吳小霞, 趙夢(mèng)夢(mèng), 劉 虎, 孫允凱,3*

(1. 南華大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院,湖南 衡陽(yáng) 421001; 2. 嘉實(shí)(湖南)醫(yī)藥科技有限公司,湖南 長(zhǎng)沙 410220; 3. 常州工學(xué)院 化工與材料學(xué)院,江蘇 常州 213032)

勃起功能障礙(ED)作為成年男性常見的性功能障礙之一,是指無(wú)法達(dá)到或維持足夠的勃起而產(chǎn)生的令人滿意的性行為[1],表現(xiàn)為一種對(duì)生活質(zhì)量有顯著負(fù)面影響的現(xiàn)象。ED影響了世界各地?cái)?shù)以百萬(wàn)計(jì)人的性生活及其妻子身心福祉和生活質(zhì)量[2]。研究表明,加拿大存在40%的成年男性患有勃起功能障礙,而美國(guó)大約有1000～3000萬(wàn)男性患有不同程度的ED[3]。2021年中國(guó)衛(wèi)健委調(diào)查數(shù)據(jù)顯示,我國(guó)成年男性ED總體患病率高達(dá)40.5%。 ED的理想治療方法應(yīng)該體現(xiàn)在易于給藥、無(wú)創(chuàng)、不疼痛、高效和副作用小等方面[4]。由于人類早期對(duì)勃起的基本生理生化機(jī)制了解有限,可采取的治療方法主要包括心理和激素策略,以及陰莖植入物和真空裝置的使用等。隨著人們對(duì)勃起機(jī)制的深入了解,研究人員開發(fā)了體內(nèi)注射和口服5型磷酸二酯酶(PDE5)抑制劑的策略。其中,口服PDE5抑制劑徹底改變了ED的治療方式,并因其有效性和良好的安全性成為一線治療方法[5-6]。

PDE5抑制劑在男性勃起功能障礙等疾病中具有廣泛應(yīng)用。歐洲藥品局批準(zhǔn)了3種治療ED的PDE5抑制劑[7],即西地那非、他達(dá)拉非和伐地那非。BOOLELL[8]最早提出用西地那非來(lái)治療男性勃起功能障礙,使其成為第1個(gè)用于治療男性勃起功能障礙的PDE5抑制劑[9]。該抑制劑經(jīng)腸道迅速吸收,可在30～60 min后起效,1 h內(nèi)達(dá)到峰值血漿濃度[10],半衰期(t1/2)為3～5 h,作用時(shí)間最長(zhǎng)可達(dá)12 h[11]。西地那非雖然可以有效地改善勃起功能,但其與PDE6受體存在一些交叉反應(yīng)性,而PDE6受體存在于視網(wǎng)膜光感受器中,因而會(huì)導(dǎo)致一些患者的色覺(jué)異常[12-13]。由于西地那非可經(jīng)腸道吸收,若食用脂肪含量高的食物會(huì)減少其吸收,從而延長(zhǎng)作用時(shí)間。在西地那非的研究基礎(chǔ)上,又推出了伐地那非和他達(dá)拉非,兩者均于2003年批準(zhǔn)上市。伐地那非在給藥30 min后起作用,1 h內(nèi)達(dá)到峰值血漿濃度,t1/2為4～5 h[14-15]。雖然伐地那非作用效果是西地那非的10倍,但高脂肪的食物同樣會(huì)降低其效果[16]。他達(dá)拉非在給藥30 min后有效,2 h內(nèi)達(dá)到峰值血漿濃度[17]。然而,他達(dá)拉非的t1/2為17 h,因而其藥效作用持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)36 h,且療效不受脂肪攝入量的影響[18]。他達(dá)拉非與PDE11有一定的交叉反應(yīng),同樣會(huì)給患者帶來(lái)副作用。之后研究人員又陸續(xù)開發(fā)了3個(gè)其他PDE5抑制劑:烏地那非[19](udenafil),米羅那非[20](mirodenafil)和阿伐那非。

阿伐那非作為治療男性勃起功能障礙的高效PDE5抑制劑,其安全性受到了人們的廣泛關(guān)注。除了定量藥物外,還必須了解藥品中雜質(zhì)的來(lái)源和控制方法。研究人員開發(fā)了許多檢測(cè)藥品中PDE5抑制劑含量的方法,包括TLC和HPLC-PDA-MS[21]、 LC-ESI-MS/MS[22]、 LC-QTOF-MS[23]以及LC-MS/MS[24]等。為了滿足各藥物監(jiān)管機(jī)構(gòu)的要求,阿伐那非用藥限度應(yīng)控制在毒理學(xué)的門檻以內(nèi)[25]。合成藥物中的雜質(zhì)主要源于起始底物、試劑、溶劑和副反應(yīng),其次在溫度、濕度和光照等因素影響下,藥品質(zhì)量會(huì)隨時(shí)間發(fā)生變化,因而藥品穩(wěn)定性測(cè)試是藥物審批過(guò)程中評(píng)估藥品質(zhì)量的重要步驟。本文對(duì)阿伐那非合成過(guò)程中確定的有機(jī)雜質(zhì)和阿伐那非的降解產(chǎn)物及控制分析方法進(jìn)行總結(jié),以便開發(fā)出更優(yōu)的鑒定表征和控制阿伐那非有關(guān)物質(zhì)限度的方法。

1 阿伐那非概述和合成

1.1 阿伐那非概述

阿伐那非(avanafil),化學(xué)名為(S)-4-((3-氯-4-甲氧基芐基)氨基)-2-(2-(羥甲基)-1-吡咯烷基)-N-(2-嘧啶基甲基)-5-嘧啶甲酰胺,分子式為C23H26ClN7O3,商品名為Stendra,是由三菱田邊制藥公司開發(fā)的一種cGMP特異性PDE5抑制劑,于2012年經(jīng)美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市。藥品呈橢圓形、為刻有規(guī)格的淡黃色片劑,規(guī)格有50 mg、 100 mg和200 mg[26]。實(shí)際上,該藥品是一種白色的結(jié)晶粉末,可溶于甲醇和乙腈而幾乎不溶于水,可溶于0.1 mol/L鹽酸,pKa值為9.04。體外研究表明,阿伐那非對(duì)PDE5的選擇性比對(duì)其他已知的磷酸二酯酶的選擇性高,起效更快[27-28],副作用更少[29],因此,阿伐那非作為新型藥物,具有良好的市場(chǎng)前景。

1.2 阿伐那非的合成

迄今為止,許多文獻(xiàn)[30]報(bào)道了阿伐那非的合成路線。YAMADA課題組[31]最早提出了阿伐那非的制備過(guò)程(圖1)。該過(guò)程主要為:3-氯-4-甲氧基芐胺(SM1)與4-氯-2-(甲硫基)嘧啶-5-甲酸乙酯(1)發(fā)生親核取代反應(yīng)合成4-(3-氯-4-甲氧基芐基氨基)-5-乙氧基羰基-2-甲硫基嘧啶(2);化合物2被氧化得到氧化產(chǎn)物4-(3-氯-4-甲氧基芐基氨基)-5-乙氧基羰基-2-甲基亞磺?；奏?2),化合物2與L-脯胺醇(SM2)發(fā)生親核取代反應(yīng)生成(S)-4-(3-氯-4-甲氧基芐基氨基)-5-乙氧基羰基-2-(2-羥甲基-1-吡咯烷基)嘧啶(4);化合物4經(jīng)水解后得到化合物(S)-4-(3-氯-4-甲氧基芐基氨基)-5-羧基-2-(2-羥甲基-1-吡咯烷基)嘧啶(5);化合物5與2-氨甲基嘧啶(SM3反應(yīng)制得阿伐那非。該合成方法所需試劑較多,操作工序和反應(yīng)條件復(fù)雜,反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng),產(chǎn)品收率不高。目前主流工業(yè)化生產(chǎn)是在該合成路線的基礎(chǔ)上,改變水解和取代的先后順序,可有效避免外消旋化,提高阿伐那非的產(chǎn)率和純度。

圖1 YAMADA[31]的阿伐那非合成路線

基于YAMADA課題組的阿伐那非制備方法,我國(guó)研究者對(duì)其進(jìn)行了改進(jìn)。2013年,許學(xué)農(nóng)[32]在其專利中報(bào)道了阿伐那非的合成路線(圖2)。將6-氨基-1,2二氫嘧啶-2-酮-5-甲酸乙酯(6)與SM1反應(yīng)生成6-((3-氯-4-甲氧基芐基)氨基)-2-酮-1,2-二氫嘧啶-5-甲酸乙酯(7);化合物7被SM2發(fā)生親核取代后,得到化合物(S)-4-((3-氯-4-甲氧基芐基)氨基)-2-(2-(羥甲基)吡咯烷-1,2-二氫嘧啶-5-甲酸乙酯(8),化合物8水解后再與SM3反應(yīng)制得阿伐那非。該路線符合綠色化學(xué)的原子經(jīng)濟(jì)性理念,操作工序簡(jiǎn)潔。但由于化合物6不屬于大宗工業(yè)化原料,導(dǎo)致制備阿伐那非的成本較高,且中間體8易水解,會(huì)使手性片段發(fā)生外消旋化,降低阿伐那非收率和純度。此外,許學(xué)農(nóng)[33]還報(bào)道了一種以胞嘧啶(Cytosine)為起始原料,經(jīng)過(guò)取代、縮合以及鹵代加成制備阿伐那非的方法。該法雖然原料易得,工藝簡(jiǎn)單,但其鹵代試劑為液溴,當(dāng)采用含鎳化合物做催化劑時(shí),液溴和含鎳催化劑的使用會(huì)增加實(shí)驗(yàn)安全風(fēng)險(xiǎn)且引入元素雜質(zhì),不利于工業(yè)生產(chǎn)。

圖2 許學(xué)農(nóng)[33]的阿伐那非合成路線

2014年,程曉峰等[34]開發(fā)了一條適合工業(yè)化生產(chǎn)的阿伐那非合成路線(圖3)。將化合物1和SM1作為原料,經(jīng)反應(yīng)得到化合物2;將化合物2水解后得到6-((3-氯-4-甲氧基芐基)氨基)-2-(甲硫基)-1,2-二氫嘧啶-5-甲酸(9);化合物9與SM3反應(yīng)得6-((3-氯-4-甲氧基芐基)氨基)-2-(甲硫基)-1,2-二氫嘧啶-N-嘧啶-5-甲酰胺(10);之后經(jīng)m-CPBA氧化后得到6-((3-氯-4-甲氧基芐基)氨基)-2-甲基亞磺?；?1,2-二氫嘧啶-N-嘧啶-5-甲酰胺(11);化合物11與SM2反應(yīng)得到阿伐那非。與YAMADA課題組和許學(xué)農(nóng)的合成路線相比,該合成路線采用先水解后酰胺化再進(jìn)行取代的方法,可有效避免消旋化產(chǎn)物的生成,提高了反應(yīng)的產(chǎn)率。

圖3 程曉峰[34]的阿伐那非合成路線

2015年,PRADHAN課題組[35]報(bào)道了一種通過(guò)在極性溶劑中還原(4-((3-氯-4-甲氧基芐基)氨基)-5-((嘧啶-2-基甲基)氨基甲酰基)嘧啶-2-基)-D-脯氨酸(12)來(lái)制備阿伐那非的方法(圖4)。起始物1和SM1發(fā)生取代反應(yīng)生成化合物2,化合物2水解成酸后與SM3反應(yīng)生成化合物10,經(jīng)氧化后再與D-脯氨酸(SM4)反應(yīng)得化合物12。該路線得到的阿伐那非純度高且產(chǎn)率高,其制備過(guò)程簡(jiǎn)單,利于工業(yè)化生產(chǎn)。

圖4 PRADHAN[35]的阿伐那非合成路線

2016年,李志強(qiáng)等[36]提出了一條新的阿伐那非合成路線(圖5)。化合物4-氯-2-(甲硫基)嘧啶-5-甲酰氯(13)和SM3在-10～5 ℃反應(yīng)條件下生成化合物4-氯-2-(甲硫基)嘧啶-N-(-2-甲基)嘧啶-5-甲酰胺(14);之后在0～3 ℃條件下,將化合物14與SM1反應(yīng)得到化合物10;最后將化合物10與SM2在室溫條件下反應(yīng)18～20 h得阿伐那非。該合成方法反應(yīng)步驟少,產(chǎn)品收率高,但起始物料為非大宗化學(xué)品,將使成本升高。

圖5 李志強(qiáng)[36]的阿伐那非合成路線

2018年,楊虎星等[37]提出了一種阿伐那非的制備方法(圖6)。以甲基硫脲硫酸和乙氧亞甲基丙二酸二乙酯為初始原料,依次經(jīng)過(guò)環(huán)合、氯化反應(yīng)得到化合物1;將化合物1與3-氯-4-甲氧基芐胺SM1進(jìn)行取代、水解后得化合物9;將化合物9與SM3反應(yīng)得到關(guān)鍵中間體10,化合物10經(jīng)氧化后與SM2反應(yīng)生成阿伐那非。該路線具有原料易得、操作簡(jiǎn)便,反應(yīng)條件溫和,產(chǎn)品收率較高的優(yōu)點(diǎn)。

圖6 楊虎星[37]的阿伐那非合成路線

湯俊等[38]提出了改進(jìn)的阿伐那非合成路線(圖7)。將4-[(3-氯-4-甲氧基苯基)甲氨基]-2-[(S)-2-羥甲基吡咯-1-基]嘧啶-5-羧酸和2-氨甲基嘧啶經(jīng)硼酸卟啉催化反應(yīng)后得阿伐那非。反應(yīng)結(jié)束后目標(biāo)產(chǎn)物與催化劑易于分離,大大降低了后期產(chǎn)物分離提純的難度,回收的催化劑可以循環(huán)利用,整個(gè)催化反應(yīng)具有簡(jiǎn)單、綠色等特點(diǎn)。

圖7 湯俊[38]的阿伐那非合成路線

2 阿伐那非及其有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)

2.1 有關(guān)物質(zhì)的定義及影響

有關(guān)物質(zhì)是指化學(xué)結(jié)構(gòu)與活性成分類似或具有淵源關(guān)系的有機(jī)雜質(zhì),包括副反應(yīng)產(chǎn)物、中間體、聚合體、起始原料和貯藏過(guò)程中的降解產(chǎn)物等[39]。中國(guó)藥典上詳細(xì)記錄上市藥物的檢測(cè)方法和限度,其中有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)是關(guān)鍵性的研究項(xiàng)目之一。而雜志的檢測(cè)需要結(jié)合藥品的工藝過(guò)程和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)來(lái)進(jìn)行分析,從而檢測(cè)出可能的雜質(zhì)來(lái)源,同時(shí)將雜質(zhì)控制在一個(gè)安全、合理的限度范圍內(nèi)[40]。通過(guò)雜質(zhì)譜分析掌握藥品雜質(zhì)的概貌,可評(píng)估雜質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn)水平,并建立有針對(duì)性的分析方法,從而盡可能檢測(cè)出各種潛在的雜質(zhì)[41]。而對(duì)藥物的降解進(jìn)行研究,能實(shí)現(xiàn)從雜質(zhì)產(chǎn)生的源頭方面主動(dòng)把控藥品雜質(zhì)風(fēng)險(xiǎn),保證對(duì)藥品質(zhì)量的有效控制。阿伐那非結(jié)構(gòu)具有酰胺、芳基氯和羥基等官能團(tuán),因而在水解過(guò)程中很容易變?yōu)橛卸镜慕到馕?。根?jù)ICH指南Q1A(r2)的要求,必須對(duì)阿伐那非及其有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行徹底的化學(xué)穩(wěn)定性研究,進(jìn)而開發(fā)出適合阿伐那非高效、靈敏的控制分析方法。

2.2 高效液相色譜(HPLC)法

高效液相色譜(HPLC)是鑒別、量化和分離混合物成分最常用的技術(shù)[42],其在藥物分析的應(yīng)用中為治療性藥物監(jiān)測(cè)和臨床研究提供了一個(gè)強(qiáng)有力的工具[43-44]。近年來(lái),研究人員開發(fā)了一系列的阿伐那非及其有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)分析方法。例如,HEGAZY[45]建立了靈敏、簡(jiǎn)單的反相HPLC法,并以他達(dá)拉非作為內(nèi)標(biāo)測(cè)定的同時(shí)對(duì)其進(jìn)行了驗(yàn)證。在EclipseC18柱(150.00 mm×4.60 mm, 5.00 μm粒徑)的運(yùn)行時(shí)間內(nèi),使用流動(dòng)相為乙腈:0.15%三乙胺(40 ∶60,V∶V),在7.0 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了分離。分析阿伐那非在1.00 mL/min的流速下的熒光效果,檢測(cè)值為236/370 nm,達(dá)泊西汀的熒光檢測(cè)為236/410 nm。通過(guò)天然熒光測(cè)定,阿伐那非和達(dá)托霉素的響應(yīng)值在0.05～40.00 μg/mL和0.01～30 μg/mL的范圍內(nèi)呈線性變化,檢測(cè)限分別為0.043 μg/mL和0.007 μg/mL。

KUMAR課題組[46]提出了一種測(cè)定阿伐那非片中降解物和已知雜質(zhì)的穩(wěn)定性指示HPLC方法。阿伐那非片在酸、堿、氧化、光熱和潮濕條件下會(huì)觀察到明顯降解。通過(guò)對(duì)不同條件下阿伐那非的降解產(chǎn)物用RP-HPLC進(jìn)行分離純化,在45 ℃時(shí),采用慣性O(shè)DS3柱(3.00 μm, 4.60 mm×250.00 mm)。流動(dòng)相A為0.10%三氟乙酸和三乙胺水溶液,流動(dòng)相B為水和乙腈(20 ∶80,V∶V)。采用1.2 mL/min梯度的洗脫模式,并在245 nm處記錄峰值響應(yīng),最終得到了較好得分離色譜圖。雖從已知雜質(zhì)中觀察到了分離出的降解物,但降解產(chǎn)物峰未較好地分離。該方法具有特異性、精確、穩(wěn)健和線性,是一種準(zhǔn)確測(cè)定雜質(zhì)含量的穩(wěn)定性指示方法,可用于生產(chǎn)樣品時(shí)常規(guī)分析以及雜質(zhì)含量檢測(cè)。

2022年,本課題組[47]提出了一種新的穩(wěn)定梯度超高效液相色譜法(UPLC),檢測(cè)了多個(gè)實(shí)驗(yàn)室批次中含量為0.29%～1.63%的4種雜質(zhì)(圖8),并且首次報(bào)道了Imp-D的合成路線。該UPLC方法采用HSSC18(50.00 mm×2.10 mm,粒徑1.80 μm)柱,柱溫35 ℃,流動(dòng)相組成為甲酸銨(20.00 mM)和乙腈,采用梯度洗脫,檢測(cè)波長(zhǎng)為239.00 nm。結(jié)果表明,該方法有很好得特異性、線性度、精密度、準(zhǔn)確性和靈敏度,獲到的色譜也說(shuō)明該方法對(duì)阿伐那非和有關(guān)物質(zhì)優(yōu)異的分離效果,符合監(jiān)管機(jī)構(gòu)要求的質(zhì)量控制限度。

圖8 Imp-A、 Imp-B、 Imp-C和Imp-D的結(jié)構(gòu)

2.3 基于QbD的HPLC法

(1) QbD用于HPLC藥物分析方法的建立

質(zhì)量源于設(shè)計(jì)(quality by design, QbD)的概念是在人們將所有潛在風(fēng)險(xiǎn)融入到藥物研發(fā)和設(shè)計(jì)中而產(chǎn)生的。ICH Q8中明確指出QbD可用于新藥分析方法的建立和評(píng)估[48]。HPLC因其強(qiáng)大的分離能力而成為藥物分析強(qiáng)有力的工具,對(duì)于針對(duì)不同藥物而建立的HPLC法,需要對(duì)分析方法進(jìn)行驗(yàn)證并考察專屬性、線性、精確度和準(zhǔn)確度等。而考察這類特性一般在研究的最后階段,同時(shí)需要投入大量的人力及物力。QbD便可用于解決此種問(wèn)題,用風(fēng)險(xiǎn)管理的過(guò)程質(zhì)量控制方法,將潛在風(fēng)險(xiǎn)融入到最初階段,從源頭解決問(wèn)題。隨著QbD理念的引入及應(yīng)用,研究者們已開始逐步在分析方法開發(fā)中運(yùn)用QbD的理念[49]。

(2) 基于QbD的HPLC法檢測(cè)阿伐那非制劑

KOTHARI課題組[50]開發(fā)了用于檢測(cè)二元混合物和劑型中的阿伐那非和達(dá)泊西汀的多元紫外分光光度法和基于QbD的HPLC法,同時(shí)還提出了4種測(cè)定藥片中阿伐那非和達(dá)泊西汀的化學(xué)計(jì)量輔助方法(CLS、 PLS、 PCR和NPLS)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中采用Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化了4個(gè)關(guān)鍵變量,即設(shè)計(jì)了1個(gè)實(shí)驗(yàn)程序,揭示流動(dòng)相比、溫度柱烘箱溫度、流速和pH對(duì)目標(biāo)藥物的峰面積、對(duì)稱性、分辨率和保留時(shí)間的影響。該HPLC法雖能高效準(zhǔn)確的測(cè)出藥片中的阿伐那非的含量,但卻無(wú)法測(cè)定降解產(chǎn)物以及阿伐那非中的雜質(zhì)。

PATEL等[51]報(bào)道了一種基于QbD法的詳細(xì)穩(wěn)定的HPLC-PDA方法。應(yīng)用系統(tǒng)QbD方法,通過(guò)篩選和優(yōu)化來(lái)推導(dǎo)阿伐那非全面的化學(xué)穩(wěn)定性。主要參數(shù)篩選采用石川圖和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方法,并通過(guò)中心復(fù)合設(shè)計(jì)(CCD)優(yōu)化了4個(gè)關(guān)鍵因素:C18柱(250.00 mm×4.60 mm, 5.00μm),流動(dòng)相為10mM醋酸銨緩沖液:ACN(60 ∶40,V∶V), pH為4.5,流速為0.90 mL/min,柱溫為20 ℃,從而獲得不同條件下阿伐那非的降解峰。阿伐那非的化學(xué)穩(wěn)定性研究表明,在氧化、熱和酸堿性條件下阿伐那非容易降解。該方法有利于藥物在合成、保質(zhì)期和有效期確定期間的藥物質(zhì)量管理。

2.4 LC-MS法

(1) LC-MS/MS方法

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)作為高效的分離鑒定分析方法,在有機(jī)合成、藥物分析和生物蛋白酶等方面有著重要的作用。PONTAROLO課題組[52]開發(fā)和驗(yàn)證了一種基于LC-MS/MS的新的生物分析方法,可以同時(shí)測(cè)定6種人血漿中PDE5抑制劑(阿伐那非、洛地那非、西地那非、他達(dá)拉非、烏地那非和伐地那非)的含量。該方法采用XbriceC18柱,柱溫為40 ℃,以水和乙腈作為流動(dòng)相(甲酸和甲酸銨)并按梯度模式進(jìn)行分離。用乙醚提取人血漿,以磺基喹惡啉作為內(nèi)標(biāo),得到完全分離的色譜。根據(jù)目前的指南,對(duì)該方法進(jìn)行了驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)PDE5抑制劑具有選擇性、線性且精確、無(wú)殘留和無(wú)基質(zhì)效應(yīng),但該方法只能測(cè)定PDE5抑制劑的含量,不能檢測(cè)其他雜質(zhì)。

PATEL等[53]針對(duì)阿伐那非開發(fā)了一種新型的LC-MS/MS兼容方法,鑒定和表征了其降解產(chǎn)物。根據(jù)LC-MS/MS產(chǎn)生的碎片離子數(shù)據(jù),解析了16種降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)(圖9),進(jìn)一步提出了阿伐那非在酸、堿性、氧化、光解和熱降解條件下的合理降解機(jī)制,從而表明其降解是由親核取代反應(yīng)和酰胺水解引起的。從結(jié)構(gòu)上可以看出,酰胺基容易水解,而芳基氯和氫氧基易發(fā)生光分解。該方法雖能分析阿伐那非的降解雜質(zhì)并解析其結(jié)構(gòu),但降解產(chǎn)物的分離效果不是很理想。

圖9 16種降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)

(2) LCMS-IT-TOF法

CAN等[54]采用LC-DAD、 LC-MS/MS和LCMS-IT-TOF測(cè)定了藥物制劑中阿伐那非含量并對(duì)其降解產(chǎn)物做定性分析,鑒定新型降解產(chǎn)物。LC-DAD或LC-MS/MS技術(shù)均可以用于阿伐那非及其降解產(chǎn)物和達(dá)泊西汀的無(wú)干擾測(cè)定,同時(shí)可用于QC實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)分析。當(dāng)采用LC-DAD和LC-MS/MS儀器時(shí),該方法可分別在11.80 min和12.60 min范圍內(nèi)檢測(cè)和定量阿伐那非。而采用LCMS-IT-TOF法首次鑒定出了在氧化條件下產(chǎn)生的新型降解產(chǎn)物(圖10)。阿伐那非的檢測(cè)時(shí)間約為14.70 min,而已知降解物Imp-E和Imp-F以及新的降解產(chǎn)物Imp-G的保留時(shí)間分別為13.30、 20.50和33.50 min,因此,LCMS-IT-TOF在新的降解產(chǎn)物的研究中具有優(yōu)越性。

圖10 Imp-E、 Imp-F和Imp-G的結(jié)構(gòu)

(3) LC-QQQ-MS法

由于阿伐那非在長(zhǎng)期給藥后仍存在副作用,因此有必要對(duì)其藥代動(dòng)力學(xué)和生物利用度參數(shù)進(jìn)行研究。KAMMOUN課題組[55]建立了一種靈敏的高效液相色譜-三重四質(zhì)譜法(LC-QQQ-MS),用于分析大鼠血漿和大腦中的阿伐那非。研究者建立、優(yōu)化了液-液提取方法,并用于從血漿和腦勻漿中最大限度地回收阿伐那非。在NuncledurC18柱上進(jìn)行分離,流動(dòng)相由0.10%甲酸和乙腈(29 ∶71,V∶V)組成,流速為0.5 mL/min,采用QqQ-MS應(yīng)用正多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行監(jiān)測(cè),最終得到分離完全的色譜。該方法性能良好,并成功地應(yīng)用于大鼠血漿和腦組織勻漿中阿伐那非及相關(guān)代謝物的定性和定量分析,測(cè)定得到單劑量口服和經(jīng)皮應(yīng)用后其在大鼠血漿和腦組織中的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

HPLC、 LC-MS/MS、 LCMS-IT-TOF和LC-QQQ-MS等方法都能對(duì)阿伐那非與有關(guān)物質(zhì)的含量進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè),并通過(guò)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。在探尋這些分析方法最優(yōu)色譜條件的過(guò)程中,除了傳統(tǒng)的對(duì)照分析實(shí)驗(yàn)外,研究人員還結(jié)合化學(xué)計(jì)量輔助方法,通過(guò)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)程序去揭示流動(dòng)相比、柱溫、流速和pH對(duì)峰面積、對(duì)稱性、分辨率和保留時(shí)間對(duì)阿伐那非與有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)過(guò)程的影響。高效液相與其他技術(shù)聯(lián)用的方法不僅能夠準(zhǔn)確定量阿伐那非和有關(guān)物質(zhì),同時(shí)對(duì)有關(guān)物質(zhì)結(jié)構(gòu)特征和阿伐那非降解原理有了更深入的了解。

本文簡(jiǎn)述了阿伐那非的合成工藝路線,論述近年來(lái)研究人員對(duì)合成路線的改進(jìn),并開發(fā)了針對(duì)阿伐那非及其有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)分析方法。HPLC法與基于QbD的HPLC法,能夠準(zhǔn)確測(cè)出阿伐那非的含量;穩(wěn)定性指示HPLC法,能從雜質(zhì)中清楚觀察到降解物;HPLC-PDA法成功分離出在不同降解條件下的降解物。研究人員開發(fā)了各種高效液相與其他技術(shù)聯(lián)用的分析檢測(cè)方法,通過(guò)LC-TOF-MS法,鑒定阿伐那非的有關(guān)物質(zhì)和降解產(chǎn)物峰;用LC-MS/MS法成功分離阿伐那非在酸、堿性、氧化、光解和熱降解條件下的多種降解物,并解析了降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu);通過(guò)LC-QQQ-MS法,測(cè)定了阿伐那非給藥后的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)等。HPLC與其他技術(shù)的聯(lián)用作為高效的分析方法,將在藥物分析發(fā)展中發(fā)揮更加重要的作用。針對(duì)不同藥物建立高分辨、超微量的分析方法,保證藥品質(zhì)量和用藥安全,促進(jìn)原料藥研發(fā)質(zhì)量水平的提高。