動(dòng)物DNA 分型及其在法醫(yī)學(xué)中的研究進(jìn)展

高紅艷，劉光甫，吳建，陳鵬宇

1.平頂山學(xué)院醫(yī)學(xué)院，河南 平頂山 467000；2.重慶市人口和計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究院，重慶 400020；3.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴州 遵義 563000

隨著分子生物學(xué)及DNA 檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，非人源DNA 分析作為傳統(tǒng)法醫(yī)DNA 分析的補(bǔ)充，拓寬了法醫(yī)DNA 分析技術(shù)的應(yīng)用范圍，便于全面利用各種生物物證，提高在案件偵破過程中提供線索和證據(jù)的能力。非人源DNA 的檢測(cè)和鑒定日益成為法醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)，對(duì)各類動(dòng)物、植物、微生物的非人源DNA 研究日漸增多。動(dòng)物與人類活動(dòng)關(guān)系最為密切，動(dòng)物DNA 分型在各類非人源DNA 相關(guān)案件偵破中發(fā)揮的作用最為突出，是法醫(yī)學(xué)非人源DNA 分析的主要內(nèi)容。

動(dòng)物DNA 分型，技術(shù)的發(fā)展經(jīng)歷了從形態(tài)學(xué)檢測(cè)到顯微鏡檢驗(yàn)、理化檢驗(yàn)、蛋白分析和免疫學(xué)鑒定等表達(dá)產(chǎn)物水平的檢測(cè)方法[1]，盡管這些方法具有直觀、簡便且價(jià)格低廉的優(yōu)勢(shì)，但是受限于鑒別能力的嚴(yán)重不足，難以滿足實(shí)際應(yīng)用的需求。伴隨著PCR技術(shù)的誕生以及多樣化的DNA 檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，檢測(cè)DNA 分子標(biāo)記成為最具有應(yīng)用價(jià)值的技術(shù)方法，展現(xiàn)出以往的遺傳標(biāo)記分析無法比擬的優(yōu)勢(shì)。動(dòng)物DNA 分型技術(shù)具有高效、準(zhǔn)確、高識(shí)別力的特點(diǎn)，可以進(jìn)行物種鑒定、個(gè)體識(shí)別、親緣分析等，甚至可以對(duì)嚴(yán)重腐敗、降解、污染等傳統(tǒng)鑒定技術(shù)束手無策的檢材進(jìn)行鑒定，可以應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)的多種場(chǎng)景，是目前最為可靠且有效的動(dòng)物鑒定方法[2]。

動(dòng)物DNA 分型及法醫(yī)學(xué)應(yīng)用與人類DNA 分型應(yīng)用的要求和特征有諸多一致之處，主要表現(xiàn)在DNA分型的原理和方法、分型結(jié)果證據(jù)意義的評(píng)估。然而，動(dòng)物DNA 相對(duì)于人類DNA 的應(yīng)用要少得多，這也導(dǎo)致其在分型技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化、基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫建設(shè)以及證據(jù)價(jià)值評(píng)估方法等方面有諸多不完善之處，在實(shí)際應(yīng)用中面臨挑戰(zhàn)和爭議，需要進(jìn)一步加以完善和解決。因此，本文就動(dòng)物DNA 分型在法醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行綜述。

1 動(dòng)物DNA 分型技術(shù)

隨著2001 年人類基因組計(jì)劃的順利完成，動(dòng)物基因組計(jì)劃也取得了相應(yīng)進(jìn)展，基因組數(shù)據(jù)日益增多[3]。其中，美國于2003 年首次公布了與人類關(guān)系最為密切的犬的基因組序列草圖[4]，其他常見的家養(yǎng)動(dòng)物（如馬、貓、牛和豬）的基因組圖譜也相繼繪制完成。此外，法庭科學(xué)中可能涉及的珍稀野生保護(hù)動(dòng)物（如大熊貓、藏羚、揚(yáng)子鱷和東北虎等），也已陸續(xù)獲得相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)，便于進(jìn)行各種分子生物學(xué)的研究。

DNA 序列分析是對(duì)DNA 一級(jí)結(jié)構(gòu)的分析，簡稱為DNA 測(cè)序。如經(jīng)典的Sanger 雙脫氧鏈終止法和二代測(cè)序，在探索生命奧秘、準(zhǔn)確獲取生物遺傳信息中發(fā)揮著重要的作用。姚瑞[5]采用高通量測(cè)序技術(shù)鑒定了30 種大型底棲動(dòng)物，對(duì)生物多樣性的維護(hù)與規(guī)劃起到了非常重要的參考作用。目前，動(dòng)物DNA 分型與人的DNA 分型方法基本類同，在核DNA 和mtDNA 水平上，通過對(duì)不同類型的遺傳標(biāo)記進(jìn)行分型檢測(cè)，為案件提供線索和證據(jù)。這些遺傳標(biāo)記主要包括STR、SNP、InDel 和微單體型。不同的遺傳標(biāo)記，結(jié)合不同的檢測(cè)方法，在法醫(yī)學(xué)中展現(xiàn)出不同的應(yīng)用價(jià)值[6]。

1.1 STR 分析

與人類DNA 分析一樣，STR 基因座也是動(dòng)物DNA 分析中應(yīng)用最為廣泛的長度多態(tài)性遺傳標(biāo)記[7]。2011 年國際法醫(yī)遺傳學(xué)會(huì)（International Society for Forensic Genetics，ISFG）為規(guī)范法醫(yī)遺傳學(xué)調(diào)查中使用動(dòng)物DNA，提出了13 條建議，包括樣本的收集、目標(biāo)序列的驗(yàn)證、遺傳標(biāo)記的選擇、引物序列的篩選、種內(nèi)和種間特異性的驗(yàn)證、重復(fù)性試驗(yàn)等[8]。ISFG 還提出，動(dòng)物STR 分型采用與人STR 分型一致的法醫(yī)物證公認(rèn)的理論與技術(shù)，如以重復(fù)次數(shù)命名等位基因、STR 基因座篩選時(shí)首選四核苷酸重復(fù)的序列、使用等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)品（ladder）作為命名參照，同時(shí)需要有研究群體的遺傳結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)作為證據(jù)評(píng)估的基礎(chǔ)，并考慮多種假設(shè)、采用似然比方法評(píng)估證據(jù)權(quán)重等。ISFG還強(qiáng)調(diào)了常規(guī)開展動(dòng)物DNA 檢驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的資格認(rèn)證，我國公安部于2019 年發(fā)布了《法庭科學(xué) 犬DNA 實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)范》（GA/T 1703—2019），規(guī)定了法庭科學(xué)犬DNA 實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)應(yīng)遵守的基本要求，為我國從事法庭科學(xué)犬DNA 檢驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室提供了基本的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。

對(duì)于動(dòng)物STR 分型的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用，同樣采用個(gè)體識(shí)別率（discrimination power，DP）和非父排除率（probability of exclusion，PE）為指標(biāo)評(píng)價(jià)遺傳標(biāo)記在個(gè)體識(shí)別和親權(quán)鑒定中的系統(tǒng)效能。一般情況下，遺傳標(biāo)記的數(shù)量越多，遺傳標(biāo)記組合在群體中出現(xiàn)重復(fù)的概率越小，個(gè)體識(shí)別能力就越強(qiáng)[9]。針對(duì)狗[10]、貓[11]、馬[12]、牛[13]、熊[14]、鳥[15]等動(dòng)物的個(gè)體識(shí)別和親權(quán)鑒定，目前已篩選出若干STR 基因座并建立了相應(yīng)的法醫(yī)DNA 分型體系和數(shù)據(jù)庫。其中，與人類關(guān)系最為密切的幾種家養(yǎng)動(dòng)物中，狗的STR 遺傳標(biāo)記多達(dá)67 個(gè)，包括66 個(gè)常染色體STR 基因座（REN285G14、REN112I02、REN172C02、REN143K19、FH2890、CO2.466、FH3895、REN157C08、C03.445、FH2732、FH2776、REN160J02、REN92G21、REN285I23、CO5.414、FH2752、REN37H09、REN87M11、REN286L19、REN204K13、CO8.373、CO8.618、C09.173、C09.474、FH2885、C10.781、REN73F08、REN154G10、REN164B05、C11.873、REN208M20、REN94K11、REN286P03、C13.758、C14.866、FH3802、REN06C11、REN144M10、REN85N14、C17.402、REN50B03、REN112G10、FH2783、REN91I14、REN274F18、FH3109、FH3069、REN107H05、FH3078、C23.277、REN181K04、REN106I06、FH3083、REN87O21、C27.436、FH2782、REN239K24、FH3082、REN51C16、FH3053、FH3060、REN314H10、REN112C08、REN106I07、FH2708和VWFX）和1 個(gè)性染色體STR 基因座（Amelogenin）；貓的STR遺傳標(biāo)記有31個(gè)（FCA176、FCA723、FCA084、FCA764、FCA139、FCA105、FCA102、FCA322、FCA823、FCA700、FCA275、FCA356、FCA848、FCA391、FCA736、FCA1056、FCA480、FCA310、FCA1390、FCA920、FCA1239、FCA221、FCA976、FCA742、FCA987、FCA096、FCA085、FCA1014、FCA1015、FCA1016、FCA1315）；牛和馬的STR 遺傳標(biāo)記分別為16 個(gè)（TGLA227、BM2113、TGLA53、ETH10、SPS115、TGLA126、TGLA122、INRA23、ETH3、ETH225、BM1824、BM1862、BM720、BMc701、BM2934、BM861）和17 個(gè)（AHT4、AHT5、ASB2、ASB17、ASB23、HMS2、HMS3、HMS6、HMS7、HTG4、HTG10、VHL20、CA425、HMS1、HTG6、HTG7和LEX3），可達(dá)到法醫(yī)物證檢驗(yàn)要求的個(gè)體識(shí)別率和非父排除率。

自1996 年起，美國Applied Biosystems 公司開始生產(chǎn)用于犬類研究的含有10 個(gè)STR 基因座的商品化熒光標(biāo)記試劑盒，隨后又繼續(xù)研發(fā)包含有貓、牛、馬等動(dòng)物STR 基因座的個(gè)體識(shí)別試劑盒[16]。但是，動(dòng)物STR 分型體系的研發(fā)及應(yīng)用遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及人類STR 分型成熟，在基因座的選擇、樣本的收集、高質(zhì)量基因組數(shù)據(jù)的可獲得性以及經(jīng)費(fèi)支持等方面仍有待提高。

1.2 SNP 分析

SNP 是指單個(gè)核苷酸變異而呈現(xiàn)出序列多態(tài)性的遺傳標(biāo)記。與STR 基因座相比，雖然SNP 位點(diǎn)的信息量較小，但因其在基因組中含量豐富、分布密集，具有突變率低、檢測(cè)自動(dòng)化程度高、適用于高度降解DNA 樣本等優(yōu)勢(shì)，被認(rèn)為是繼STR 后最有潛力的第三代遺傳標(biāo)記[17]。

對(duì)動(dòng)物SNP 的研究，VERSCHEURE 等[18]通過對(duì)346 只犬的26 個(gè)SNP 位點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算得出的非父排除率可達(dá)到97%。日本學(xué)者TOZAKI 等[19]利用全基因組SNP 基因型數(shù)據(jù)，比較了32 個(gè)國際馬品種、8 個(gè)日本本土馬品種和日本純種馬品種的遺傳多樣性，從遺傳多態(tài)性和期望雜合度來看，除北海道外，日本本土馬品種的多樣性相對(duì)較低；而系統(tǒng)發(fā)育和聚類分析結(jié)果表明，不同品種馬之間的關(guān)系很大程度上反映了其在日本的地理分布，為推測(cè)群體遺傳關(guān)系和進(jìn)化提供了參考數(shù)據(jù)。BA 等[20]使用雙酶切限制性位點(diǎn)關(guān)聯(lián)DNA 測(cè)序（double digest restriction-site associated DNA sequencing，ddRAD-seq）技術(shù)在42 只無關(guān)梅花鹿中共檢出96 188 個(gè)SNP 位點(diǎn)，分析發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)位點(diǎn)存在雜合子缺失和期望雜合度值較低的現(xiàn)象，可能與動(dòng)物近親交配和Wahlund 效應(yīng)（即當(dāng)一個(gè)群體被隔離為多個(gè)亞群后，亞群的雜合子比例低于總?cè)后w處于Hardy-Weinberg 平衡時(shí)的雜合子比例）有關(guān)。使用SNP 深入研究梅花鹿的遺傳多樣性，對(duì)梅花鹿的遺傳管理具有重要意義，同時(shí)也為特殊種群的資源培育提供了有效的依據(jù)。

1.3 InDel分析

InDel 是由于DNA 片段的插入或缺失而形成的長度多態(tài)性遺傳標(biāo)記，和SNP 一樣，屬于二等位基因遺傳標(biāo)記。InDel 由于其自身擴(kuò)增片段短，因而對(duì)于陳舊、降解的生物檢材有特殊的應(yīng)用價(jià)值。

在動(dòng)物InDel 研究中，袁文華[21]收集了381 只犬科個(gè)體，通過分析和研究家犬馴化過程中群體InDel結(jié)構(gòu)變異的遺傳進(jìn)化特征，鑒別出了在家犬馴化過程中受到人工選擇作用而發(fā)生快速進(jìn)化的InDel 候選基因NOCT（nocturnin）和髓鞘堿性蛋白（myelin basic protein，MBP），為深入理解家犬的種族起源、馴化歷史以及其他家養(yǎng)動(dòng)物的進(jìn)化機(jī)制研究提供了新的數(shù)據(jù)，也為臨床研究人畜共患病的分子機(jī)制提供了參考依據(jù)。薛蕾[22]對(duì)3 個(gè)群體12 只山羊個(gè)體的全基因組InDel 位點(diǎn)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，平均每只個(gè)體高質(zhì)量的InDel位點(diǎn)為334 151個(gè)；rs668795676和rs657996810位點(diǎn)為大足黑山羊群體特有，rs669452874 位點(diǎn)為內(nèi)蒙古絨山羊群體特有；在rs669452874 位點(diǎn)上，山羊的體質(zhì)量和胸部深度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。GAO 等[23]在陜北白絨山羊群體中，在海馬豐富轉(zhuǎn)錄物1（hippocampus abundant transcript 1，HIAT1）基因的第一個(gè)內(nèi)含子中選擇了一個(gè)15 bp 的插入位點(diǎn)（rs665862918），研究結(jié)果顯示，rs665862918 位點(diǎn)在不同羊群的胸部寬度、胸部深度、心臟周長、身體長度等指標(biāo)中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，rs665862918位點(diǎn)的插入/插入型個(gè)體的生長性狀表現(xiàn)優(yōu)于插入/缺失型或缺失/缺失型個(gè)體。這些結(jié)果證實(shí)了HIAT1基因與山羊體型的相關(guān)性，rs665862918位點(diǎn)作為山羊生長性狀的潛在分子標(biāo)記，有望應(yīng)用于山羊優(yōu)良品種的開發(fā)。

1.4 mtDNA 分析

當(dāng)細(xì)胞核DNA 量不足或降解嚴(yán)重而無法進(jìn)行分型時(shí)，可以使用mtDNA 進(jìn)行分析[24]。法醫(yī)學(xué)動(dòng)物DNA分析中針對(duì)mtDNA 最成熟和廣泛的應(yīng)用之一，是通過DNA 條形碼技術(shù)進(jìn)行物種鑒定。DNA 條形碼技術(shù)是利用生物體內(nèi)一段標(biāo)準(zhǔn)DNA 序列作為標(biāo)記來實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、快速和自動(dòng)化的物種鑒定方法，理想的DNA 條形碼應(yīng)滿足以下3 個(gè)條件[25]：（1）具備足夠的種間變異性，并能夠穩(wěn)定遺傳的基因序列，以區(qū)分不同的物種；（2）具有高度保守的DNA 序列區(qū)域，便于通用引物的設(shè)計(jì)；（3）目標(biāo)DNA 區(qū)域足夠短（300～800 bp），便于降解DNA 的擴(kuò)增。此外，還可使用mtDNA 對(duì)動(dòng)物進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，探討其祖先來源[26]。

2001 年，COX[26]首次提出了DNA 條形碼的初步使用方案，隨后，對(duì)DNA 條形碼的研究在不同領(lǐng)域獲得了迅猛的發(fā)展。目前，生命條形碼聯(lián)盟（Consortium for the Barcode of Life，CBOL）建立了DNA 條形碼數(shù)據(jù)庫，便于以DNA 序列為檢測(cè)對(duì)象的物種鑒定，極大地增強(qiáng)了人類了解、監(jiān)測(cè)和使用生物多樣性資源的能力，在生命科學(xué)、法醫(yī)學(xué)、生物學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景[27]。

但是，由于mtDNA 多態(tài)性較低、母系遺傳、存在異質(zhì)性和分析技術(shù)繁瑣等問題，一般只在涉及低拷貝核基因組DNA 的樣本（無毛囊的毛發(fā)、骨頭、糞便等）、降解檢材無法進(jìn)行STR 分型或者分型失敗時(shí)才需進(jìn)行mtDNA 分型，與STR 直接認(rèn)定的分析結(jié)果相比，mtDNA 分析的法醫(yī)學(xué)價(jià)值主要在于排除[28]。

2 動(dòng)物DNA 分析在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

2.1 案件的無聲證人

據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國養(yǎng)狗與養(yǎng)貓的人數(shù)占比分別為46.1%和30.7%，且年增長速度保持在10%以上[29]。因此，動(dòng)物與人類之間有著非常密切的關(guān)系，在各類涉及動(dòng)物的案件中，理論上可以通過動(dòng)物毛發(fā)、咬痕、排泄物等生物成分，建立動(dòng)物-案犯與案發(fā)現(xiàn)場(chǎng)之間的聯(lián)系，如嫌疑人可能攜帶受害人寵物的毛發(fā)，也可能將自己寵物的毛發(fā)留在案發(fā)現(xiàn)場(chǎng)。根據(jù)一項(xiàng)模擬犯罪的研究[30]，竊賊從受害者家里可攜帶數(shù)百根狗或貓的毛發(fā)，這些毛發(fā)在案件中可以作為無聲的證人發(fā)揮作用。

2.2 動(dòng)物襲擊案件

家養(yǎng)寵物致人傷害甚至死亡的案例屢見不鮮，根據(jù)我國疾控中心發(fā)布的中國狂犬病防治現(xiàn)狀，我國每年被狗或貓咬傷的人有上千萬[31]。在動(dòng)物襲擊案件中，可提取被咬人咬痕處動(dòng)物的唾液DNA 進(jìn)行檢驗(yàn)，從而判定動(dòng)物主人的責(zé)任，在鑒定實(shí)踐中發(fā)揮作用[32]。

2.3 野生動(dòng)物保護(hù)

目前，野生動(dòng)物走私與軍火走私、毒品走私并列為三大非法交易[33]。野生動(dòng)物的非法貿(mào)易不僅破壞了生物多樣性，促使許多珍稀動(dòng)物瀕臨滅絕，同時(shí)可以導(dǎo)致外來入侵物種破壞當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)平衡，甚至一些野生動(dòng)物攜帶的病毒向人類蔓延，威脅到人類公共安全[34]。在野生動(dòng)物保護(hù)活動(dòng)中，物種鑒定、地域溯源、死因分析等是必須解決的首要問題，也是立案?jìng)刹榈囊罁?jù)，能夠?yàn)樾淌略V訟提供科學(xué)依據(jù)。目前，采用DNA分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)動(dòng)物種屬、動(dòng)物損傷、動(dòng)物痕跡等信息進(jìn)行鑒定，已成為一種可靠、有效的方法，在野生動(dòng)物保護(hù)法的執(zhí)行中起到關(guān)鍵作用。目前，我國對(duì)犀牛角、象牙、瀕危蛇類等基于DNA 條形碼技術(shù)的多種物種鑒定取得了快速發(fā)展[35]。但從整體來看，我國尚未形成規(guī)范化的體系研究，限制了法醫(yī)動(dòng)物學(xué)研究的發(fā)展和進(jìn)步。

2.4 動(dòng)物的親子鑒定

隨著動(dòng)物繁殖代數(shù)的增加，會(huì)在基因水平發(fā)生可累積的突變。在DNA序列上的差異，可采用醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、遺傳學(xué)等方法對(duì)個(gè)體和親代的遺傳關(guān)系進(jìn)行分析，以此進(jìn)行動(dòng)物的親子鑒定。除了動(dòng)物個(gè)體和親代的毛發(fā)、毛色、體型等形態(tài)學(xué)標(biāo)記，使用DNA 分子標(biāo)記，可準(zhǔn)確地反映物種之間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近[36]。動(dòng)物親子鑒定最常用的遺傳標(biāo)記為STR。對(duì)動(dòng)物進(jìn)行親子鑒定，國外研究相較于國內(nèi)早且規(guī)范和成熟。LUIKART等[37]在1999 年使用22 個(gè)STR 位點(diǎn)對(duì)山羊進(jìn)行親子鑒定，結(jié)果顯示，3 種山羊的累積非父排除率均大于0.999 9。ZHAO等[38]在2020年使用15個(gè)STR位點(diǎn)對(duì)老虎進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，累積非父排除率和累積個(gè)體識(shí)別率分別達(dá)到0.999 999 472 和0.999 999 999 999 5。

2.5 其他應(yīng)用

除了法庭科學(xué)中與偵查訴訟有關(guān)的案件，動(dòng)物DNA 分析技術(shù)也可用于非訴訟的場(chǎng)景，如應(yīng)用于興奮劑調(diào)查中賽馬的個(gè)體識(shí)別[39]、良種篩選及優(yōu)育[40]、功能基因定位[41]、遺傳疾病檢測(cè)[42]、群體結(jié)構(gòu)和遺傳關(guān)系分析[43]以及克隆動(dòng)物的身份鑒定[44]等。

3 動(dòng)物DNA 分型面臨的挑戰(zhàn)

動(dòng)物DNA 分型技術(shù)的起步很早，但是相對(duì)人類DNA 的應(yīng)用仍比較少，在法醫(yī)學(xué)實(shí)際應(yīng)用中尚存在多方面的不足和挑戰(zhàn)。因此，動(dòng)物DNA 分析在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用還需要進(jìn)一步研究和完善。

3.1 動(dòng)物DNA 分型技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化

人類DNA 分型技術(shù)已相當(dāng)成熟和規(guī)范，參照人類DNA 分型技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，ISFG 已于2011 年對(duì)動(dòng)物DNA的法醫(yī)學(xué)鑒定提出了相關(guān)建議[8]，但是分型標(biāo)準(zhǔn)仍未確定，很多常規(guī)實(shí)驗(yàn)室難以完成此類特殊樣本的檢測(cè)和分型，且有很多動(dòng)物核心序列未公布，基因座的定位和判讀也受到一定程度的制約。在數(shù)據(jù)共享、基因座優(yōu)化、分型標(biāo)準(zhǔn)化等方面，仍需法醫(yī)工作者不斷探索和研究。

3.2 動(dòng)物DNA 數(shù)據(jù)庫的建立

目前國外已有一些小型動(dòng)物DNA 數(shù)據(jù)庫，政府也累積了一些動(dòng)物DNA 案例，但是要滿足日益增多的案件需求，需要的是更龐大的數(shù)據(jù)庫[45]。部分動(dòng)物，尤其是瀕危野生物種，存在采樣困難、數(shù)據(jù)誤差大等問題，難以準(zhǔn)確計(jì)算相關(guān)的法醫(yī)學(xué)參數(shù)并進(jìn)行DNA分型結(jié)果的證據(jù)價(jià)值評(píng)估。為了解決野外采樣DNA難以持久保存的困難，2013年，CAMACHO-SANCHEZ等[46]對(duì)野外生物取樣進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，在現(xiàn)場(chǎng)低溫保存以確保DNA 或RNA 穩(wěn)定性的效果并不滿意，樣本只能保存1 周左右，而使用核酸保存緩沖液（nucleic acid preservation buffer，NAP），樣本至少可以保存2 個(gè)月。高質(zhì)量的樣本是獲得高質(zhì)量遺傳數(shù)據(jù)的關(guān)鍵，動(dòng)物DNA 數(shù)據(jù)庫的建立也需要在保證樣本質(zhì)量的前提下開展。近期，STRBase（SRD-130）數(shù)據(jù)庫（http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/）除了人類STR 數(shù)據(jù)，還收集了貓、狗、牛、馬等動(dòng)物的STR 數(shù)據(jù)，便于實(shí)驗(yàn)室間的數(shù)據(jù)共享，其他實(shí)驗(yàn)室的分型數(shù)據(jù)也可以繼續(xù)上傳至該數(shù)據(jù)庫，促進(jìn)了動(dòng)物STR 分型技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展和標(biāo)準(zhǔn)化流程的制定，也為法醫(yī)動(dòng)物DNA 分型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室序列化比對(duì)和種群識(shí)別提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐。中國動(dòng)物藥材DNA 條形碼數(shù)據(jù)庫[47]首次構(gòu)建了統(tǒng)一的中國動(dòng)物藥材DNA 條形碼數(shù)據(jù)庫，對(duì)動(dòng)物藥材鑒定、資源可持續(xù)利用和瀕危物種保護(hù)均有重要意義。

3.3 動(dòng)物DNA 分析的證據(jù)效能評(píng)估

與人類相比，動(dòng)物具有雜交、回交和近交等特殊的繁殖方式[48]，會(huì)對(duì)基因座多態(tài)性的群體分布造成很大影響，在進(jìn)行證據(jù)價(jià)值評(píng)估時(shí)，亞群之間的差異[49]、基因座連鎖不平衡[50]、基因遷移等問題也需要關(guān)注。在法醫(yī)學(xué)中，使用共祖系數(shù)[51]對(duì)來源于同一種群的兩個(gè)個(gè)體進(jìn)行遺傳學(xué)圖譜比對(duì)時(shí)，這兩個(gè)個(gè)體具有相同的祖先即擁有同一等位基因的機(jī)會(huì)稱為Fst或者θ。在人群中，F(xiàn)st的范圍是0.01～0.03[52]。當(dāng)群體數(shù)量足夠多時(shí)，擁有同一祖先的機(jī)會(huì)是非常小的，但是在非人類種群中情況有所不同，特別是在被隔離的小的野生動(dòng)物種群、被馴養(yǎng)的動(dòng)物種群、分布比較局限或者多配偶的動(dòng)物種群中，擁有同一祖先的情況是非常普遍的[53]。因此，在證據(jù)效能評(píng)估時(shí)，選擇Fst值小的遺傳標(biāo)記進(jìn)行個(gè)體識(shí)別，選擇Fst值大的遺傳標(biāo)記進(jìn)行祖先推斷。雖然在大多數(shù)情況下，個(gè)體或物種的DNA鑒定并不困難，但是相同的起源、密集的近親繁殖和遺傳漂變[54]使得界定物種品種或地理種群要困難得多，尤其是對(duì)于形態(tài)特征的遺傳變異[55]導(dǎo)致的復(fù)雜性狀背后的遺傳學(xué)理論目前仍處于探索階段。

總之，動(dòng)物DNA 分析與人類DNA 鑒定有許多相似性，應(yīng)用也日益廣泛，目前已陸續(xù)報(bào)道了相關(guān)數(shù)據(jù)和案例，但是開展動(dòng)物DNA 分型的法醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室仍然較少，法庭對(duì)其證據(jù)效能的信任度并不高，有時(shí)在數(shù)據(jù)分析、動(dòng)物出庭作證、寵物主人認(rèn)定等方面還會(huì)產(chǎn)生爭議。此外，動(dòng)物DNA 分析應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)實(shí)踐時(shí)，需要注意的問題也較多，如動(dòng)物可能的近親繁殖或遺傳漂變對(duì)遺傳標(biāo)記多態(tài)性程度的影響，流浪動(dòng)物難以追蹤以及特別稀缺物種的數(shù)據(jù)不足等復(fù)雜問題。與人類DNA 分型相比，動(dòng)物DNA 分型技術(shù)在標(biāo)準(zhǔn)化、DNA 數(shù)據(jù)庫建設(shè)、DNA 分析證據(jù)效能評(píng)估等方面仍需進(jìn)一步完善和研究。隨著動(dòng)物DNA 分型技術(shù)的不斷發(fā)展和成熟以及法醫(yī)學(xué)應(yīng)用所需的上述基礎(chǔ)工作的不斷推進(jìn)，動(dòng)物DNA 分型勢(shì)必將在更為廣泛的鑒定實(shí)踐中發(fā)揮越來越重要的作用。