tianjin Fisheries Research Institute， Tianjin 300221， China; 2. Tianjin Haifa Seafood Industrial Development Company Limited，Tianjin 300452， China; 3. Tianjin Animal Disease Prevention and Control Center， Tianjin 300402， China; 4. Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance， College of Life Science， Tianjin Normal University， Tianjin 300387， China）

Abstract： To obtain safe and effective probiotics derived from flounder （Paralichthys olivaceus）， 94 strains were collected from the intestine of flounder. 3 candidate probiotics were screened out by hemolysis and digestive enzyme activity assays. Bacillus subtilis （Y1）， Bacillus amyloidophilus （Y5） and Bacillus cereus （I66） were identified by 16S rDNA molecular approach， respectively. After the safety inspection， a four-week feeding test was carried out. The 3 strains were added to the diet at 1×108 CFU·g-1， which were used as three experimental groups， and a control group （C） was set up. The blood innate immune indexes in each group were tested regularly. The results indicated that the phagocytosis percentage of lymphocytes， the activity of alkaline phosphatase （AKP） and lysozyme （LYZ） of probiotics groups were significantly higher （P<0.05） than those of the control group （C）， and the serum superoxide dismutase （SOD） activity of probiotics groups was extremely significantly increased （P<0.01）. After feeding corresponding diet for four weeks， each group subjects were injected to seroperitoneum with pathogenic Vibrio alginolyticus. The death of the probiotics group was delayed， and the cumulative mortality was significantly lower than that of the control group（P<0.05）. In conclusion， Y1， Y5 and I66 are safe and effective probiotics for flounder， which can promote innate immunity and improve disease resistance， and have advantages and potential for popularization and application.

Key words： Paralichthys olivaceus; probiotics; enzyme activity; immunity; disease resistance

牙鲆屬鰈形目，繁殖力強(qiáng)，肉質(zhì)鮮美，是我國重要的海水經(jīng)濟(jì)品種之一。隨著集約化養(yǎng)殖規(guī)模的發(fā)展，由于養(yǎng)殖環(huán)境、養(yǎng)殖密度、餌料質(zhì)量等因素的影響，疾病發(fā)生和流行在所難免[1]，傳統(tǒng)的疾病治療方法以抗生素為主，但會對魚類和水生環(huán)境產(chǎn)生諸多不良影響，包括容易造成藥物殘留和抗性因子的傳遞，產(chǎn)生抗藥性病原菌等，給動物和人體健康帶來危害，還可通過細(xì)胞間遺傳物質(zhì)的傳遞轉(zhuǎn)移給對人類健康有害的菌株[2]。而益生菌被視為綠色、健康、安全的抗生素替代品[3]，受到研究人員和產(chǎn)業(yè)界的關(guān)注，益生菌是改善魚體健康的綠色添加劑，對宿主健康有積極作用且安全性更高，在魚類養(yǎng)殖中具有很大的潛力和前景[4-7]。益生菌的英文名“Probiotic”源于希臘語，本意是“為了生命”，聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）和世界衛(wèi)生組織（WHO）共同將其定義為：益生菌是一種“活的微生物，在給予足夠劑量時，對宿主的健康起有益作用”[8]。益生菌能分泌各種酶類，通過調(diào)節(jié)宿主腸道或周圍環(huán)境菌群，激活宿主免疫防御體系，或分泌拮抗物質(zhì)與病原微生物競爭，從而對宿主產(chǎn)生有利作用[9]。Kozasa[10]1986年首次將益生菌應(yīng)用到水產(chǎn)養(yǎng)殖中，此后水產(chǎn)益生菌的篩選和應(yīng)用研究迅速發(fā)展，不論是在促進(jìn)生長還是提高抗病力方面均取得良好效果[6-7，11-12]，但也有使用效果不穩(wěn)定的報道[13]，一個重要的原因是菌株來自環(huán)境或恒溫動物。Verschuere等[14]和Ninawe等[15]學(xué)者認(rèn)為，從水產(chǎn)動物自身或環(huán)境中分離的益生菌應(yīng)用在水產(chǎn)養(yǎng)殖中效果會更佳。本研究從健康牙鲆苗種腸道分離細(xì)菌，對分離到的細(xì)菌通過潛在致病性檢驗(yàn)和消化酶活性檢測篩選出候選益生菌，篩選到的候選菌株經(jīng)安全性檢驗(yàn)后，添加到飼料中投喂牙鲆，評價其對牙鲆苗種生長和免疫效果的影響，為自身來源益生菌的開發(fā)和應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 牙鲆腸道菌的分離

試驗(yàn)魚來自天津某鲆魚養(yǎng)殖場繁育的牙鲆苗種，健康無病，沒有投喂過抗生素或其他藥物，體長約8 cm，體質(zhì)量15 g左右。用于分離牙鲆腸道菌的培養(yǎng)基為海水營養(yǎng)瓊脂（SNA）平板，具體分離方法：用50 mg·L-1魚用麻醉劑MS-222麻醉牙鲆10 min，于無菌條件下對試驗(yàn)魚進(jìn)行解剖，取腸道，去除內(nèi)容物，用無菌生理鹽水沖洗3次，放到預(yù)冷的無菌玻璃勻漿器中，每0.1 g腸道加1 mL無菌生理鹽水勻漿，得勻漿原液。勻漿原液進(jìn)行梯度稀釋，稀釋至10-5，分別取10-2、10-3、10-4、10-5 4個梯度的稀釋液0.1 mL均勻涂布于海水營養(yǎng)瓊脂（SNA）平板上，每個梯度做3個平行，25 ℃培養(yǎng)48 h以上。觀察各個平板的菌落數(shù)量、形態(tài)、顏色、大小。挑單菌落劃線純化2～3次，挑取單菌落保種備用。

1.2 牙鲆腸道菌的篩選

1.2.1 潛在致病性的檢測 將分離的腸道菌株用劃線法分別接種于血瓊脂平板（北京陸橋），25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，根據(jù)菌落的溶血特征，篩選出不溶血的菌株。

1.2.2 產(chǎn)消化酶菌株的篩選 用于消化酶活性分析的培養(yǎng)基有酪蛋白培養(yǎng)基、脫脂乳培養(yǎng)基、淀粉培養(yǎng)基和油脂培養(yǎng)基，配制方法參照《微生物試驗(yàn)》，分別用于篩選產(chǎn)酪蛋白酶、蛋白酶、淀粉酶，以及脂肪酶的菌株[16]。

1.2.3 產(chǎn)蛋白酶試驗(yàn) 將分離到的不溶血菌株分別接種到海水營養(yǎng)肉湯中，25 ℃振蕩培養(yǎng)48 h，4 500 r·min-1離心20 min，留上清液用于產(chǎn)酶試驗(yàn)。分別取受試菌上清0.1 mL加入到放置在酪蛋白培養(yǎng)基和脫脂乳培養(yǎng)基上的牛津杯中， 于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察酪蛋白培養(yǎng)基上牛津杯周圍是否形成透明圈，脫脂乳培養(yǎng)基上牛津杯周圍是否形成溶蛋白圈，并測量透明圈和溶蛋白圈直徑，通過比較透明圈和溶蛋白圈直徑即可判斷菌株的產(chǎn)酶能力，透明圈和溶蛋白圈直徑越大，產(chǎn)酶能力越強(qiáng)。

1.2.4 產(chǎn)淀粉酶試驗(yàn) 分別取受試菌上清0.1 mL加入到放置在淀粉培養(yǎng)基上的牛津杯中，于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。滴加少量碘液于培養(yǎng)基表面，輕輕旋轉(zhuǎn)，使碘液鋪滿整個平板。觀察并測量牛津杯周圍透明圈直徑。透明的水解圈區(qū)域顯示有酶活，通過比較水解圈直徑的數(shù)值來判斷菌株的產(chǎn)酶能力，透明圈直徑越大，產(chǎn)酶能力越強(qiáng)。

1.2.5 產(chǎn)脂肪酶試驗(yàn) 將分離到不溶血的菌株用劃線法分別接種于油脂培養(yǎng)基上，于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察菌落上是否有紅色斑點(diǎn)，有紅色斑點(diǎn)的是能產(chǎn)脂肪酶的菌株。油脂培養(yǎng)基中的中性紅在中性環(huán)境下呈黃色，在酸性環(huán)境下呈紅色。若菌株分泌脂肪酶，脂肪酶能將培養(yǎng)基中的油脂分解為脂肪酸，使中性紅變?yōu)榧t色。

1.3 候選益生菌的安全性檢驗(yàn)

以體質(zhì)量為（22.3±2.2） g、體長為（11±1） cm、120尾的健康牙鲆苗種為試驗(yàn)動物，檢驗(yàn)篩選出的候選益生菌的安全性，試驗(yàn)在天津市某養(yǎng)殖公司的養(yǎng)殖水箱里開展，養(yǎng)殖水箱與養(yǎng)殖車間封閉循環(huán)水系統(tǒng)相連，水交換量50%·h-1，養(yǎng)殖水溫21～ 22 ℃， 鹽度22～23，溶氧8～10 mg·L-1。試驗(yàn)魚在養(yǎng)殖水箱里適應(yīng)7 d，隨機(jī)分成4組，其中3組分別投喂添加候選益生菌的飼料，添加濃度為1×108 CFU·g-1具體方法是將細(xì)菌培養(yǎng)液按照體積質(zhì)量比1∶40～1∶50（單位mL·g-1）拌到飼料中，另外1組為對照組，投喂牙鲆基礎(chǔ)飼料，連續(xù)投喂7 d，分別統(tǒng)計(jì)各組牙鲆苗種的成活率，并于無菌條件下解剖肝、脾、腎，用1 mL無菌生理鹽水制成組織勻漿，涂布在SNA瓊脂平板上，看是否能分離到細(xì)菌，只有沒有長出細(xì)菌，才能說明益生菌安全。

1.4 候選益生菌的鑒定

采用16S rDNA序列分析方法，對分離篩選到的3株候選益生菌進(jìn)行鑒定。用細(xì)菌16S rDNA通用引物，擴(kuò)增3株菌的16S rDNA片段，委托生工生物工程（上海）股份有限公司測序，序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）。

1.5 應(yīng)用效果評價

1.5.1 應(yīng)用試驗(yàn)設(shè)計(jì) 經(jīng)檢驗(yàn)安全的3株候選益生菌，開展牙鲆應(yīng)用試驗(yàn)。將3株菌分別接種在海水營養(yǎng)肉湯中，25 ℃振蕩培養(yǎng)48 h，將細(xì)菌培養(yǎng)液按照體積質(zhì)量比1∶40～1∶50（單位mL·g-1）拌到牙鲆基礎(chǔ)飼料中，即得濃度為1×108 CFU·g-1的益生菌飼料，基礎(chǔ)飼料為天津某飼料公司生產(chǎn)的牙鲆苗種飼料。

試驗(yàn)魚為體長在9～11 cm的牙鲆健康苗種280尾，試驗(yàn)條件同1.3。試驗(yàn)魚在養(yǎng)殖水箱適應(yīng)7 d，待攝食正常后，隨機(jī)分成4組：3個試驗(yàn)組，1個對照組，每組隨機(jī)取20尾魚稱量體質(zhì)量，計(jì)算初均質(zhì)量。試驗(yàn)組分別投喂添加了不同候選益生菌的飼料，對照組投喂基礎(chǔ)飼料，日投喂量為魚體總重量的1.5%～2%。應(yīng)用試驗(yàn)為期4周。

于投喂相應(yīng)飼料前及投喂飼料4周后，每組隨機(jī)取20尾魚稱量體質(zhì)量，計(jì)算末均質(zhì)量，用于生長指標(biāo)的分析。于投喂飼料后1、2、3、4周，試驗(yàn)組和對照組每組隨機(jī)取5尾魚，尾靜脈采血，采用兩種方式采血：一種直接采集，用于收集血清，檢測血液酶活；另一種采集抗凝血，用≥6 μL的肝素（30 U可抗凝1 mL血）溶液潤濕的1 mL一次性注射器尾部取血200 μL，放到提前加了200 μL無菌生理鹽水和200 μL M199培養(yǎng)基的1.5 mL離心管中，輕輕混勻，用于檢測外周血細(xì)胞吞噬活性。

1.5.2 生長指標(biāo)分析 根據(jù)試驗(yàn)前、投喂飼料4周的魚體質(zhì)量數(shù)據(jù)，分別計(jì)算每組初均質(zhì)量、末均質(zhì)量、平均增質(zhì)量、增質(zhì)量率、特定生長率，計(jì)算公式如下：

平均體質(zhì)量=每組總質(zhì)量/每組總尾數(shù)（1）

平均增質(zhì)量=（末均質(zhì)量－初均質(zhì)量）/尾數(shù)（2）

增質(zhì)量率=（末均質(zhì)量－初均質(zhì)量）/初均質(zhì)量×100%（3）

特定生長率（%·t-1）=（ln w2－ln w1） ·t-1×100%（4）

式中，w1為初均質(zhì)量，w2為末均質(zhì)量，t為飼養(yǎng)時間。

1.5.3 細(xì)胞吞噬活性測定 取用于檢測外周血細(xì)胞吞噬活性的血—生理鹽水—培養(yǎng)基混合液100 μL，加入70 μL無菌生理鹽水和30 μL滅活的金黃色葡萄球菌懸液，混勻，25 ℃，200 r·min孵育30 min。取孵育好的血-菌混合液涂片，每個樣品涂片3張。用劉氏A液染色30 s，再加劉氏B液染色90～120 s，水洗，干燥，鏡檢。分別記錄100個細(xì)胞中參與吞噬的細(xì)胞個數(shù)（吞噬百分率PP）和每個細(xì)胞吞噬細(xì)菌的個數(shù)（吞噬指數(shù)PI）。

吞噬百分率（PP）＝（100個細(xì)胞中參與吞噬的細(xì)胞數(shù)/100）×100%（5）

吞噬指數(shù)（PI）=被吞噬的細(xì)菌數(shù)/吞噬細(xì)菌的細(xì)胞數(shù)（6）

1.5.4 血液酶活的測定 抽取的血液樣品4 ℃過夜，3 000 r·min-1離心10 min，取血清。用南京建成試劑盒檢測堿性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）、超氧化物歧化酶（SOD）和溶菌酶（LYZ）活性，24 h內(nèi)測定完畢，依據(jù)試劑盒說明進(jìn)行酶活力計(jì)算。

1.6 攻毒試驗(yàn)

投喂相應(yīng)飼料4周后，3個試驗(yàn)組和1個對照組各取20尾魚，每組設(shè)2個平行組，用本實(shí)驗(yàn)室保存的牙鲆致病菌——溶藻弧菌（3×107 CFU·mL-1）攻毒，腹腔注射50 μL·尾-1，每天記錄各組的死亡數(shù)，統(tǒng)計(jì)2周時間，計(jì)算累計(jì)死亡率。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)分析采用單因素方差分析（One—Way ANOVA），并進(jìn)行t檢驗(yàn)，與對照組比較，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選到3株候選益生菌

從健康牙鲆腸道分離到94株菌，其中不完全溶血（α溶血）43株，完全溶血（β溶血）25株，不溶血（γ溶血）26株。將26株不溶血菌株進(jìn)行酪蛋白酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活性檢測，其中8株具有酪蛋白酶活性，8株具有蛋白酶活性，12株具有淀粉酶活性，6株具有脂肪酶活性，兼具3種酶活性的菌株有3株：Y1、Y5和I66。牛津杯直徑為8 mm，3株菌的酪蛋白圈直徑、溶蛋白圈直徑、淀粉酶直徑、脂肪酶活性詳見表1。這3株菌不溶血，即沒有潛在致病性，具有多種消化酶活性，傳代穩(wěn)定性好，被確定為益生菌候選菌株。

2.2 候選益生菌的安全性

投喂添加3株候選益生菌飼料1周，牙鲆苗種進(jìn)食與活力正常，成活率均為100%。這說明3株菌以高劑量添加到飼料中投喂牙鲆，對魚體也是安全無危害的。用SNA瓊脂均未從各組魚的肝、脾、腎分離到細(xì)菌，說明試驗(yàn)過程中未發(fā)生細(xì)菌位移。細(xì)菌位移是益生菌是否具有毒性的潛在標(biāo)志，益生菌應(yīng)用于養(yǎng)殖生產(chǎn)前評價其是否有細(xì)菌位移的風(fēng)險十分必要[17]。試驗(yàn)中菌株未遷移到肝、脾或腎，是牙鲆安全的候選益生菌，可以開展養(yǎng)殖試驗(yàn)。

2.3 候選益生菌的分子生物學(xué)鑒定

綜合溶血性、消化酶活性和安全性試驗(yàn)結(jié)果，對篩選出的3株候選益生菌進(jìn)行16S rDNA測序，將測得菌株的16S rDNA 序列在GenBank中進(jìn)行blast序列比對，比對結(jié)果顯示，3株菌均為芽孢桿菌屬，Y1與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、Y5與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloidophilus）、I66與蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）的同源性均達(dá)99%以上。

2.4 生長性能

分析了3株候選益生菌添加到飼料中投喂牙鲆4周對生長性能的影響（表2）。投喂添加候選益生菌組和投喂基礎(chǔ)飼料組牙鲆的末均質(zhì)量、平均增質(zhì)量、增質(zhì)量率，以及特定生長率均未見顯著差異，說明添加的候選益生菌未能顯著促進(jìn)魚體的生長，但也不會延緩魚體生長；添加候選益生菌組的增質(zhì)量率和特定生長率高于對照組，雖然統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有呈現(xiàn)顯著性差異，但有增高的趨勢。

2.5 細(xì)胞吞噬活性

試驗(yàn)組和對照組分別于投喂相應(yīng)飼料后1、2、3、4周，尾靜脈采血，統(tǒng)計(jì)分析外周血細(xì)胞PP和PI，對照組4個時間點(diǎn)PI在（17.8±1.3）%～（21.1±1.9）%之間，P2在（1.8±0.8）～（2.0±1.2）之間。3個試驗(yàn)組4個時間點(diǎn)血細(xì)胞PP顯著高于對照組，在（25.3±2.2）%～（28.8±2.8）%之間；投喂添加I66飼料3周時，血細(xì)胞PI顯著高于對照組，為3.8±0.8；其他試驗(yàn)組血細(xì)胞PI與對照組不存在顯著性差異（表3）。

2.6 血液酶活指標(biāo)

3個試驗(yàn)組和1個對照組分別在投喂相應(yīng)飼料1、2、3、4周時檢測血液酶活。血液AKP活性隨著魚體生長呈上升趨勢，于投喂4周時，3個試驗(yàn)組AKP活性顯著高于對照組；血液ACP活性水平不隨魚體生長而發(fā)生變化，3個試驗(yàn)組與對照組的ACP活力水平均一致，不存在顯著性差異；3個試驗(yàn)組血液SOD活性隨著魚體生長而升高，于3周時達(dá)到最高水平，與對照組形成極顯著差異，4周時有所下降，但仍然顯著高于對照組；3個試驗(yàn)組血液LYZ活性于投喂1周時即顯著升高，且與對照組一直存在顯著性差異（表4）。

2.7 攻毒試驗(yàn)

為評價飼料中添加候選益生菌對牙鲆抗病力的影響，開展攻毒試驗(yàn)，記錄攻毒后試驗(yàn)組和對照組的死亡數(shù)，計(jì)算累計(jì)死亡率（圖1）。攻毒后2 d，對照組即開始死亡，而試驗(yàn)組在攻毒10 d才開始出現(xiàn)死亡現(xiàn)象；隨著時間的推移，到攻毒14 d時，對照組累計(jì)死亡率達(dá)到50%，而各試驗(yàn)組的累計(jì)死亡率在17.5%～30%范圍內(nèi)，顯著低于對照組（P<0.05）。由此可見，飼料中添加Y1、Y5和I66菌均能提高牙鲆對溶藻弧菌的抵抗力，延緩發(fā)病，降低死亡率。

3 討論與結(jié)論

隨著健康養(yǎng)殖理念的不斷深入和對食品安全性要求的不斷提高，由抗生素導(dǎo)致的食品安全、生物和生態(tài)問題，特別是抗生素耐藥性菌株的出現(xiàn)[18-19]，使抗生素的使用受到嚴(yán)格管控，亟待尋找抗生素的替代品。益生菌是一類在微生態(tài)學(xué)理論指導(dǎo)下，經(jīng)特殊工藝制成的含活菌或者包含細(xì)菌菌體及其代謝產(chǎn)物的活菌制劑，對宿主具有益生作用[20]。研究表明，益生菌的益生作用主要表現(xiàn)在促進(jìn)機(jī)體生長、提高機(jī)體免疫力、改善腸道菌群平衡等[21-22]，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中還能改善養(yǎng)殖水體水質(zhì)，具有綠色、無污染的特點(diǎn)，符合水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略，可以替代化學(xué)藥品和抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用，保護(hù)養(yǎng)殖對象免受疾病危害[23]；但益生菌的來源、使用量和投喂期等因素會影響益生菌的免疫調(diào)節(jié)活性[24-25]，導(dǎo)致益生菌開發(fā)的復(fù)雜性和使用效果的不穩(wěn)定性等；目前水產(chǎn)上使用的益生菌主要來自陸生動物[4]，而對人類和陸生動物安全的益生菌可能對水生動物并不安全[26-27]。研究表明，益生菌在發(fā)揮作用時存在種屬差異性和菌株特異性，宿主來源的益生菌在諸如溫度、鹽度、對生存環(huán)境的熟悉程度、對宿主的免疫條件等方面具有優(yōu)勢，具有巨大的開發(fā)潛力[5，18]；Carnevali等[28]發(fā)現(xiàn)，從魚類腸道中選擇的益生菌可能具有更強(qiáng)的與本地有害微生物競爭、在腸道環(huán)境中占據(jù)主導(dǎo)地位的能力；而不合適的益生菌會對宿主的營養(yǎng)物質(zhì)代謝、免疫調(diào)節(jié)等產(chǎn)生負(fù)面影響[5，29]。由此可見，應(yīng)用于水生動物的益生菌必須考慮菌種來源問題，胃腸道（GIT）和黏液是水產(chǎn)養(yǎng)殖益生菌最常見的分離來源[5，25，30-32]。因此，本研究從健康養(yǎng)殖牙鲆苗種腸道進(jìn)行細(xì)菌分離，通過產(chǎn)酶試驗(yàn)和安全性試驗(yàn)篩選出3株牙鲆腸道固有候選益生菌，并應(yīng)用于牙鲆苗種養(yǎng)殖試驗(yàn)，避免益生菌應(yīng)用時出現(xiàn)種屬特異性，利于候選益生菌更好的在腸道黏附或定殖，發(fā)揮促進(jìn)生長或提高免疫力等益生作用。

水產(chǎn)養(yǎng)殖中，益生菌主要通過酶促消化、促進(jìn)生長、增強(qiáng)宿主免疫力等方面發(fā)揮益生作用[33]。本研究將篩選出的兼具3種消化酶活性的候選益生菌（Y1、Y5和I66）分別添加到基礎(chǔ)飼料中投喂牙鲆，以期促進(jìn)牙鲆對飼料營養(yǎng)成分的消化吸收，提高牙鲆生長速率。經(jīng)過4周的養(yǎng)殖試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)添加益生菌組牙鲆未在生長性能方面顯現(xiàn)優(yōu)勢，但益生菌組的增質(zhì)量率和特定生長率高于對照組，即使統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有顯現(xiàn)顯著性差異，但均有增高的趨勢。類似的結(jié)果也有報道，Sun等[34]研究了快速生長的石斑魚腸道優(yōu)勢菌——短小芽孢桿菌和克勞氏芽孢桿菌分別以1.0×108 cells·g-1的濃度添加到飼料中投喂石斑魚60 d，益生菌飼養(yǎng)組的體質(zhì)量增加和特定生長速度沒有明顯的改善，推測可能與投喂時間或投喂劑量有一定關(guān)系。

益生菌應(yīng)用最大的益處之一就是調(diào)節(jié)宿主免疫[35]。本研究通過定期檢測外周血細(xì)胞吞噬活性、血液酶活（AKP、ACP、SOD、LYZ）等非特性免疫指標(biāo)來評價益生菌在增強(qiáng)魚體免疫力方面的作用。吞噬活性出現(xiàn)在魚類先天免疫應(yīng)答的早期，對機(jī)體抵抗細(xì)菌入侵起著重要作用；AKP和ACP是動物體內(nèi)參與免疫防御的重要水解酶；SOD是機(jī)體內(nèi)一種重要的抗氧化酶，主要是清除動物體液或組織中的超氧基，在防御細(xì)胞組織超氧陰離子毒性、生物分子損傷方面具有重要的作用[36]；LYZ是存在于溶酶體內(nèi)的水解酶，是魚類先天免疫系統(tǒng)重要的防御分子，是抵御病原微生物入侵的屏障[37]。目前也有不少關(guān)于益生菌調(diào)節(jié)水產(chǎn)動物先天免疫方面的報道，Newaj-Fyzul等[38]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）能提高虹鱒魚的免疫反應(yīng)包括白細(xì)胞數(shù)量顯著增加、呼吸爆發(fā)和吞噬活性增強(qiáng)等，亦能提高虹鱒對致病性嗜水氣單胞（Aeromonas hydrophila）的抵抗力；高肖微等[39]研究發(fā)現(xiàn)，將地衣芽孢桿菌（Bacillus licheni-formis）以不同劑量添加到飼料中投喂鯉魚，投喂20、40、60 d，均能顯著提高鯉魚SOD活性（P<0.05），投喂40、60 d，能顯著提高溶菌酶（LYZ）活性，且隨著地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）添加量的增加，鯉魚免疫機(jī)能不同程度顯著提高（P<0.05）；Amoah等[40]在飼料中添加凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）投喂凡納濱對蝦，發(fā)現(xiàn)血清溶菌酶（LYZ）、酸性磷酸酶（ACP）、超氧化物歧化酶（SOD）活力等先天免疫指標(biāo)顯著提高，且對副溶血弧菌（Vibrio Parahaemolyticus）的抗感染力增強(qiáng)；Taoka等[41]用含有枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus? acidophilus）、丁酸梭菌（Clostridium butyricum）和釀酒酵母（Saccharomyces? cerevisiae）益生菌產(chǎn)品添加到飼料中投喂牙鲆，牙鲆體表黏液和血漿中的溶菌酶活性均高于對照組[41]。本研究也取得類似結(jié)果，3個試驗(yàn)組4個時間點(diǎn)血淋巴細(xì)胞PP顯著高于對照組；3個試驗(yàn)組AKP、SOD和LYZ的活力顯著或極顯著的高于對照組；投喂30 d后用牙鲆致病菌進(jìn)行攻毒，3個試驗(yàn)組魚發(fā)病延遲，累計(jì)死亡率顯著低于對照組。以上均說明，益生菌候選菌株Y1、Y5、I66的添加，促進(jìn)了牙鲆血液外周血細(xì)胞的吞噬活性，提高了牙鲆的先天免疫水平，增強(qiáng)了魚體的抗病力。

這3株菌經(jīng)鑒定分別為：枯草芽孢桿菌（Y1）、解淀粉芽孢桿菌（Y5）和蠟樣芽孢桿菌（I66）。芽孢桿菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)應(yīng)用廣泛的一類益生菌，因其具有易保存、抗逆行能力強(qiáng)等特點(diǎn)，在水產(chǎn)養(yǎng)殖上有許多應(yīng)用的實(shí)例[14，40，42-43]。本研究篩選出的3株菌，均有分泌消化酶的活力，以往的研究結(jié)表明，飼料中添加具有分泌消化酶活性的益生菌能補(bǔ)充魚體腸道消化酶不足的缺陷，促進(jìn)飼料的消化吸收，提高餌料利用率，促進(jìn)魚體生長，但本研究未獲得同樣的結(jié)果，僅增質(zhì)量率和特定生長率有增高的趨勢，原因可能是投喂時間較短，不足以顯現(xiàn)顯著性差異。本試驗(yàn)條件下，Y1、Y5、I66這3株菌添加到飼料中投喂牙鲆，能顯著增強(qiáng)牙鲆外周血細(xì)胞吞噬活性、血液堿性磷酸酶、超氧化物歧化酶和溶菌酶活性；提高牙鲆對溶藻弧菌的抵抗力，是牙鲆有效益生菌，可以在牙鲆苗種生產(chǎn)中應(yīng)用。為了達(dá)到更好的效果，后期可以開展最佳添加劑量、最佳投喂期的優(yōu)化試驗(yàn)，從而確定這3株益生菌的最佳應(yīng)用方案。

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收稿日期：2023-04-12

基金項(xiàng)目：天津科技大學(xué)省部共建食品營養(yǎng)與安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題資助項(xiàng)目（SKLFNS-KF-202106）；國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃資助（2020YFD0900400）

作者簡介：王雪惠（1979—），女，山東煙臺人，高級工程師，碩士，主要從事魚類病害及免疫防治技術(shù)研究。

通訊作者簡介：孫金生（1965—），男，天津人，研究員，博士，主要從事水產(chǎn)動物疾病控制等方面研究。