李齊齊，江 銘，邱 玲，胡 偉，胡克甦

（1 南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 226001；2 南通大學(xué)附屬醫(yī)院燒傷整形科）

根據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì),全球每年燒傷患者約1 100 萬人,其中重度燒傷導(dǎo)致死亡約30 萬人[1]。大面積燒傷引起的休克、敗血癥、全身多器官功能衰竭等嚴(yán)重并發(fā)癥是造成燒傷患者死亡的主要原因。嚴(yán)重?zé)齻麜r(shí),一方面肝臟產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡,另一方面由于燒傷創(chuàng)面感染發(fā)生膿毒血癥,從而引發(fā)多臟器功能衰竭。肝臟一旦遭受實(shí)質(zhì)性損害,不僅影響物質(zhì)代謝、解毒、蛋白質(zhì)合成等功能,而且影響抗生素效果。因此,保護(hù)肝臟是救治嚴(yán)重?zé)齻颊叩闹匾h(huán)節(jié)。鐵死亡（Ferroptosis）是近年發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞死亡方式,在炎癥中具有重要作用,幾種具有鐵死亡抑制作用的抗氧化劑表現(xiàn)出抗炎作用[2]。

青蒿素（Artemisinin,ART）是青蒿的主要有效成分,殺死瘧原蟲的主要機(jī)制涉及抑制Fe2+介導(dǎo)的自由基產(chǎn)生,增強(qiáng)對瘧原蟲DNA 損傷、線粒體去極化和細(xì)胞死亡作用,還涉及干擾肌漿/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣ATP 酶及線粒體電子傳遞鏈、影響免疫系統(tǒng)功能以及抑制血管生成[3]。此外,ART 在炎癥、免疫調(diào)節(jié)、血管生成和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中發(fā)揮作用,其抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用已應(yīng)用于肝臟疾病相關(guān)領(lǐng)域。

1 青蒿素通過AMPK/NF-κB/NLRP3 通路抑制炎癥反應(yīng)

腺苷50-磷酸-活化蛋白激酶（adenosine-5’-monophosphate-activated protein kinase,AMPK）是一種十分保守的調(diào)節(jié)劑,主要負(fù)責(zé)感知營養(yǎng)和控制能量平衡[4],參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[5]。B 細(xì)胞中核因子κ-B（nuclear factor κB,NF-κB）是Rel 家族重要的轉(zhuǎn)錄因子,廣泛分布于各種細(xì)胞中[6],參與細(xì)胞增殖、炎癥及獲得性免疫等多種重要生命活動(dòng)。NF-κB 轉(zhuǎn)錄因子形成多種同源或異源二聚體:NF-κB1（p50）、NFκB2（p52）、RelA（p65）、RelB 和c-Rel。NF-κB1 在機(jī)體非激活狀態(tài)下與RelA 發(fā)生相互作用,而在機(jī)體激活狀態(tài)下,p50 在胞漿內(nèi)處于靜息狀態(tài)[7]。在經(jīng)典NF-κB1 信號通路刺激下,抑制性IκB α 蛋白被26S蛋白酶體磷酸化和降解,從而釋放活性轉(zhuǎn)錄因子異二聚體p50-RelA,進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。NF-κB 在感染引起的炎性反應(yīng)中被激活,在炎癥因子活化的情況下,AMPK 對NF-κB 具有明顯的抑制作用,并且NF-κB 信號通路與促炎細(xì)胞因子異常釋放密切相關(guān)[7]。通過轉(zhuǎn)錄一些細(xì)胞因子來介導(dǎo)免疫應(yīng)答反應(yīng),清除入侵病原菌。嚴(yán)重?zé)齻驨F-κB 活化導(dǎo)致IL-6、TNF-α 和IL-1β 等炎性因子分泌。

在過度炎癥狀態(tài)下,多種免疫細(xì)胞受到病原菌相關(guān)分子（pathogen-associated molecular pattern,PAMPs）和損傷相關(guān)分子（damage associated molecular patterns,DAMPs）的活化,釋放大量促炎因子[8]。NLRP3 炎性小體作為固有免疫的重要組分,通過識別PAMPs 引發(fā)炎性反應(yīng)。NLRP3 炎性小體可感知外源性和內(nèi)源性各種危險(xiǎn)信號,在靜息狀態(tài)下各類炎癥因子表達(dá)量水平極低,無法裝配或激活NLRP3 炎性小體。在被激活后NLRP3 炎性小體招募并激活procaspase 1,進(jìn)而將IL-1β 的前體裂解激活[9]。研究顯示,NLRP3 水平隨著人類燒傷嚴(yán)重程度的增加而增加,NF-κB 信號通路活化對NLRP3 炎性小體的激活是必要的[9]。

有研究顯示,青蒿素干預(yù)可有效抑制NLRP3 炎性小體相關(guān)蛋白表達(dá),促進(jìn)AMPK 磷酸化,抑制NF-κB 和NLRP3 炎性小體的活化,從而導(dǎo)致下游炎癥細(xì)胞因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）分泌減少[10]。青蒿素可以上調(diào)AMPK 表達(dá),也可下調(diào)NF-κB p65 的活性,通過影響AMPK/NF-κB/NLRP3 炎性小體相關(guān)信號通路而發(fā)揮抗炎作用[11]。

2 青蒿素通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激保護(hù)肝臟

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為膜狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),發(fā)揮整合細(xì)胞信號和平衡內(nèi)環(huán)境作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress,ERS）是指內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中異常折疊蛋白聚集,引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡、去折疊蛋白反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過載等一系列反應(yīng)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激通路,在脂質(zhì)蓄積、胰島素抵抗、炎癥及隨后肝細(xì)胞死亡中發(fā)揮重要的病理生理作用。肝臟蛋白合成和糖脂平衡的維持中具有重要作用,特別容易受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響[12]。長期內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激超出細(xì)胞的代償能力,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

YU 等[13]研究表明,青蒿素可抑制IL-6 釋放,雙氫青蒿素可顯著抑制小鼠RAW264.7 巨噬細(xì)胞IL-6、TNF-α 和一氧化氮釋放,并具有良好的劑量依賴性。雙氫青蒿素通過下調(diào)一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）表達(dá),抑制巨噬細(xì)胞炎性因子及一氧化氮分泌而發(fā)揮作用[14]。此外,青蒿素可抑制缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α）的激活。炎癥刺激發(fā)生在細(xì)胞感染過程的早期,與細(xì)胞氧化還原、MAPK 信號激活和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的變化有關(guān)[15]。炎癥激活與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激密切相關(guān)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的失調(diào)會引起未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response,UPR）,持續(xù)UPR 是肝臟炎癥發(fā)生和發(fā)展的重要原因。在感染早期NF-κB 的激活與MAPK 信號和UPR 誘導(dǎo)劑IRE-1α 的表達(dá)增加相關(guān)[16]。UPR、MAPKs 及NF-κB 蛋白相互作用,但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。青蒿素不僅在減輕炎癥方面具有優(yōu)勢,還可能通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激作用保護(hù)肝臟。

3 青蒿素通過調(diào)節(jié)鐵死亡相關(guān)信號通路減輕肝纖維化

鐵死亡是由鐵超載、脂質(zhì)過氧化及細(xì)胞膜破壞等多種因素引起的細(xì)胞程序性壞死。鐵是機(jī)體必需元素,但鐵過載會導(dǎo)致細(xì)胞鐵死亡。理論上,通過干預(yù)鐵代謝任何環(huán)節(jié)（吸收、儲存、利用和流出）增加細(xì)胞內(nèi)鐵濃度可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。研究發(fā)現(xiàn)越來越多生理和病理生理過程涉及細(xì)胞鐵死亡及免疫反應(yīng)失調(diào),藥物或環(huán)境應(yīng)激（如缺血再灌注損傷、晝夜節(jié)律鐘紊亂）引起的組織損傷均可引發(fā)細(xì)胞鐵死亡[3]。失調(diào)的細(xì)胞死亡機(jī)制以及異常的宿主反應(yīng)是多種病理過程的特征,包括癌癥和炎癥相關(guān)疾病。過量的鐵積累和谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4,GPX4）的抑制是觸發(fā)鐵死亡的兩個(gè)關(guān)鍵初始信號。晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（advanced glycosylation end product specific receptor,AGER）是免疫球蛋白超家族成員,可通過與多種損傷相關(guān)分子模式（danger associated molecular patterns,DAMPs）（如HMGB1、S100 等）結(jié)合激活多種信號途徑,如蛋白激酶C、JAK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子、轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）途徑酪氨酸磷酸化、MAPK/NF-κB 等[17]。AGER 信號與急性或慢性炎性疾病有關(guān),如膿毒癥、胰腺炎和糖尿病。AGER 中和抗體或小發(fā)夾RNA（shRNA）研究證明AGER 在介導(dǎo)嗜鐵細(xì)胞啟動(dòng)的炎癥和免疫反應(yīng)中的關(guān)鍵作用[3]。DAMPs 是一類類似于感染性細(xì)菌蛋白,通過與模式識別受體（pattern recognition receptor,PRRs）作用,活化下游轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB、IRF 等,從而誘導(dǎo)多種免疫反應(yīng)[3]。細(xì)胞凋亡與鐵死亡是免疫原性的,隨著受影響的細(xì)胞釋放DAMPs 和報(bào)警蛋白,機(jī)體將產(chǎn)生一系列免疫原性相互作用,最終會放大細(xì)胞死亡并促進(jìn)一系列與炎癥相關(guān)的反應(yīng)[3]。

最新研究報(bào)道細(xì)胞鐵死亡可能在肝纖維化中發(fā)揮重要作用。CARLSON 等[18]研究闡明鐵死亡調(diào)節(jié)因子GPX4 對肝細(xì)胞存活和正常肝功能的重要性。肝臟調(diào)節(jié)代謝的能力由轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)控制,關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子包括孤兒核受體成員,其中最重要的是過氧化物酶體增殖物激活受體α（recombinant peroxisome proliferator activated receptor alpha,PPARα）、法尼類X 受體（Farnesoid X receptor,FXR）和肝X 受體（liver X receptor,LXR）[19]。這些受體都參與脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的基因轉(zhuǎn)錄,從而調(diào)節(jié)肝臟和全身的能量代謝。雙氫青蒿素（dihydroartemisinin,DHA）通過FXR 激活依賴機(jī)制限制肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells,HSC）接觸,從而減輕肝纖維化[20]。DU 等[21]闡明信號分子（Hedgehog,Hh）和轉(zhuǎn)錄共激活因子相關(guān)蛋白（tran scription coactivator related protein,YAP）抑制劑降低HSC 活性,并抑制組織器官尤其肝臟中的成肌纖維細(xì)胞活性。YANG 等[22]證實(shí),血紅素加氧酶1（heme oxygenase,HO1）通過調(diào)節(jié)NF-κB 通路促進(jìn)HSC 凋亡,保護(hù)肝臟免受纖維化。青蒿琥酯是一種可溶于水的青蒿素類化合物,具有抗炎、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性,是潛在的鐵死亡誘導(dǎo)劑。OOKO 等[23]已證明,青蒿素類化合物能引起腫瘤細(xì)胞鐵死亡。LIN 等[24]研究表明,青蒿素類化合物可特異性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[3],阻斷Nrf2-ARE 信號通路可增強(qiáng)耐藥細(xì)胞對鐵死亡的易感性。青蒿琥酯通過調(diào)節(jié)鐵垂病信號通路來減輕肝纖維化。

青蒿琥酯與鐵死亡標(biāo)志分子GPX4、前列腺素過氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2,Ptgs2）、纖維化標(biāo)志物α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（alpha sarco meric actin,α-SMA）共定位,機(jī)體釋放大量Fe2+,脂質(zhì)過氧化,致使機(jī)體抗氧化能力降低。去鐵胺（deferoxamine,DFO）可以逆轉(zhuǎn)青蒿琥酯對肝臟的抗纖維化作用[20]。青蒿琥酯誘導(dǎo)的活化肝星狀細(xì)胞核變性是其抗纖維化作用所必需的。青蒿琥酯可激活HSC 鐵轉(zhuǎn)運(yùn),此作用與激活鐵蛋白的吞噬有關(guān)。

綜上所述,大面積燒傷患者會反復(fù)出現(xiàn)急性和長期肝功能異常。大量研究顯示,青蒿素及其衍生物具有抑制炎癥反應(yīng)、保護(hù)肝臟及減輕肝纖維化等作用,有望成為燒傷臨床可供選擇的藥物,有利于改善燒傷患者的長期預(yù)后。