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      駝乳對小鼠急性酒精性肝損傷的干預(yù)作用

      2023-08-17 14:20:06其布勒吉日木圖
      中國食品學(xué)報(bào) 2023年6期
      關(guān)鍵詞:差異基因酒精性測序

      其布勒,吉日木圖,2,明 亮,2*

      (1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 呼和浩特 010018 2 內(nèi)蒙古駱駝研究院 內(nèi)蒙古阿拉善 750306)

      肝臟是人體最重要的代謝器官,也是酒精代謝的中心,超過80%的攝入酒精在肝臟代謝[1]。隨著酒精消費(fèi)的增加,酒精性肝?。ˋLD)的發(fā)病率越來越高,已成為一個(gè)嚴(yán)重的健康問題,引起了全世界的關(guān)注[2]。根據(jù)肝損傷的嚴(yán)重程度,酒精性肝病包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纖維化、酒精性肝硬化和酒精性肝癌[3]。研究ALD 的發(fā)病機(jī)制對治療及干預(yù)病情的發(fā)展具有重大意義[4]。

      駱駝是荒漠地帶的一種特有畜種,對荒涼、貧瘠、嚴(yán)酷的荒漠環(huán)境具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力,也造就了駝乳“沙漠白金”的美稱;其營養(yǎng)成分獨(dú)特,含有豐富的蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸以及磷、鈣、鉀等礦物質(zhì)元素和維生素B、C、E 等營養(yǎng)成分,易于消化吸收,是有較高的營養(yǎng)價(jià)值和食療保健作用的飲品[5-8]。此外,駝乳還含有高水平的生物活性物質(zhì),如乳過氧化物酶、免疫球蛋白G(IgG)、分泌性免疫球蛋白A(SIgA)、乳鐵蛋白、溶菌酶、胰島素、類胰島素生長因子等,使其具有優(yōu)異的抗氧化和抗菌活性[9-10]。有研究表明,駝乳及其成分還具有其它潛在的功能特性,如抗致癌[11-12]、抗糖尿病[13]、抗高血壓[14]和腎保護(hù)潛力[15-16]。

      目前,駝乳的功用價(jià)值已引起世界各地研究人員的極大關(guān)注。為進(jìn)一步探索駝乳對酒精所致肝損傷的改善作用,本研究以ICR 小鼠建立急性酒精肝損傷的動物模型,通過給酒精性肝損傷小鼠灌胃駝乳,研究其對肝損傷的預(yù)防作用。采用比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)探究駝乳對急性酒精性肝損傷的分子調(diào)控機(jī)制,旨在為利用駝乳開發(fā)保肝功能食品或膳食補(bǔ)充劑提供參考。

      1 材料與方法

      1.1 材料與試劑

      清潔級(SPF)雄性ICR 小鼠,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

      谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)試劑盒,南京建成生物有限公司;總RNA 提取試劑盒,Life Technologies 公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒,Thermo Fisher Scientific 公司;擴(kuò)增試劑盒,Luna公司;腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)、白介素-1β(IL-1β)試劑盒,上海酶聯(lián)生物有限公司。

      1.2 儀器與設(shè)備

      酶標(biāo)儀、熒光定量PCR 儀,美國Thermo 公司。

      1.3 方法

      1.3.1 實(shí)驗(yàn)動物分組及處理 實(shí)驗(yàn)小鼠經(jīng)過1 周適應(yīng)性喂養(yǎng)后,將其隨機(jī)分為4 組,正常組(NC)、模型組(ET)、駝乳組(CM)、駝乳干預(yù)組(ET+CM),每組10 只。CM 和ET+CM 組均按6 g/kg 的劑量灌胃駝乳,NC 組和ET 組給予同體積蒸餾水灌胃,連續(xù)14 d。于末次灌胃后禁食不禁水6 h,除NC 組和CM 組灌胃蒸餾水外,其它2 組均給予50%酒精(7.3 g/kg bw)。6 h 后,眼眶取血,3 000 r/min、4℃離心20 min 取上清液,分裝貯于-80 ℃保存?zhèn)溆?。然后,頸椎脫臼處死小鼠,迅速摘取肝臟組織,置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

      1.3.2 凍干駝乳粉的制備 新鮮駝乳經(jīng)3 500 r/min 離心40 min 脫脂,然后進(jìn)行真空冷凍干燥,密封保存,備用。試驗(yàn)開始后,按6 g/kg 灌胃計(jì)量,以CM 組和ET+CM 組小鼠平均體重按照m0計(jì),每次灌胃量0.3 mL,需要配制質(zhì)量濃度為2m0×10-2g/mL 脫脂駝乳粉溶液,組內(nèi)個(gè)體體質(zhì)量為m(g)小鼠灌胃駝乳粉體積按照下列公式進(jìn)行計(jì)算:

      1.3.3 肝組織中ALT 和AST 指標(biāo)的測定 將9倍體積的生理鹽水加入肝組織中,并將肝組織在冰水浴中勻漿。將制備的勻漿在4 ℃下以3 000×g離心20 min,取上清液進(jìn)行測定。根據(jù)試劑盒方法測定肝組織中ALT 和AST 水平。

      1.3.4 血清中TNF-α、IL-10、1L-6 和IL-1β 含量的測定 用離心管收集小鼠血清,靜置2 h 后3 000×g 離心20 min,取上清按照試劑盒方法測定TNF-α、IL-10、1L-6 和IL-1β 含量。

      1.4 肝臟組織RNA 提取及cDNA 文庫構(gòu)建

      根據(jù)試劑盒(RNAiso Plus 試劑盒和RNeasy Mini 試劑盒)的操作流程提取小鼠肝組織總RNA,所得總RNA 經(jīng)Agilent Bioanalyzer 2100 電泳質(zhì)檢合格后,連接有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA。然后將mRNA 隨機(jī)大段成短片段為模板進(jìn)行第一鏈和第二鏈cDNA 的合成并使用RNAClean XP Kit 和RNase-Free DNase Set 純化;修復(fù)黏性末端為平末端并在3 末端加堿基A并加接頭,最后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增獲得最終測序文庫。由Agilent 2100 確定文庫大小后,使用Illumina HiSeq平臺對cDNA 文庫進(jìn)行測序。測序部分由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

      1.5 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)處理及分析

      為了得到高質(zhì)量數(shù)據(jù),首先采用fastx_toolkit_0.0.14 軟件對原始數(shù)據(jù)(Raw Reads)進(jìn)行質(zhì)控。將質(zhì)控后的原始數(shù)據(jù)(clean data 或Clean reads),與參考基因組(Mus musculus.GRCm38.p,http://www.ensembl.org/Mus_musculus/Info/ Index)比對,然后用FPKM 法將影響計(jì)算基因表達(dá)的基因長度和測序量差異進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理,使用RSEM 計(jì)算各個(gè)樣品的基因表達(dá)水平,并用edgeR 方法進(jìn)行組間差異表達(dá)分析。根據(jù)差異基因檢測結(jié)果,對候選基因進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析。

      1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 驗(yàn)證相關(guān)差異基因

      采用TRIzol 法提取小鼠肝組織當(dāng)中總RNA,RNA 樣品符合要求(OD260nm/OD280nm=1.8~2.2)。使用Nanodrop 檢測RNA 純度和濃度。采用UEIris ⅡRT-PCR System for Fist-Strand cDNA Synthesis試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,產(chǎn)物cDNA 稀釋10 倍用于qPCR 模板。根據(jù)SYBRPremix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)說明書進(jìn)行定量檢測,反應(yīng)體系20 μL:cDNA 2 μL,TB 溶液10 μL,正/反向引物各0.8 μL,無菌水6.4 μL,將樣品混合均勻于96孔板,上機(jī)運(yùn)行。其運(yùn)行條件為:95 ℃30 s,95 ℃5 s,57 ℃30 s,72 ℃30 s,40 個(gè)循環(huán)。本研究所用引物基因序列由上海生工生物工程有限公司合成,引物序列如表1 所示。通過2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA 的表達(dá),以β-actin 為內(nèi)參,與正常組做比值,根據(jù)樣本CT 值計(jì)算各基因相對表達(dá)量,以溶解曲線判斷PCR 產(chǎn)物是否具有特異性。

      表1 引物序列Table 1 Primer sequence

      1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

      本研究所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,并由GraphPad prism 5.03 進(jìn)行分析并繪圖。所有組之間的比較采用單向方差分析(ANOVA)檢驗(yàn)。根據(jù)Bonferroni 事后檢驗(yàn)計(jì)算出顯著差異。P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 駝乳對肝損傷小鼠肝組織AST 和ALT 的影響

      ALT 和AST 是臨床上常用的肝功能評價(jià)指標(biāo),其水平反映了肝細(xì)胞損傷程度。如圖1a、1b 所示,與NC 組相比,ET 組小鼠肝組織中的AST 和ALT 酶活力顯著升高(P<0.05),說明ALD 小鼠建模成功。與ET 組相比,ET+CM 組的AST 和ALT酶活力顯著降低(P<0.05),表明駝乳不同程度的抑制了肝組織中該兩種酶的活性,從而有效緩解酒精引起的肝損傷。此外,NC 與CM 組之間沒有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

      圖1 駝乳對肝損傷小鼠肝組織AST 和ALT 的影響Fig.1 Effect of camel milk on AST and ALT of liver tissue in mice with liver injury

      2.2 駝乳對急性酒精性肝損傷小鼠炎癥反應(yīng)的影響

      酒精進(jìn)入機(jī)體后,激活kuffer 細(xì)胞釋放IL-10、IL-6、IL-1β 和TNF-α 等炎癥因子,導(dǎo)致炎癥反應(yīng),從而加重酒精性肝損傷。為了評估駝乳的抗炎作用,測定了血清中IL-10、IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平。結(jié)果如圖2 所示,與NC 組相比,ET組的TNF-α、1L-6 和IL-1β 水平顯著升高(P<0.05),IL-10 含量顯著降低(P<0.05),表明酒精暴露可誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞發(fā)生炎性損傷。與ET 組相比,ET+CM 組小鼠血清中TNF-α、1L-6 和IL-1β水平顯著降低(P<0.05),IL-10 含量顯著升高(P<0.05),表明駝乳會產(chǎn)生大量抗炎因子來抑制酒精誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng),從而改善急性酒精性肝損傷。

      圖2 駝乳對急性酒精性肝損傷小鼠炎癥反應(yīng)的影響Fig.2 Effect of camel milk on inflammatory response in mice with acute alcoholic liver injury

      2.3 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)及比對分析

      本測序的12 個(gè)樣本的質(zhì)量和比對統(tǒng)計(jì)表如表2 所示,各樣本測序共得到5 160 萬條raw reads,然后進(jìn)行過濾后共得到5 124 萬clean reads。在獲得的clean reads 中,所有樣本能定位到基因組上的比率高于93%,然后在參考序列上有唯一比對率達(dá)到84%以上。測序結(jié)果表明,RNA測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制良好,可進(jìn)行后續(xù)生物信息學(xué)分析。

      表2 樣本質(zhì)量和比對結(jié)果Table 2 Sample quality and comparison results

      2.4 駝乳干預(yù)下小鼠轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)的差異性分析

      如圖3 所示,NC 組共檢測出10 929 個(gè)基因,ET 組測出11 170 個(gè)基因,CM 組11 026 個(gè)基因,ET+CM 組10 750 個(gè)基因。

      圖3 基因量化維恩圖Fig.3 Gene quantification Venn diagram

      采用edgeR 對差異基因進(jìn)行篩選,篩選條件為差異倍數(shù)(log2 fold change)>1,P<0.05。結(jié)果如圖4 所示,NC 組與ET 組相比,共檢測出4 105 個(gè)差異基因,其中2 250 個(gè)基因上調(diào),1 855 個(gè)基因下調(diào)。ET 組與ET+CM 組相比,篩選到1 426 個(gè)基因,其中673 個(gè)基因上調(diào),753 個(gè)基因下調(diào)。NC 組與ET+CM 組相比,共檢測出3 958 個(gè)差異基因,其中1 748 個(gè)基因上調(diào),2 210 個(gè)基因下調(diào)。NC 組與CM 組相比較,共檢測出2 368 個(gè)差異基因,其中891 個(gè)基因上調(diào),1 477 個(gè)基因下調(diào)。

      圖4 兩組間差異基因表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖Fig.4 Statistical graph of differential gene expression between the two groups

      2.5 駝乳干預(yù)下小鼠轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因的功能分析

      為了進(jìn)一步了解差異表達(dá)基因的功能,確定其在分子水平上的作用,針對差異表達(dá)基因進(jìn)行功能分析,發(fā)現(xiàn)各功能的基因注釋數(shù)目有明顯差異。結(jié)果如圖5 所示,在生物過程中,NC 與ET 組和ET+CM 與ET 組差異基因注釋到細(xì)胞過程的最多,分別為2 986、973 條。在細(xì)胞組分中,注釋到細(xì)胞部分的最多,分別為3 435、1 148 條。在分子功能中,注釋到結(jié)合的基因最多,分別為3 049、1 053 條。進(jìn)一步進(jìn)行GO 富集分析,發(fā)現(xiàn)NC 組與ET 組的差異基因主要參與炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)代謝、氧化應(yīng)激、脂多糖反應(yīng)等生物學(xué)過程。ET組和ET+CM 組的差異表達(dá)基因主要參與炎癥反應(yīng)、脂多糖反應(yīng)、含氧化合物的反應(yīng)、細(xì)胞因子的反應(yīng)、脂質(zhì)代謝過程、白細(xì)胞遷移等生物學(xué)過程,結(jié)果如表3 所示。

      圖5 組間GO 注釋圖Fig.5 GO annotation diagram between groups

      表3 ET 組與ET+CM 組差異基因GO 富集分析Tabel 3 Significant terms of GO analysis for ET vs ET+CM differential gene

      進(jìn)一步,將差異表達(dá)基因進(jìn)行了KEGG 功能富集分析。NC 與ET 組的差異基因顯著富集在MAPK 信號通路(92 個(gè)差異基因)、Insulin resistance(44 個(gè)差異基因)、AMPK 信號通路(44 個(gè)差異基因)、Pathways in cancer(146 個(gè)差異基因)等。ET 與ET+CM 組差異基因顯著富集在MAPK信號通路(24 個(gè)差異基因)、Oxidative phosphorylation(22 個(gè)差異基因)、NF-κB 信號通路(14 個(gè)差異基因)、Toll-like(11 個(gè)差異基因)等。下面主要對ET 與ET+CM 組富集在MAPK、Toll-like 和NF-κB 通路上的差異基因進(jìn)行分析,找出駝乳干預(yù)急性酒精性肝損傷的關(guān)鍵基因。

      在MAPK 信號通路中,低表達(dá)的白細(xì)胞分化抗原14(CD14)基因表明了駝乳參與了ALD 小鼠的免疫應(yīng)答,低表達(dá)的IL-1R1、TNFR1 基因表明了駝乳調(diào)節(jié)ALD 小鼠的炎癥因子,低表達(dá)的ERK1/2、JIP3、TGFβ、TGFβR、ATF-2、PIK3R1 基因表明了駝乳通過抑制細(xì)胞分化或凋亡從而調(diào)控ALD 小鼠的免疫應(yīng)答。

      在Toll-like 信號通路中,低表達(dá)的IL-1R1、IL-6、TNFR1、TLR5 和TLR9 基因表明了駝乳產(chǎn)生大量抗炎因子從而抑制ALD 小鼠的炎癥反應(yīng),低表達(dá)的CD14 基因表明了駝乳參與了ALD 小鼠的免疫調(diào)節(jié),ERK1/2 和PIK3R1 基因表明了駝乳通過抑制細(xì)胞分化或凋亡從而調(diào)控ALD 小鼠的免疫應(yīng)答。

      在NF-κB 信號通路中,低表達(dá)的CXCL1、IL-1R1、TNFR1 表明了駝乳調(diào)節(jié)ALD 小鼠的炎癥因子,Bcl2a1d 基因表明了駝乳通過抑制細(xì)胞分化或凋亡從而調(diào)控ALD 小鼠的免疫應(yīng)答。

      2.6 轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因的驗(yàn)證

      為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測序的準(zhǔn)確性以及確定駝乳對酒精性肝損傷的保護(hù)作用是否與MAPK、Tolllike 和NF-κB 炎癥通路相關(guān),選取CD14、TLR5、TLR9 等6 個(gè)代表性差異基因進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光定量PCR 測定。結(jié)果如圖7 所示,與NC 組相比,ET組的CD14、IL-1β、IL-6、TLR5 和TLR9 表達(dá)量顯著上升(P<0.05),IL-10 表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。與ET 組相比,ET+CM 組的CD14、IL-1β、IL-6、TLR5 和TLR9 表達(dá)量顯著降低(P<0.05),IL-10 表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。說明駝乳通過調(diào)控MAPK、Toll-like 和NF-κB 通路上的基因,緩解急性酒精性肝損傷。

      圖7 差異基因表達(dá)量Fig.7 Differential gene expression

      3 討論

      肝臟是人體最重要的代謝器官,通過吞噬和解毒功能對機(jī)體起保護(hù)作用。攝入大量酒精會導(dǎo)致肝臟出現(xiàn)一系列損害性病變。如何安全有效的預(yù)防和治療酒精性肝病已成為各國科研人員的研究熱點(diǎn)。大量研究表明,ALD 的發(fā)病機(jī)制與乙醇及其代謝物對肝臟的毒性、脂質(zhì)代謝紊亂、氧化應(yīng)激、炎癥介質(zhì)、免疫反應(yīng)等多種因素有關(guān)[17-18]。此外,酒精誘導(dǎo)的肝損傷發(fā)生在多個(gè)層面,從先天免疫細(xì)胞到肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞、肝細(xì)胞,該過程需要多條肝細(xì)胞信號通路的相互作用[19]。ALT 和AST 是評估肝細(xì)胞損傷的重要指標(biāo)之一,通過測定肝組織中ALT 和AST 活性可以判斷肝損傷程度。炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致酒精性肝損傷的典型病理機(jī)制。IL-10 是一種抗炎和免疫抑制細(xì)胞因子,TNF-α 是一種促炎細(xì)胞因子,主要由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生,參與炎癥和免疫反應(yīng)過程。IL-6 是一種同時(shí)促進(jìn)炎癥和肝再生的多效性細(xì)胞因子,主要調(diào)節(jié)抗凋亡基因轉(zhuǎn)錄和肝再生。IL-1β 通過誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞趨化因子,加重炎癥反應(yīng)。因此,通過測定血清IL-10、TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平綜合分析肝臟因炎癥反應(yīng)發(fā)生的損傷程度。結(jié)果表明,駝乳不僅可以顯著降低肝組織中AST 和ALT 水平、還可以顯著降低血清中TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平,提高IL-10水平。表明駝乳能夠抑制酒精引發(fā)的炎癥反應(yīng),發(fā)揮對肝臟的保護(hù)作用。

      基于生化指標(biāo)測定結(jié)果,進(jìn)一步研究駝乳改善酒精性肝損傷的作用機(jī)制,對各組小鼠肝組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,NC 與ET 組共獲得4 105 個(gè)差異基因,ET 與ET+CM 組共獲得1 426 個(gè)差異基因,挑選6 個(gè)差異基因經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 驗(yàn)證,結(jié)果與測序結(jié)果表達(dá)一致,說明了本次測序結(jié)果準(zhǔn)確可靠。在差異表達(dá)基因的GO 富集分析中發(fā)現(xiàn),ET 與ET+CM 組大多數(shù)差異基因顯著富集到免疫炎癥相關(guān)的功能上,如基因CXCL1 和CD14 分別富集到GO term 的免疫應(yīng)答和細(xì)胞對脂多糖的反應(yīng),且共同富集到炎癥反應(yīng)。

      在KEGG 富集分析中,ET 與ET+CM 組差異基因顯著富集到MAPK、Toll-like、NF-κB 信號等免疫炎癥相關(guān)的信號通路。已有的研究表明,Tolllike 信號通路與MAPK 信號通路和NF-κB 信號通路密切相關(guān),通過抑制Toll-like 信號通路,可以進(jìn)一步抑制MAPK 信號通路和NF-κB 信號通路,從而緩解酒精引發(fā)的一系列病理反應(yīng),發(fā)揮對肝臟的保護(hù)作用[20]。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)在細(xì)胞凋亡和炎癥因子信號傳遞過程中起著重要的作用。主要包含細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)、c-Jun 氨基末端激酶(JNK)和p38 MAPK 這3 條途徑[22]。本研究結(jié)果顯示,在ET 組中起到信號傳導(dǎo)作用的基因ERK 表達(dá)顯著上調(diào),效應(yīng)因子TNFR1、JIP3、ATF-2 和TGF-β 基因表達(dá)上調(diào),而經(jīng)駝乳預(yù)處理后均顯著下調(diào)。MAPK1(ERK2)和MAPK3(ERK1)是與細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化、分化相關(guān)的MAPK[22]。MAPK 被酒精刺激后可釋放炎性因子TNF-α,進(jìn)而加劇炎癥反應(yīng)[23]。TNF-R1 作為TNFα 受體,與TNF-α 結(jié)合經(jīng)一系列反應(yīng)形成多種復(fù)合物激活JNK[24-25],被激活的JNK 靶向JIP3(JNK信號通路上的支架蛋白)、ATF-2 參與Toll-like 受體(TLR)的調(diào)控,TLR 識別炎性細(xì)胞因子,發(fā)生炎癥反應(yīng)[26]。本研究中,駝乳降低了酒精引發(fā)的TNF-R1、JIP3 和ATF-2 的高表達(dá)。研究表明,敲除JIP3 基因可降低氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng),從而改善NAFLD 小鼠肝損傷[26]。此外,Stebbins 等[27]發(fā)現(xiàn)通過抑制JNK-JIP 位點(diǎn)以劑量依賴性方式抑制JNK 底物的磷酸化,從而阻斷肝損傷。Deng 等[28]研究表明,JNK 基因敲除降低了HCC 細(xì)胞在體外的侵襲和淋巴黏附能力,同時(shí)在基因和蛋白質(zhì)水平下調(diào)了ATF-2 的表達(dá),認(rèn)為ATF-2 是肝癌預(yù)后的潛在標(biāo)志物。由此可知,駝乳通過調(diào)控MAPK 信號通路,改善酒精引發(fā)的炎癥反應(yīng)以及肝細(xì)胞凋亡和損傷。

      近期研究表明,除TLR3 和IL-1 受體外,所有TLR 均以MyD88 作為銜接分子,激活NF-κB 和MAPK 通路[29]。本研究結(jié)果顯示,攝入酒精使Tolllike(CD14、TLR5、TLR9、ERK1/2、PIK3R1)和NFκB 信號通路(CXCL1、TNFR1、IL-1R1、Bcl2a1)基因的顯著上調(diào),而在ET+CM 組中均顯著下調(diào)。此外,本研究PCR 結(jié)果表明駝乳干預(yù)顯著降低CD14、TLR5、TLR9 的表達(dá)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,TLR9 信號的激活可誘導(dǎo)肝細(xì)胞產(chǎn)生CXC 趨化因子配體1(CXCL1),從而誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞進(jìn)入肝臟[30]。CXCL1 是炎性趨化因子,可促進(jìn)炎癥因子釋放并加重炎癥反應(yīng)[31]。在免疫相關(guān)的差異基因中,我們還關(guān)注到重要的促炎因子IL-6,它與可溶性IL-6 受體結(jié)合,然后與膜受體b 鏈gp130 結(jié)合,激活PI3K/Akt 通路。而PIK3R1 是PI3K 的調(diào)節(jié)亞基,所以駝乳通過抑制炎癥因子IL-6 的產(chǎn)生間接抑制PIK3R1 的表達(dá)。趙宏等[32]發(fā)現(xiàn)巴亞格七味散可通過抑制PIK3R1 表達(dá),來減輕酒精性肝病模型小鼠肝組織損傷。還發(fā)現(xiàn)肝癌中PIK3R1 表達(dá)顯著上調(diào),沉默PIK3R1 可抑制HCC 細(xì)胞系增殖、遷移并加速凋亡[33]。IL-1 家族是一個(gè)重要的促炎因子家族,可導(dǎo)致炎癥并與急性和慢性炎癥密切相關(guān)。IL1R1 作為IL-1 的受體,能夠介導(dǎo)IL-1 的級聯(lián)反應(yīng),激活JNK/c-Jun 和NF-κB p65 信號通路并加重炎癥反應(yīng)程度[34]。研究表明,肝細(xì)胞中缺失IL-1R1 可保護(hù)小鼠免受急性肝衰竭,降低肝臟炎癥細(xì)胞因子和趨化因子水平,以及減輕中性粒細(xì)胞因損傷而滲入肝臟[35]。本研究結(jié)果如上所述,駝乳能夠調(diào)控Toll-like 和NF-κB 信號通路抑制酒精誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和肝臟炎癥反應(yīng),從而保護(hù)肝臟免受酒精的損傷。

      4 結(jié)論

      本研究表明,駝乳能夠有效降低肝臟中AST、ALT 的酶活力并可以降低血清中IL-6、IL-1β、TNF-α 水平,提高IL-10 水平。然后通過生物信息學(xué)分析,發(fā)掘出駝乳干預(yù)急性酒精性肝損傷的顯著差異表達(dá)基因和重要的免疫炎癥信號通路以及免疫應(yīng)答關(guān)鍵基因,為預(yù)防酒精性肝損傷研究提供了新的視角,為進(jìn)一步研發(fā)保肝護(hù)肝功能性食品奠定了理論基礎(chǔ)。

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