周思旋 張濤 劉暢 唐遠(yuǎn)江 盧昱希 楊粵黔 余波 史開志

摘 要：? 為探索貴州苗藥光枝勾兒茶內(nèi)生真菌類群特征、分布部位及其抑菌活性，該研究采用傳統(tǒng)方法對貴州省貴陽市和黔西市光枝勾兒茶內(nèi)生真菌進(jìn)行分離，并基于分子生物學(xué)及統(tǒng)計學(xué)對其分類地位進(jìn)行鑒定及多樣性評價，最后通過微量肉湯倍比稀釋法篩選具有抑菌活性的菌株。結(jié)果表明：（1）從光枝勾兒茶中分離到191 株內(nèi)生真菌，隸屬于3 個門5 個綱10 個目15 個科19 個屬，優(yōu)勢屬為葉點霉屬（Phyllosticta）、間座殼屬（Diaporthe）、葡萄座腔菌屬（Botryosphaeria）和刺盤孢屬（Colletotrichum）。（2）黔西光枝勾兒茶內(nèi)生真菌香農(nóng)-維納多樣性指數(shù)（H′Q=2.112）較貴陽（H′G=1.801）高，索倫森相似性指數(shù)CsG-Q為0.923，不同組織香農(nóng)-維納多樣性指數(shù)為莖（H′S=2.004）>根（H′R=1.764）>葉（H′L=1.654）>果實（H′F=1.473），莖和葉內(nèi)生真菌的索倫森相似性最高（CsS-L=0.667）。（3）篩選出的21株內(nèi)生真菌對供試菌大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和沙門氏菌（Salmonella enterica）具有抑菌效果，其中Diaporthe sp. QX4G6對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的最小抑菌濃度分別為12.5、6.25、12.5 mg·mL-1，最小殺菌濃度分別為12.5、6.25、12.5 mg·mL-1。以上研究結(jié)果揭示了光枝勾兒茶蘊藏豐富的內(nèi)生真菌資源，不同地區(qū)及組織內(nèi)生真菌類群組成有差異，多個分離菌株具有抗菌活性，為光枝勾兒茶內(nèi)生真菌天然抗菌藥物或藥源研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 光枝勾兒茶， 內(nèi)生真菌， 多樣性， 候選菌株， 抑菌活性

中圖分類號：? Q939

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：? A

文章編號：? 1000-3142（2023）07-1236-08

收稿日期：? 2022-07-20

基金項目：? 國家自然科學(xué)基金（31960716）； 黔農(nóng)科院國基后補助（〔2021〕49號）。

第一作者： 周思旋（1984-），博士，副研究員，主要從事藥用植物微生物資源分類及代謝產(chǎn)物研究，（E-mail）kerrybaiye@163.com。

通信作者：? 史開志，研究員，主要從事獸藥資源開發(fā)與產(chǎn)業(yè)化研究，（E-mail）shkzjjp@163.com。

Diversity and antibacterial activity of endophytic fungi

from Miao medicine Berchemia polyphylla var. leioclada

ZHOU Sixuan1， ZHANG Tao1， LIU Chang2， TANG Yuanjiang1，

LU Yuxi1， YANG Yueqian1， YU Bo1， SHI Kaizhi1*

（ 1. Institute of Animal Husbandry and Veterinary， Guizhou Academy of Agricultural Sciences， Guiyang 550005， China; 2. Research Center for

Application and Development of Medicine and Food Dual-Use Resources， School of Pharmacy，

Guizhou University of Traditional Chinese Medicine， Guiyang? 550025， China ）

Abstract：? To explore the fungal taxa， distribution and antibacterial activity of Berchemia polyphylla var. leioclada， endophytic fungi of B. polyphylla var. leioclada from Guiyang and Qianxi of Guizhou Province were isolated by tissue fragment separation. Based on the methods of molecular biology and statistics， the endophytic fungi were identificated and their diversity were analyzed. The strains with antibacterial activity were screened by microdilution of broth. The results were as follows： （1） A total of? 191 fungal strains were isolated， which were classified into 3 phyla， 5 classes， 10 orders， 15 families and 19 genera. Among all strains， Phyllosticta， Diaporthe， Botryosphaeria and Colletotrichum were the dominant genera. （2） The endophytes fungal? Shannon-Weiner diversity index of Berchemia polyphylla var. leioclada in Qianxi （H′Q=2.112） was higher than that in Guiyang （H′G=1.801）， and the Sorensons similarity coefficient （CsG-Q） was 0.923. The Shannon-Weiner diversity index of different tissues was stem （H′S =2.004）> root（H′R=1.764）> leaf（H′L=1.654）>fruit（H′F=1.473）. The similarity index between stem and leaf was the highest，? which was CsS-L =0.667. （3） 21 endophytic fungi secondary metabolites had inhibitory effects on Escherichia coli， Staphylococcus aureus and Salmonella enterica. The isolate Diaporthe sp. QX4G6 fermentation broth extract have relatively high inhibitory effects， in which the minimum inhibitory concentrations against Escherichia coli， Staphylococcus aureus and Salmonella enterica were 12.5， 6.25 and 12.5 mg·mL-1， and the minimum bactericidal concentrations were 12.5， 6.25 and 12.5 mg·mL-1， respectively. The study reveal rich endophytic fungus resources of Berchemia polyphylla var. leioclada and most of fungi have good antibacterial activity， which lay the foundation for the researchs and development of natural antibacterial drugs or drug sources for endophytic fungi from B. polyphylla var. leioclada.

Key words： Berchemia polyphylla var. leioclada， endophytic fungi， diversity， candidate strains， antibacterial activity

植物內(nèi)生真菌是指生活在植物細(xì)胞中或在其生活史某一時期生活在植物組織內(nèi)，對植物組織沒有引起明顯病害的一類真菌（Petrini， 1991）。幾乎所有植物都含內(nèi)生真菌，分布于植物的根、莖、葉、花、果實等各個部位，種類和數(shù)量繁多，每一種植物都是內(nèi)生真菌潛在的資源寶庫（Zhou & Hyde， 2001）。隨著內(nèi)生真菌研究不斷深入，不同植物的內(nèi)生真菌組成不同，寄主植物的種類、部位、環(huán)境和地理區(qū)域均是決定內(nèi)生真菌種群結(jié)構(gòu)的重要因素，目前從植物中分離出來的內(nèi)生真菌種類繁多，涉及子囊菌、擔(dān)子菌、接合菌、無孢菌等多種類群（譙利軍等，2018；Bhattacharya et al.， 2019；胡永志等，2021）。內(nèi)生真菌與宿主植物長期協(xié)同進(jìn)化，互惠共生，處于一種動態(tài)平衡的拮抗關(guān)系，有助于提高宿主對脅迫環(huán)境的適應(yīng)性和抗性，在植物生長發(fā)育和繁殖中起到了重要作用（隋麗等，2021）。有研究表明，從植物中分離到的內(nèi)生真菌能產(chǎn)生豐富的次級代謝產(chǎn)物，包括生物堿、苯駢吡喃酮、黃酮、酚酸等多種類型化合物，對細(xì)菌、真菌、病毒等具有不同程度的拮抗作用，在藥物研發(fā)、病害防治等方面表現(xiàn)出顯著的經(jīng)濟(jì)價值和應(yīng)用前景，是天然活性物質(zhì)的重要來源（郭順星，2018；Hanani et al.， 2022）。內(nèi)生真菌的存在及其發(fā)揮出來的優(yōu)越性為尋找結(jié)構(gòu)新穎、活性獨特、替代藥用植物的新藥研發(fā)指明了方向。

光枝勾兒茶（Berchemia polyphylla var. leioclada）為鼠李科勾兒茶屬植物，是貴州苗族習(xí)用藥材，味苦、平，含苷類、醌類、木脂素類、萜類以及黃酮類等多種化學(xué)成分，具有抗氧化、抗腫瘤、抗腹瀉、抗炎、鎮(zhèn)痛、抑菌等活性，對治療支氣管炎、痢疾、關(guān)節(jié)炎等具有良好的效果，作為民族藥物，可用于治療人、畜腸炎及消化不良性腹瀉（梁應(yīng)林等，2013；唐遠(yuǎn)江等，2018）。目前已從該屬植物中分離到19個已知化合物和4個蒽醌-苯并異色滿苯醌二聚體，部分化合物顯示了較好的對乙酰膽堿酯酶活性，體現(xiàn)了明顯的研究價值（景永帥等，2011）。然而，光枝勾兒茶生長周期長，產(chǎn)量低，易受環(huán)境地域等因素影響，傳統(tǒng)植物開發(fā)應(yīng)用受到了限制，其內(nèi)生真菌作為植物的共生體和一種潛在的新資源，在寄主植物提供的營養(yǎng)和保護(hù)下，經(jīng)長期共同進(jìn)化，可增強寄主植物的競爭能力和對食草動物、病原體和各種非生物脅迫的抵抗力，這種復(fù)雜多變的生境使內(nèi)生真菌在生物制藥、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和工業(yè)發(fā)酵等方面表現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景，是尋找結(jié)構(gòu)新穎、活性獨特物質(zhì)和替代植物的重要來源（元超等，2021）。同時，內(nèi)生真菌的開發(fā)應(yīng)用可能實現(xiàn)大規(guī)模、低成本和無污染的工業(yè)化生產(chǎn)，為解決藥用植物資源和環(huán)境保護(hù)提供了新途徑。本研究基于光枝勾兒茶的藥用價值及植物應(yīng)用瓶頸，解析其內(nèi)生真菌組成情況，設(shè)想能夠通過篩選植物內(nèi)生真菌抑菌活性，得到具有與植物產(chǎn)生功能相同或相似的次級代謝產(chǎn)物的微生物資源，從而部分替代植物來源生產(chǎn)臨床天然藥物。以貴州貴陽、黔西多年生光枝勾兒茶為研究對象，系統(tǒng)分離并鑒定根、莖、葉和果實等多個部位的內(nèi)生真菌，在獲得可培養(yǎng)真菌資源的基礎(chǔ)上，采用分子生物學(xué)鑒定真菌類群，并通過統(tǒng)計學(xué)方法對其進(jìn)行多樣性評價分析，以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌為指示菌，篩選具有抑制革蘭氏陰性、陽性兩類細(xì)菌活性的內(nèi)生真菌類群，為研發(fā)新型天然抑菌藥物提供候選菌株，也為光枝勾兒茶進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

分別采集貴州省貴陽市龍洞堡（106°47′26″ E，26°31′49″ N，海拔1 100 m），黔西市（105°49′04″ E，27°04′00″ N，海拔1 330 m）健康光枝勾兒茶樣本11 株，其中貴陽6 株、黔西5 株，將采集的光枝勾兒茶植株放入采樣袋帶回實驗室，24 h內(nèi)進(jìn)行內(nèi)生真菌分離培養(yǎng)。植株經(jīng)中山大學(xué)植物學(xué)廖文波教授鑒定為鼠李科植物光枝勾兒茶（Berchemia polyphylla var. leioclada）。

1.2 測試菌株

大腸桿菌（Escherichia coli ATCC 25922）標(biāo)準(zhǔn)株、沙門氏菌（Salmonella enterica ATCC 13076）標(biāo)準(zhǔn)株、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC 6538）標(biāo)準(zhǔn)株購自中國微生物菌種保藏中心。

1.3 內(nèi)生真菌的分離純化

將采集到的光枝勾兒茶樣本沖洗干凈并自然晾干，用無菌去離子水反復(fù)沖洗，無菌濾紙吸干水分，置于0.1%吐溫80溶液中浸泡活化3～5 min，無菌水沖洗，無菌濾紙將水分吸干后于75%乙醇中浸泡3 min，無菌水沖洗，用無菌濾紙吸干表面水分。采用70%乙醇+3% H2O2混合液消毒，無菌水沖洗3 次，無菌濾紙吸干，將葉、根、莖和果實剪成小組織塊（0.5 cm × 0.5 cm），接種于含氯霉素（終濃度為20 μg·mL-1）的PDA平板內(nèi)，28 ℃恒溫培養(yǎng)。為驗證表面消毒是否有效，將表面消毒組織接種于含氯霉素PDA培養(yǎng)基上印記，同等條件下恒溫培養(yǎng)，印記部位未見真菌生長則確認(rèn)消毒徹底（Sanchez-Marouez et al.， 2007）。隨時觀察，組織塊邊緣有菌絲長出時，采用針尖端菌絲挑取法，將菌絲轉(zhuǎn)接于新的PDA平板，直至純化獲得形態(tài)均一菌落進(jìn)行鑒定及保存。分離過程中詳細(xì)記錄組織塊及分離菌株數(shù)量。

1.4 內(nèi)生真菌的鑒定

純化后的菌株參照《真菌學(xué)鑒定手冊》（魏景超，1979），從形態(tài)學(xué)上初步判定菌株分類學(xué)地位。采用引物ITS1/ITS4（White et al.，1990）對ITS基因序列進(jìn)行擴(kuò)增及測序。測序成功的ITS序列通過BioEdit分析軟件校對、拼接、剪切，將剪切后的序列逐一通過GenBank數(shù)據(jù)庫的Blast進(jìn)行在線比對鑒定（Zhou et al.， 2013），根據(jù)序列的相似度和覆蓋率，結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)特征確定各分離菌株歸屬，并根據(jù)MycoBank（http：//www.mycobank.org/ quicksearch.aspx）官網(wǎng)查詢確認(rèn)最新的內(nèi)生真菌分類地位。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及多樣性分析

通過數(shù)據(jù)統(tǒng)計，根據(jù)多樣性評價指標(biāo)，采用分離率（isolation rate， IR）、分離頻率（isolation frequency， IF）、卡馬戈指數(shù)（Camargos index）、香農(nóng)-維納多樣性指數(shù)（Shannon-Weiner diversity index， H′）、辛普森指數(shù)（Simpsons index， D）及索倫森相似性指數(shù)（Sorensons similarity coefficient， Cs）分析光枝勾兒茶植物內(nèi)生真菌的多樣性。

1.6 內(nèi)生真菌體外抗菌活性篩選

1.6.1 菌株的選擇及發(fā)酵產(chǎn)物制備 根據(jù)鑒定結(jié)果，選擇分布于不同屬的23株分離菌，分別為QX4G6、QX3Y2-5、QX5Y4-3、QX3J3-3、QX1Y1-1、QX3Y3-1、QX3J3-5、QX1G1-3、QX5G2-1、QX3J4-1、G2S12、G2S20、G2L17、D2S31、G3F4、D2S10、D2S25、D2S24、D3F3、G2S1、G2S11、D1S16和G3L5，采用PDA活化，待菌絲長滿平板后，切成小塊，接種于PDB培養(yǎng)基，于28 ℃，120 r·min-1振蕩培養(yǎng)7 d后，靜置培養(yǎng)30 d，發(fā)酵培養(yǎng)物用等體積乙酸乙酯萃取3 次，合并萃取液，經(jīng)旋蒸、干燥后，加入MH培養(yǎng)基稀釋至濃度為200 mg·mL-1的母液備用。

1.6.2 菌液制備 將大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌接種于MH固體培養(yǎng)基上劃線活化，置于37 ℃培養(yǎng)18 h，挑取單個菌落于含MH液體培養(yǎng)基的試管中，置于37 ℃、120 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)12 h。用MH液體培養(yǎng)基調(diào)整菌液OD600為0.8后稀釋1 000 倍，使菌液濃度為105～106 CFU·mL-1，備用。

1.6.3 最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration， MIC）的測定 參考Balouiri等（2016）的方法，采用微量肉湯二倍稀釋法，于無菌96 孔板每孔中各加入100 μL肉湯培養(yǎng)基，分別向第1 孔中加入100 μL配備好的藥液，混勻后依次倍比稀釋，直到第9 孔混勻后棄去100 μL混合液。每孔加入上述配備好的100 μL細(xì)菌溶液。每板設(shè)置無藥和空白對照組，觀察細(xì)菌生長情況，37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h后取出，每個濃度做3 次重復(fù)。

采用TTC（2，3，5－氯化三苯基四氮唑）法判定MIC結(jié)果。向上述培養(yǎng)18 h后的96 孔板每孔分別加入20 μL 0.5%的TTC，37 ℃避光培養(yǎng)1 h，觀察菌液變化情況。試驗樣本溶液澄清、顏色未發(fā)生變化的最后1 孔藥物濃度為該藥的MIC。

1.6.4 最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration， MBC）的測定 將1.6.3試驗組澄清的各孔中液體取100 μL涂布于MH固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)18～24 h觀察結(jié)果。肉眼觀察無菌落生長的最低藥物濃度為其MBC。

2 結(jié)果與分析

2.1 光枝勾兒茶內(nèi)生真菌組成

從貴陽及黔西光枝勾兒茶不同組織部位780個組織塊中分離得到191 株內(nèi)生真菌，分離率為24.49%（191/780），其中貴陽分離率為24.30%（132/465），黔西為24.76%（93/315）。PCR產(chǎn)物序列經(jīng)校對、拼接、剪切后，結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)對分離得到的內(nèi)生真菌進(jìn)行鑒定（表1）。結(jié)果顯示，分離菌株隸屬于3 個門5 個綱10 個目15 個科19 個屬。在貴陽和黔西分別分離得到11個、14 個屬的菌株。其中，僅貴陽分離得到菌株隸屬于5 個屬，分別為煙管菌屬（Bjerkandera）、假囊酵母屬（Eremothecium）、毛色二孢屬（Lasiodiplodia）、歪嘴座殼屬（Pleurostoma）和匍柄霉屬（Stemphylium）；僅黔西分離得到8 個屬，分別為環(huán)紋碳團(tuán)菌屬（Annulohypoxylon）、鐮刀菌屬（Fusarium）、微結(jié)節(jié)霉屬（Microdochium）、毛霉屬（Mucor）、新擬盤多毛孢屬（Neopestalotiopsis）、擬盾殼霉屬（Paraconiothyrium）、擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsis）和木霉屬（Trichoderma）；貴陽和黔西共有屬6 個，分別為鏈格孢屬（Alternaria）、葡萄座腔菌屬（Botryosphaeria）、刺盤孢屬（Colletotrichum）、間座殼屬（Diaporthe）、新殼梭孢屬（Neofusicoccum）、葉點霉屬（Phyllosticta）。其多樣性分析結(jié)果表明，貴陽和黔西香農(nóng)-維納多樣性指數(shù)結(jié)果為黔西（H′Q=2.112）>貴陽（H′G=1.801），辛普森指數(shù)結(jié)果為黔西（DQ=0.840）>貴陽（DG=0.774），索倫森相似性指數(shù)CsG-Q=0.923。

2.2 光枝勾兒茶內(nèi)生真菌優(yōu)勢屬的分離頻率 （IF）和分離率（IR）

試驗分離所得菌株優(yōu)勢屬依次為葉點霉屬、間座殼屬、葡萄座腔菌屬和刺盤孢屬，分離率（IR）分別為5.90%（46/780）、4.87%（38/780）、4.10%（32/780）和3.59%（28/780），分離頻率（IF）分別為24.08%（46/191）、19.89%（38/191）、16.75%（32/191）和14.66%（28/191）。從貴陽分離得到的優(yōu)勢屬葉點霉屬IR和IF最高，分別為9.46%（44/465）和39.94%（44/113），其次為間座殼屬，IR和IF分別為4.52%（21/465）和18.58%（21/113），葡萄座腔菌屬IR和IF分別為4.09%（19/465）和16.81%（19/113）。從黔西分離得到的優(yōu)勢屬為刺盤孢屬，IR和IF最高，分別為6.35%（20/315）和25.64%（20/78），其次為間座殼屬，IR和IF分別為5.40%（17/315）和21.79%（17/78），葡萄座腔菌屬的IR和IF分別為4.13%（13/315）和16.67%（13/78）。

2.3 不同組織部位內(nèi)生真菌多樣性分析

從光枝勾兒茶不同組織分離內(nèi)生真菌分析結(jié)果表明（表2），根、莖、葉和果實分離菌分別分布于9個、13個、11個、6個屬，4個組織均分離到共有屬葡萄座腔菌屬、刺盤孢屬和間座殼屬。新殼梭孢屬為根、莖、葉共有屬，鏈格孢屬和歪嘴座殼屬為莖、葉、果實共有屬，毛色二孢屬和葉點霉屬為莖和葉共有屬，鐮刀菌屬、新擬盤多毛孢屬和擬盤多毛孢屬為根和莖共有屬。僅從根中分離得到2 個屬，分別為毛霉屬和木霉屬；僅從莖中分離到2 個屬，包括匍柄霉屬和微結(jié)節(jié)霉屬；僅從葉中分離到3 個屬，包括擬盾殼霉屬、環(huán)紋碳團(tuán)菌屬和煙管菌屬；僅從果實中分離到1個屬為假囊酵母屬。

光枝勾兒茶不同組織香農(nóng)-維納多樣性指數(shù)結(jié)果分析表明，莖（H′S=2.004）>根（H′R=1.764）>葉（H′L=1.654）>果實（H′F=1.473），辛普森指數(shù)結(jié)果為莖（DS=0.826）>果實（DF=0.813）>根（DR=0.765）>葉（DL=0.721）。莖和葉所得內(nèi)生真菌的相似性最高，CsS-L=0.667，其次為根和莖，CsR-S=0.636，相似性最低的為根和果實，CsR-F=0.267（表3）。

2.4 內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物抑菌活性篩選

選擇的23 株菌株次級代謝產(chǎn)物抑菌活性測定結(jié)果表明，其中20 株內(nèi)生真菌液體發(fā)酵提取物對3 株細(xì)菌均表現(xiàn)出一定的抑菌作用，MIC介于6.25～100 mg·mL-1之間，1株內(nèi)生真菌QX3J4-1僅對大腸桿菌有抑菌作用，2 株菌株液體發(fā)酵提取物對供試菌株未見明顯抑菌效果。菌株QX4G6、G3F4和D2G24對大腸桿菌抑菌效果較好，MIC均為12.5 mg·mL-1；QX4G6、G2S12和G3F4對金黃色葡萄球菌抑菌效果較好，MIC均為6.25 mg·mL-1；菌株QX4G6、QX1Y1-1、G3F4、D2G24和G2S1對沙門氏菌抑菌效果較好，MIC均為12.5 mg·mL-1（表4）。

20株內(nèi)生真菌液體發(fā)酵提取物對3 株供試細(xì)菌的MBC介于6.25～100 mg·mL-1之間，1 株內(nèi)生真菌QX3J4-1僅對大腸桿菌有殺菌作用，2 株菌株液體發(fā)酵提取物對大腸桿菌、 金黃色葡萄球菌及沙門氏菌無殺菌作用。其中，菌株QX4G6對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌殺菌效果最好，MBC分別為12.5、6.25、12.5 mg·mL-1，其余菌株液體發(fā)酵提取物MBC大于或等于25 mg·mL-1（表4）。

3 討論與結(jié)論

目前內(nèi)生真菌以組織塊分離法為主，一方面獲得可培養(yǎng)內(nèi)生真菌類群，另一方面為后續(xù)內(nèi)生真菌的開發(fā)利用提供資源。本研究以生境不同的貴州貴陽和黔西光枝勾兒茶為研究對象，從780 個植物組織塊中共分離到191 株可培養(yǎng)內(nèi)生真菌，其中子囊菌為190 株，占絕對優(yōu)勢，僅鑒定到1 株擔(dān)子菌。目前報道的植物內(nèi)生真菌類群文獻(xiàn)，大多以子囊菌為主，這可能與植物內(nèi)部環(huán)境有關(guān)，也可能是受分離方法或者物種差異所限（Gaur et al.， 2021）。屬水平上，葡萄座腔菌屬、刺盤孢屬、間座殼屬和葉點霉屬為光枝勾兒茶的優(yōu)勢屬，主要分布在葉和莖中。本次分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)貴陽和黔西分離到的菌株類群具有一定的相似性和差異性，莖和葉所得內(nèi)生真菌的相似性最高，不同組織間菌株類群存在差異，莖中內(nèi)生真菌群落香農(nóng)-維納多樣性指數(shù)最高，果實中最低，表明內(nèi)生真菌在植物中表現(xiàn)出一定的組織特異性和偏好性。宋靜靜等（2022）從廣西夾竹桃中分離的內(nèi)生真菌中，刺盤孢屬和球座菌為優(yōu)勢屬，主要分布于莖和葉，與本次研究對象內(nèi)生真菌分布相同。呂佳等（2022）研究發(fā)現(xiàn)廣東肉桂葉、枝、根和皮中均有內(nèi)生真菌分布，葉的香農(nóng)-維納多樣性指數(shù)最高。貴州馬尾松的根部內(nèi)生真菌多樣性最高，其次是莖，最后是葉，莖與根內(nèi)生真菌相似性最高（羅鑫和于存，2021）。以上結(jié)果表明，本次采集樣本地貴陽和黔西，兩地海拔、光照、氣溫及降雨不同，其內(nèi)生真菌的組成可能受到地域的影響；同一植物不同組織也可能受光照、溫度、濕度等影響因素，致使其內(nèi)生真菌產(chǎn)生組織分布差異。因此，在進(jìn)行植物內(nèi)生真菌的研究中，應(yīng)盡量多地域、多部位進(jìn)行菌株分離，以更全面地體現(xiàn)植物內(nèi)生真菌的分布及多樣性。此次研究結(jié)果首次分離得到貴州光枝勾兒茶內(nèi)生真菌可培養(yǎng)菌株，揭示了貴州光枝勾兒茶內(nèi)生真菌類型及分布特性，為進(jìn)一步探究內(nèi)生真菌物種次級代謝產(chǎn)物活性方面提供了素材，同時也為下一步植物與內(nèi)生真菌之間相互影響的研究奠定了基礎(chǔ)。

研究通過測試23 株不同類群內(nèi)生真菌對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的抑制活性，篩選到21 株菌株具有不同程度的抑菌活性的內(nèi)生真菌菌株，對3 種測試菌均有抑菌活性的有20 株，分別分布于間座殼屬、葉點霉屬、鐮刀菌屬、刺盤孢屬及煙管菌屬等多個類群，此結(jié)果表明光枝勾兒茶內(nèi)生真菌在醫(yī)藥開發(fā)方面存在較大的潛在研究及應(yīng)用價值。從黔西光枝勾兒茶的根部中分離到的間座殼屬菌株Diaporthe sp. QX4G6提取物抑菌效果最好，據(jù)文獻(xiàn)報道，間座殼屬是活性代謝產(chǎn)物較為豐富的真菌類群，廣泛分布于世界各地和多種植物中，目前已從該屬內(nèi)生真菌中分離出了200 多個化合物，包括聚酮類、生物堿類、萜類、蒽醌類、羥基化不飽和脂肪酸等，其中部分化合物顯示出抗菌、抗腫瘤、抗高血脂癥、抗寄生蟲、抗氧化及保護(hù)植物等生物活性（蔡佳等，2021）。Li等（2015）從Diaporthe sp. LG23 代謝產(chǎn)物中分離得到1 個新羊毛脂甾烷型四環(huán)三萜化合物19-nor-lanosta-5，對革蘭氏陰性、陽性細(xì)菌均表現(xiàn)出明顯的抗菌作用，Nishad等（2021）從內(nèi)生真菌Diaporthe longicolla粗提物中分離得到2，4-di-tert-butyl phenol單體化合物，對金黃色葡萄球菌抑菌活性明顯?；谏鲜鲅芯炕A(chǔ)及應(yīng)用前景，間座殼屬真菌類群獨特的次級代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力成為了活性化合物的重要潛在來源之一，作為候選菌株獲得活性物質(zhì)是未來一大研究方向（Nagarajan et al.， 2021）。本研究結(jié)果分離菌株雖表現(xiàn)出廣譜的抑菌活性， 但MIC和MBC值不夠理想， 推測分析可能因為多個物質(zhì)之間的作用對結(jié)果產(chǎn)生了一定的干擾。為進(jìn)一步追蹤活性物質(zhì)來源，下一步研究將Diaporthe sp. QX4G6做為目標(biāo)菌株進(jìn)行大量發(fā)酵，通過化學(xué)手段進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，測定評價每個單體物質(zhì)的抑菌活性，以篩選獲得具有顯著抑菌活性的單一化合物，為藥物先導(dǎo)分子的挖掘提供備選藥源，具有重要的科學(xué)意義和潛在的應(yīng)用價值。

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（責(zé)任編輯 周翠鳴）