牛大力活性成分提取工藝研究進(jìn)展

石敏 孫欽菊 劉祁云 黃林華

牛大力為豆科崖豆藤屬植物美麗崖豆藤的干燥根，俗稱山蓮藕、九龍串珠、大力薯，主要生長于山坡草叢中，分布在我國海南、廣西、廣東、湖南、貴州等地。作為藥食同源作物，牛大力性味屬甘、平，歸肺、腎經(jīng)，有“南方高麗參”之稱，主要以根部入食、入藥?！渡菟幮詡渌帯分杏涊d，牛大力具有解熱毒、治療淤血跌打傷、壯筋骨、滋補(bǔ)養(yǎng)腎等功效?！蛾懘ū静荨分杏涊d，牛大力味平、甘，補(bǔ)益肝腎、清熱解毒，能潤肺、強(qiáng)筋健骨、健脾益氣等。自20世紀(jì)70年代起，牛大力被加工成壯腰健腎丸、桂龍藥膏、活絡(luò)止痛丸、強(qiáng)力健身膠囊、強(qiáng)力追風(fēng)透骨丸、舒筋健腰丸、益智康腦丸、抗風(fēng)濕液等中成藥，在全國范圍內(nèi)銷售。民間也常用牛大力煲湯、泡酒、泡水，具有一定的滋養(yǎng)與保健功效。如今，牛大力已從野生走向人工種植、從中藥生產(chǎn)原料走向農(nóng)副產(chǎn)品，牛大力也已發(fā)展成我國兩廣地區(qū)的一個重要產(chǎn)業(yè)，種植區(qū)域及面積逐年擴(kuò)大。

現(xiàn)代分析化學(xué)研究表明，牛大力的根、莖、葉、花等各部分均含有生物活性成分，尤其是根的活性成分極為豐富，因此近年來牛大力活性成分提取研究及開發(fā)利用成為了行業(yè)熱點(diǎn)。本文對牛大力活性成分的提取工藝進(jìn)行了全面的介紹，分別對牛大力中多糖、黃酮類、酚類、皂苷類化合物的提取方法進(jìn)行了概述總結(jié)，并對各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)及影響因素進(jìn)行了分析，以期為牛大力活性成分的有效提取提供科學(xué)參考。

一、活性成分

牛大力的藥用價值與其富含的活性成分種類及其含量密切相關(guān)。牛大力含有多糖、黃酮、酚酸、甾醇等多種活性成分及Ca、Fe、Zn、Mg、Se和Mn等多種微量元素，因此牛大力具有增強(qiáng)抵抗力、潤肺止咳、調(diào)節(jié)免疫力、治療心血管疾病、提高膽固醇代謝、抗腫瘤、抗氧化和抗菌等功效。其中，牛大力中的多糖由鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、葡萄糖和甘露糖等構(gòu)成；黃酮類化合物主要為芒柄花素、高麗槐素、異甘草素、槲皮素等；甾醇物質(zhì)以豆甾醇和β-谷甾醇為主；酚酸類化合物有香草酸、丁香酸等。

二、提取工藝

1.多糖的提取工藝。蔡紅兵等采用超聲法提取牛大力中的多糖，并用硫酸-苯酚法測定其含量。經(jīng)正交試驗(yàn)法研究得到牛大力多糖最佳提取工藝為料液比1：12、超聲時間20min，在此工藝條件下的多糖得率為98.4%。此研究發(fā)現(xiàn)，超聲提取法中影響多糖提取量的順序依次為超聲時間、加水量和牛大力粒度。陳勇等選用回流提取法，通過星點(diǎn)設(shè)計-效應(yīng)面法對牛大力多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，在回流提取溫度89.3℃、料液比1：32（g/mL）、提取時間106min等最佳條件下，得到的牛大力多糖提取量為558.5mg/g。該研究發(fā)現(xiàn)，回流提取法中提取溫度、提取時間和料液比等因素對牛大力中多糖提取均有影響。溫劍文等研究了閃式提取法提取牛大力多糖的生產(chǎn)工藝，最佳提取工藝為溫度25℃、料液比1：30（g/mL）、電機(jī)頻率40Hz、提取時間8min，在此工藝條件下的多糖提取量為31.3mg/g。李薇等利用微波果膠酶法，從牛大力薯中提取得到0.63%多糖，其中，果膠酶用量為2.2%、酶解溫度為55℃、酶解時間為2h、微波時間為70s。蔣德旗等采用纖維素酶酶解法提取牛大力多糖，在酶解時間76min、液料比14：1（mL/g）、酶解pH5.4、酶添加量9.5mg/mL、酶解溫度45℃的工藝條件下，牛大力多糖得率為（4.43±0.67）%。蘇芬麗等采用加熱回流提取法，按料液比1：20（g/mL）、提取溫度100℃、提取時間1h、提取次數(shù)2次、醇沉濃度80%、醇沉?xí)r間5h的水提醇沉法工藝條件，提取牛大力多糖。

綜上所述，牛大力多糖的常見提取方法主要有超聲提取法、加熱回流法和酶解法等。其中，超聲提取法不僅操作簡便、時間短、成本低，還可獲得較高的提取率；加熱回流法提取較為完全，但耗時較長；酶解法需要嚴(yán)格控制酶解條件；閃式提取法具有快速、高效、節(jié)能的特點(diǎn)；超聲輔助-水提醇沉法操作簡單快捷、穩(wěn)定性和重復(fù)性均良好，可用于規(guī)?；崛∨４罅χ械亩嗵?。

2.黃酮類的提取工藝。（1）總黃酮。王呈文等采用超聲波輔助法提取牛大力中的總黃酮，經(jīng)正交試驗(yàn)優(yōu)化得到最佳條件，即乙醇濃度75%、料液比1：25（g/mL）、提取溫度60℃、提取時間60min，此條件下的總黃酮提取量為2.14mg/g。此研究發(fā)現(xiàn)，多糖提取得率的影響因素主次順序?yàn)榱弦罕取⑻崛囟?、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間。譚志燦等在此基礎(chǔ)上，通過Box-Behnken效應(yīng)面法對超聲波輔助提取法再次進(jìn)行了優(yōu)化，得到的最佳工藝為乙醇濃度81.07%、乙醇體積21.63倍、超聲提取2次（52.51min/次）、提取溫度60℃。效應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙醇濃度、乙醇體積和提取時間三個因素的交互作用較小，1次項(xiàng)和2次項(xiàng)對提取的貢獻(xiàn)較大。李維峰等將超聲提取與乙醇-硫酸銨雙水相萃取技術(shù)耦合，在乙醇濃度80%、硫酸銨濃度0.3g/mL、料液比1：40（g/mL）和超聲提取時間50min的工藝條件下，牛大力中總黃酮提取量為5.82mg/g。經(jīng)正交試驗(yàn)可知，影響提取的主次因素是料液比＞乙醇濃度＞硫酸銨濃度＞超聲時間。李榮宇等采用加熱回流提取法，按料液比1：30（g/mL）、溫度100℃、加熱回流提取2次（1.0h/次），測定得到總黃酮得率為0.85%-1.10%。

綜上所述，熱回流法簡便、提取率較高、準(zhǔn)確性好、成本低、穩(wěn)定，可作為牛大力中黃酮類成分的提取方法進(jìn)行推廣運(yùn)用。超聲提取法耗時短，提取工藝簡單，尤其是超聲輔助雙水相體系提取法比超聲輔助單純乙醇溶液提取黃酮的得率明顯要高，具有很高的實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用價值。經(jīng)正交試驗(yàn)和效應(yīng)面試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，料液比、提取溶劑濃度、提取時間、提取溫度均對牛大力中黃酮提取率有一定的影響。

（2）特征性成分。牛大力的特征性成分為芒柄花素和高麗槐素，均屬于黃酮類化合物。勾玲等通過單因素試驗(yàn)考察了熱回流提取牛大力中芒柄花素的工藝條件，最終得到的最佳工藝條件為采用20倍量的90%乙醇，于80℃下加熱回流提取2次（1.5h/次）。王春華等采用超聲提取RP-HPLC法測定牛大力中的高麗槐素，提取條件為甲醇提取溶劑100%、料液比1：20（g/mL）、提取時間80min；色譜條件為Cosmosil5 C18-ms-Ⅱ色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）、乙腈-0.1%醋酸水溶液（43：57）流動相、流速1.0mL/min、檢測波長312nm、進(jìn)樣體積20μL，得到牛大力中高麗槐素含量為0.0029%-0.0075%。陳勇等建立了超聲輔助提取-HPLC法同時測定牛大力中芒柄花素和高麗槐素的方法，提取溶劑選用濃度為50%乙醇溶液，按1：8（g/mL）料液比，提取75min；采用C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），流動相乙腈-0.1%冰醋酸溶液（38：62），檢測波長248nm、310nm，流速1.0mL/min，柱溫35℃，測定得到牛大力中芒柄花素和高麗槐素的含量分別為0.0010-0.0222mg/g和0.0260-0.3428mg/g。彭富全等和陳明等同樣采用超聲提取HPLC法，測定了牛大力中芒柄花素和高麗槐素的含量。馬博凱等采用超聲提取HPLC-MS法同時測定牛大力中高麗槐素和芒柄花素，提取條件、色譜條件和質(zhì)譜條件分別如下：料液比1：100（g/mL）、提取溶劑75%甲醇、超聲時間30min；色譜柱Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（100mm×2.1mm，1.7μm）、流動相甲醇-0.1%甲酸水溶液（梯度洗脫）、流速0.2mL/min、柱溫35℃、進(jìn)樣體積5μL；離子源ESI源、掃描模式負(fù)離子、監(jiān)測模式多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）。

綜上所述，牛大力特征性成分的提取主要采用超聲提取法，不但簡便快速，而且效率較高。牛大力特征性成分的測定主要采用HPLC法和HPLC-MS法，HPLC法快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定，HPLC-MS法則靈敏度更高、分析時間更短、專屬性更強(qiáng)、基質(zhì)效應(yīng)更小。

3.酚類的提取工藝。關(guān)于牛大力中酚類化合物提取的相關(guān)研究較少，僅有少量關(guān)于牛大力中酚酸和總酚提取及含量測定的文獻(xiàn)報道。石敏等采用超聲波輔助提取法，經(jīng)正交試驗(yàn)優(yōu)化提取條件和單因素試驗(yàn)優(yōu)化測定條件，獲得了一種簡單、快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定的牛大力總酚酸提取和含量測定方法。最優(yōu)提取工藝條件為料液比1：60（g/mL）、乙醇濃度50%、超聲功率400W、超聲溫度60℃、超聲時間60min、超聲次數(shù)2次；最優(yōu)含量測定條件為測定波長720nm、福林酚用量1mL、反應(yīng)放置時間0min、碳酸鈉溶液用量1mL、水浴溫度60℃、水浴時間20min。馮夢瑩采用回流法提取牛大力中的總酚，按1：20（W/V）料液比，用95%乙醇回流提取2次，每次3h，再經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到牛大力乙醇提取物后，分別選用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇進(jìn)行萃取，得到相應(yīng)的不同有機(jī)相萃取物。經(jīng)測定，牛大力的乙醇提取物、石油醚相、乙酸乙酯相和正丁醇相中的總酚含量分別為（35.4±1.8）mg/g、（34.0±0.9）mg/g、（118.6±3.2）mg/g、（51.0±2.7）mg/g，乙酸乙酯相中的總酚含量最高。

4.皂苷類的提取工藝。馮夢瑩對牛大力中總皂苷含量進(jìn)行了分析探究，提取方法與上述總酚的提取相同，所得牛大力乙醇提取物中皂苷含量為（142.5±3.3）mg/g，牛大力乙醇提取物的石油醚萃取相中皂苷含量為（415.8±1.6）mg/g，牛大力乙醇提取物的乙酸乙酯萃取相中皂苷含量為（468.2±1.2）mg/g，牛大力乙醇提取物的正丁醇萃取相中皂苷含量為（294.2±4.6）mg/g。此研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過各有機(jī)相萃取后，牛大力乙醇提取物中的活性物質(zhì)均得到了有效富集，乙酸乙酯相對皂苷物質(zhì)的富集效果最佳。

基金項(xiàng)目：廣西高校中青年教師科研基礎(chǔ)能力提升項(xiàng)目（2019KY1403）。

作者簡介：石敏（1988-），女，工程師，碩士研究生，研究方向?yàn)榛钚猿煞痔崛〖胺治鰴z測方法開發(fā)。

*通信作者：黃林華（1985-），男，高級工程師，碩士研究生，研究方向?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)化。