響應面法優(yōu)化地參多糖大孔樹酯脫色工藝及其抗氧化活性研究

李自霖 黃麗金 陳貴元 李雪英

摘要 目的：考察大孔樹酯用量、脫色溫度和脫色時間對地參多糖的脫色率和保留率的影響。方法：在單因素試驗的基礎上，以多糖脫色率和保留率2個指標的綜合評分作為響應值，響應面法優(yōu)化大孔樹酯脫除地參多糖色素的工藝，并探究地參多糖的抗氧化活性。結(jié)果：地參多糖大孔樹酯最佳脫色工藝為質(zhì)量濃度6 mg/mL的地參多糖溶液100 mL，添加充分溶脹的大孔樹酯3 g，脫色溫度45 ℃、脫色3 h、脫色1次。在此條件下，多糖脫色率為82.64%，多糖保留率為72.06%，綜合評分82.15，與理論綜合評分（83.34）的相對誤差為1.43%。當?shù)貐⒍嗵琴|(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時，對ABTS自由基的清除率達到44.28%。結(jié)論：響應面試驗優(yōu)化得到的地參多糖大孔樹酯脫色工藝穩(wěn)定可行，地參多糖具有較好的抗氧化活性，可作為天然抗氧化劑開發(fā)利用。

關(guān)鍵詞 地參多糖；響應面法；脫色工藝； 抗氧化活性

中圖分類號 TS201.1文獻標識碼 A

文章編號 1007-7731（2023）14-0049-07

Optimization of macroporous tree esters decolorization process of Lycopus lucidus

Turcz polysaccharides by response surface method and its antioxidant activity

LI Ziling1? ? HUANG Lijin1? ? CHEN Guiyuan1? ? LI Xueying1， 2*

（1School of Basic Medicine， Dali University， Dali 671000， China;

2College of Agronomy and Biological Sciences， Dali University， Dali 671003， China）

Abstract Objective： Investigate the effects of macroporous resin dosage， decolorization temperature， and decolorization time on the decolorization rate and polysaccharide retention rate of Lycopus lucidus Turcz polysaccharides. Mothod： On the basis of a single factor experiment， the comprehensive scores of decolorization rate and polysaccharide retention rate were used as response values. The response surface methodology was used to optimize the process of removing Lycopus lucidus Turcz polysaccharide pigments with macroporous resin and explore the antioxidant activity of Lycopus lucidus Turcz polysaccharides. Results： The optimal decolorization process for macroporous tree ester of Lycopus lucidus Turcz polysaccharides was as follows： 100 mL of Lycopus lucidus Turcz polysaccharide solution with a mass concentration of 6 mg/mL， 3 g of fully swollen macroporous tree ester added， decolorization temperature 45 ℃， decolorization for 3 hours， and decolorization once. Under these conditions， the decolorization rate of polysaccharides is 82.64%， the retention rate of polysaccharides is 72.06%， and the comprehensive score is 82.15. The relative error with the theoretical comprehensive score （83.34） is 1.43%. When the mass concentration of local Lycopus lucidus Turcz polysaccharides is 0.5 mg/mL， the clearance rate of ABTS free radicals reaches 44.28%. Conclusion： The decolorization process of macroporous tree esters of Lycopus lucidus Turcz polysaccharides optimized by response surface methodology is stable and feasible， and Lycopus lucidus Turcz polysaccharides have good antioxidant activity and can be developed and utilized as natural antioxidants.

Keywords Lycopus lucidus Turcz polysaccharides; response surface method; decolorization technology; antioxidant activity

地參（Lycopus lucidus Turcz）為唇形科地筍屬草本植物，主產(chǎn)于云南西北部的麗江和大理地區(qū)，其地下部分的根莖即為地參，又名地蠶子。地參富含黃酮、多糖、多酚等多種活性成分，是民間藥食同源中草藥[1]?！吨袊幍洹酚涊d，地參具有益氣生津、活血通經(jīng)之功效，常用于治療瘀血腫痛、心煩熱渴等癥[1]。已有研究報道，作為地參的主要活性成分之一的地參多糖具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎癥、免疫調(diào)節(jié)、降血糖等多種活性[2-5]。

目前，地參多糖的提取已有相關(guān)報道[6]，在提取多糖的同時，常會將色素也提取出來混在多糖中[7]，色素物質(zhì)的存在會對多糖的純化、生物活性以及多糖結(jié)構(gòu)分析等方面的研究造成影響[8]，因此對多糖進行脫色處理尤為重要。目前，多糖脫色的主要方法有過氧化氫法[9]、活性炭法[8]和大孔樹酯脫色法[10]。過氧化氫法是通過H2O2的強氧性氧化多糖中的色素，從而起到脫色作用。由于多糖分子中含有醛基、羥基易被H2O2氧化，從而導致多糖結(jié)構(gòu)被破壞，進而影響多糖的活性[9]?；钚蕴糠ê痛罂讟漉シǘ际峭ㄟ^吸附作用去除多糖中的色素?；钚蕴靠讖捷^小，對分子量較大的色素物質(zhì)吸附困難，且脫色耗時長。大孔樹酯吸附作用強，且不會造成多糖結(jié)構(gòu)破壞，再生后可反復使用，是目前多糖脫色最常用的方法之一[9， 10]。為此，本研究采用大孔樹酯脫除地參多糖色素，響應面法優(yōu)化脫色工藝，并探究地參多糖對ABTS自由基的清除作用，旨在為地參多糖的結(jié)構(gòu)分析以及開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

地參干料，購于大理劍川縣藥材批發(fā)市場。FL-1大孔樹酯，購自天津市歐瑞生物科技有限公司；2，2'-聯(lián)氮二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS），購于日本東京化成工業(yè)株式會社；抗壞血酸（VC），購自上海皓鴻生物醫(yī)藥科技有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純（AR）。

1.2 儀器與設備

UV-8000型紫外分光光度儀（上海元析儀器有限公司）；FD-1型冷凍干燥機（北京博醫(yī)康技術(shù)公司）；RE-3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；SHA-C型恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；BT-224S型電子天平（賽多利斯（北京）儀器有限公司）；B600型低速離心機（上海醫(yī)用分析儀器廠）。

1.3 試驗方法

1.3.1 多糖提取? 參照文獻[6]的方法提取地參多糖，多糖提取液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中減壓濃縮至適當體積，Sevage法脫蛋白，終濃度80%（體積分數(shù)）的乙醇沉淀8 h，多糖沉淀物依次用無水乙醇、丙酮、乙醚各洗滌1次，收集沉淀，真空冷凍干燥至恒重，得地參多糖。

1.3.2 FL-1大孔樹酯的預處理? 參照文獻[11]的方法處理大孔樹酯，用超純水沖洗大孔樹酯3次，去棄漂浮的雜質(zhì)，4 000 r/min離心10 min，收集樹酯，95%乙醇浸泡樹酯24 h，使其充分溶脹。4 000 r/min離心10 min收集樹酯，依次用0.1 mol/L的NaOH溶液、0.1 mol/L的HCL溶液各洗滌樹酯1次，超純水洗滌樹酯至pH呈中性后備用。

1.3.3 葡萄糖標準曲線的制作? 參考文獻[12]的方法制作葡萄糖標準曲線，以葡萄糖的質(zhì)量濃度（mg/mL）為X軸，葡萄糖溶液的吸光度（A）為Y軸，繪制標準曲線，得到回歸方程為：Y=0.005 1X+0.024 3，R2=0.998 3，表明在0～0.06 mg/mL的葡萄糖質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

1.3.4 地參多糖脫色率測定? 精密稱取0.6 g地參多糖，超純水定溶至100 mL。多糖溶液經(jīng)紫外分光光度計全波長掃描，發(fā)現(xiàn)在330 nm波長處，地參多糖溶液具有最大吸收峰，故以330 nm作為檢測波長[6]，測定地參多糖溶液脫色前后的吸光度，將檢測到的地參多糖脫色前后的吸光度代入公式（1）計算多糖的脫色率：

式中：D表示多溏脫色率；A1為地參多糖脫色前在330 nm波長處的吸光度；A2為地參多糖脫色后在330 nm波長處的吸光度。

1.3.5 地參多糖保留率的測定? 參照文獻[13]的方法，測定地參多糖溶液脫色前后的吸光度，將脫色前后的吸光度代入葡萄糖標準曲線計算地參多糖質(zhì)量濃度。將地參多糖質(zhì)量濃度代入公式（2）計算多糖保留率：

式中：R表示多糖保留率，%；C1為脫色前地參多糖的質(zhì)量濃度，mg/mL；C2為脫色后地參多糖的質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.3.6 地參多糖脫色效果的評價? 參照文獻[14]的方法，以地參多糖脫色率和多糖保留率2個指標的加權(quán)綜合評分為評價指標，評價地參多糖的脫色效果，設置脫色率（D）和多糖保留率（R）2個指標的權(quán)重值均為50，將多糖脫色率和多糖保留率代入公式（3）計算綜合評分：

式中：M表示脫色率和多糖保留率2個指標的綜合評分，分；D表示地參多糖脫色率，%；Dmax表示地參多糖最大脫色率，%；R表示地參多糖多糖保留率，%；Rmax表示地參多糖最大保留率，%。

1.3.7 地參多糖脫色單因素試驗? 準確稱取0.6 g地參多糖多份，超純水定溶至100 mL，得地參多糖質(zhì)量濃度為6 mg/mL的供試液。在保持其他因素不變的情況下，分別考察充分溶脹的大孔樹酯用量（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g）、地參多糖脫色時間（2、3、4、5、6 h）以及脫色溫度（40、45、50、55、60 ℃）3個因素對地參多糖脫色率和多糖保留率的影響。

1.3.8 響應面試驗? 在單因素試驗結(jié)果的基礎上，以地參多糖脫色率和多糖保留率2個指標的綜合評分（Y）為響應值，對大孔樹酯用量（A）、脫色溫度（B）和脫色時間（C）3個因素，選取3因素3水平，采用響應面法優(yōu)化地參多糖脫色工藝，因素與水平見表1所示。

1.3.9 地參多糖對ABTS自由基的清除作用? 將脫色后的地參多糖配制成5個不同質(zhì)量濃度（0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 mg/mL）的地參多糖溶液備用，以抗壞血酸（Vc）為陽性對照，探究地參多糖的體外抗氧化活性。參照張倩[15]的方法檢測地參多糖對ABTS自由基的清除能力，按照公式（4）計算地參多糖對ABTS自由基的清除率：

式中：R為ABTS自由基的清除率，%；A1為地參多糖試驗組或抗壞血酸（Vc）陽性對照組的吸光度，A2為超純水代替ABTS加入地參多糖溶液或抗壞血酸（Vc）溶液中的本底吸光度；A0為空白組的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個試驗重復3次，取平均值，采用SPSS 21.0和Origin 9.0軟件統(tǒng)計分析試驗數(shù)據(jù)，Design-Expert 13.0軟件進行響應面模擬和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 樹酯用量對脫色率和多糖保留率的影響? 由圖1可知，隨著大孔樹酯用量的增加，多糖脫色率逐漸升高，多糖保留率則逐漸下降。大孔樹酯用量低于3 g，多糖脫色率增加較快；當樹酯用量超過3 g，多糖脫色率上升趨緩，可能是大孔樹酯吸附色素逐漸達到飽和狀態(tài)。與此同時，隨著大孔樹酯用量增加，多糖保留率不斷下降，可能是樹酯用量過大，部分地參多糖被吸附，造成多糖損失，導致多糖保留率下降。在大孔樹酯用量為3 g時，多糖脫色率為66.32%，多糖保留率為58.81%，為避免多糖過多的損失以及保證脫色效率，選取樹酯用量3 g開展后續(xù)單因素試驗。綜合考慮，選擇大孔樹酯用量為2、3、4 g開展響應面試驗。

2.1.2 溫度對脫色率和多糖保留率的影響? 由圖2可知：在40～60 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度升高，多糖脫色率緩慢上升，多糖保留率緩慢下降?？赡苁菧囟鹊纳?，有利于樹酯對色素的吸附，但當脫色溫度超過45 ℃，大孔樹酯對多糖的吸附作用可能增強，導致多糖保留率急劇下降。為避免多糖損失過多，選取脫色溫度45 ℃開展后續(xù)單因素試驗。綜合考慮，選擇脫色溫度40、45、50 ℃開展響應面試驗。

2.1.3 脫色時間對脫色率和多糖保留率的影響? 由圖3可知：隨著脫色時間的增加，多糖脫色率呈先快后慢的趨勢，而多糖保留率則呈快速下降趨勢。原因可能為在脫色時間小于3 h，色素和多糖分子競爭性吸附于大孔樹酯上。脫色時間超過3 h，脫色率上升較慢，可能是大孔樹酯對色素的吸附趨于飽和；隨著時間的延長，大孔樹酯對多糖的吸附性增加，導致多糖保留率降低，造成多糖損失。為避免多糖的損失并兼顧脫色效果，選取脫色時間2、3、4 h開展響應面試驗。

2.2 響應面試驗

2.2.1 響應面試驗結(jié)果與分析? 根據(jù)Design-Expert 13.0軟件設計的試驗方案開展試驗，結(jié)果見表2，方差分析見表3。以多糖脫色率和多糖保留率2個指標的綜合評分（Y）為響應值，樹酯用量（A）、脫色溫度（B）和脫色時間（C）進行回歸擬合，得到回歸方程如下：Y=82.38+3.44A+3.68B+2.15C+0.1587AB-0.8088AC-2.28BC-4.65A2-13.08B2-10.51C2

由表3可知：模型的P值<0.01，表明綜合評分（Y）與3個因素的擬合回歸方程極顯著，提示響應面試驗設計可靠。失擬項的P值為0.068 7>0.050 0，提示響應面回歸方程擬合度較好。表3中，因素A、B、A2、B2、C2均對綜合評分（Y）具有極顯著的影響（P<0.01）；因素C、BC對綜合評分（Y）具有顯著影響（P<0.05），提示改變這些因素的水平，會導致響應值（綜合評分）產(chǎn)生顯著變化?；貧w方程的交互項AB、AC的P>0.05，表明AB、AC交互項對綜合評分的影響不顯著，提示大孔樹酯用量（A）與脫色溫度（B）、大孔樹酯用量（A）與脫色時間（C）2個因素間無交互項作用。交互項BC的P<0.05，提示脫色溫度（B）與脫色時間（C）2個因素間有交互作用。

表3中因素A、B、C的F值分別為29.29、33.46、11.38，提示3個因素對響應值（綜合評分）的影響強弱順序為：脫色溫度（B）>大孔樹酯用量（A）>脫色時間（C）。模型R2=0.986 6，R2Adj=0.969 3，均大于0.9，提示該模型實測值與預測值較為接近，表明該模型能夠較好地模擬真實的試驗過程[16]。

2.2.2 各因素交互作用響應面圖分析? 響應曲面的陡峭程度能夠反映2個因素對響應值的影響程度。響應曲面越陡峭，表示2個因素對響應值的影響越大。反之，則表示2個因素對響應值的影響越小。此外，等高線的形狀能夠反映2個因素之間的交互作用，當?shù)雀呔€形狀趨近橢圓，表示2個因素間的交互作用越顯著。當?shù)雀呔€趨近圓形時，提示2個因素間的交互作用不顯著[17]。

由圖4～5可知，大孔樹酯用量（A）與脫色溫度（B）、大孔樹酯用量（A）與脫色時間（C）2個因素間的響應曲面坡度相對平緩，且等高線也沒有呈現(xiàn)明顯的橢圓形，提示AB、AC間的交互作用不顯著（圖4a、b）。由圖6可知，脫色溫度（B）與脫色時間（C）2個因素間的響應面坡度較陡峭，等高線也趨近于橢圓形，提示脫色溫度（B）與脫色時間（C）間的交互作用顯著。上述響應面交互作用的結(jié)果與方差分析結(jié)果一致。

2.2.3 工藝驗證試驗? 利用Design-Expert 13.0軟件預測，得到地參多糖最佳脫色工藝參數(shù)為：100 mL質(zhì)量濃度為6 mg/mL的地參多糖溶液，大孔樹酯用量為3.37 g、脫色溫度44.90 ℃、脫色時間3.07 h，脫色1次，此時多糖脫色率的預測值為83.71%，多糖保留率預測值為71.32 %，綜合評分預測值為83.34?？紤]實際情況，調(diào)整最佳脫色工藝參數(shù)為：100 mL質(zhì)量濃度為6 mg/mL的地參多糖溶液，大孔樹酯用量3 g、脫色溫度45 ℃、脫色時間3 h，脫色1次。按此工藝條件進行脫色試驗，得到地參多糖脫色率達到82.64%，多糖保留率為72.06%，綜合評分為82.15，與模型綜合評分預測值（83.34）相比，相對誤差為1.43%，表明響應面法優(yōu)化的脫色工藝可靠，可用于地參多糖脫色的實際生產(chǎn)。

2.3 地參多糖對ABTS自由基的清除作用

由圖7可知，地參多糖對ABTS自由基的清除作用與地參多糖的質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。當?shù)貐⒍嗵堑馁|(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時，地參多糖對ABTS自由基的清除率達到試驗濃度的最大值為44.28%，但低于相同濃度的Vc對ABTS的清除率（94.8%）。

自由基可自由穿過細胞膜與細胞內(nèi)的生物分子發(fā)生反應。其機理是自由基會破壞細胞膜，使蛋白質(zhì)變性而喪失功能，最終導致細胞損傷[18]。因此，清除自由基可有效防止細胞損傷，保護細胞膜和延緩衰老[19]。地參多糖對ABTS自由基的清除作用雖然弱于相同濃度的Vc，但仍表現(xiàn)出一定的抗氧化活性。臨床用藥實踐表明，Vc的過度使用會引起胃酸分泌增多、泌尿系統(tǒng)結(jié)石等副作用。由于地參多糖屬于天然產(chǎn)物，具有安全、副作用小的優(yōu)點，因此地參多糖可作為天然抗氧化劑開發(fā)及應用。

3 結(jié)論與討論

大孔樹酯吸附脫色具有操作簡單、脫色效率高、性質(zhì)溫和以及不會破壞多糖的結(jié)構(gòu)等優(yōu)點，是當前多糖脫色較為常用的方法[10]。本研究采用FL-1型大孔樹酯作為脫色劑，脫出地參多糖中的色素，考察大孔樹酯用量、脫色時間及脫色溫度對地參多糖脫色率和保留率的影響?；趩我蛩卦囼灲Y(jié)果，響應面法優(yōu)化地參多糖大孔樹酯脫色工藝，并探究地參多糖體外抗氧化活性。得到大孔樹酯脫除地參多糖色素的最佳工藝參數(shù)：質(zhì)量濃度6 mg/mL的地參多糖溶液100 mL，添加大孔樹酯3 g，脫色溫度45 ℃，脫色時間3h，脫色1次。在此條件下，地參多糖脫色率達到82.64%，多糖保留率為72.06%，綜合評分為82.15，與綜合評分預測值（83.34）相比，相對誤差為1.43%，表明脫色工藝穩(wěn)定可靠。體外抗氧化活性試驗結(jié)果顯示，地參多糖對ABTS自由基表現(xiàn)出較好的清除作用，表明地參多糖具有一定的抗氧化性，可作為天然易得的抗氧化劑開發(fā)利用。

綜上，采用大孔樹酯吸附脫色具有脫色溫度低、脫色時間短、脫色率以及多糖保留率高等優(yōu)點，適合對滇產(chǎn)地參多糖脫色。本研究可為地參多糖分離純化、結(jié)構(gòu)解析以及地參多糖功能性食品的開發(fā)研究提供基礎。

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（責編：張宏民）